Charakterystyczny rozkład czynnika indukowanego hipoksją-1 w hodowanych komórkach kanalików nerkowych z hipoperfuzją symulowaną przez umieszczenie szkiełka nakrywkowego

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrakcyjny

Przewlekłe niedotlenienie kanalików śródmiąższowych odgrywa kluczową rolę w progresji przewlekłejnerkachoroba(PChN). Dlatego ważne jest zbadanie hipoksji kanalikowej i aktywności czynnika indukowanego hipoksją (HIF)-1 w odpowiedzi na hipoksję. Rzadkie naczynia włosowate okołokanalikowe powodują hipoperfuzję w CKD; jednak rzadko badano wpływ hipoperfuzji na HIF. Wywołaliśmy hipoperfuzję spowodowaną założeniem szkiełka nakrywkowego u człowiekanerka-2 komórek i zaobserwowano gradient tlenu pod szkiełkiem nakrywkowym. Immunocytochemia HIF-1 wykazała formację w kształcie pączka na krawędzi obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu, który nazwaliśmy „pierścieniem HIF”. Oszacowano, że ciśnienie tlenu w pierścieniu HIF wynosiło od około 4 mmHg do 20 mmHg. Wynik ten nie był zgodny z wynikami wcześniejszych badań wykazujących akumulację HIF-1 w zakresie beztlenowym przy jednorodnej prężności tlenu. Ponadto zaobserwowaliśmy obecność gradientu pH pod szkiełkiem nakrywkowym, a także przesunięcie pierścienia HIF spowodowane zmianami pH pożywki hodowlanej, co sugeruje, że pierścień HIF został utworzony przez tłumienie związane z HIF-1 do niskiego pH. Badania te wykazały, że aktywacja HIF-1 naśladuje stan fizjologiczny w hodowanych komórkach z hipoperfuzją.

SŁOWA KLUCZOWEhipoperfuzja, hipoksja, czynnik indukowany hipoksją, gradient tlenu, pH

Cistanche herbazapobiega chorobie nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

1|WPROWADZANIE

Częstość występowania przewlekłychnerkachoroba(CKD) rośnie na całym świecie wraz ze starzeniem się społeczeństw (Tonelli i Riella, 2014). Progresja PChN jest nieodwracalna, gdy uszkodzenie nerek osiągnie pewien stopień i ostatecznie prowadzi do schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), niezależnie od choroby podstawowej. Wynik ten wskazuje na istnienie „ostatecznej wspólnej ścieżki”. Według wcześniejszych analiz patologicznych pogorszenie funkcji nerek jest silniej skorelowane z uszkodzeniem cewkowo-śródmiąższowym niż z uszkodzeniem kłębuszków nerkowych. Istnieje kilka doniesień wykazujących, że zwłóknienie nerek wywołuje przewlekłe niedotlenienie kanalików śródmiąższowych, które to niedotlenienie kanalikowo-śródmiąższowe pogarsza CKD i prowadzi do ESRD. Dowody te wskazują, że niedotlenienie cewkowo-śródmiąższowe odgrywa rolę w końcowej wspólnej ścieżce PChN (Mimura i Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Thenerkajest bardzo podatna na hipoksję ze względu na duże zapotrzebowanie na tlen oraz istnienie przecieku tlenowego między tętnicami i żyłami wewnątrznerkowymi (Nangaku, 2006; Welch i wsp., 2001; Zhang i wsp., 2014). Dlatego uważamy, że istotne jest zbadanie hipoksji i odpowiedzi na hipoksję w kanaliku śródmiąższowym nerki.

Pierwotna odpowiedź biologiczna na niedotlenienie w żywych organizmach zachodzi poprzez szlak czynnika indukowanego niedotlenieniem (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza i Wang, 1992; Zhou i wsp., 2003). HIF składa się z podjednostek - i -. Chociaż podjednostka - jest konstytutywnie aktywna, podjednostka - ulega degradacji w obecności tlenu. W warunkach normoksycznych HIF- jest hydroksylowany przez domenę hydroksylazy prolilowej (Ph.D.), dzięki czemu jest rozpoznawany przez supresor guza von Hippel-Lindau (VHL). To rozpoznanie skutkuje ubikwitynacją i degradacją hydroksylowanego HIF- w proteasomie. W warunkach niedotlenienia HIF- gromadzi się w cytozolu, ponieważ niehydroksylowany HIF- unika degradacji. Nagromadzony HIF- jest translokowany z cytozolu do jądra, gdzie ulega dimeryzacji z HIF- i działa jako czynnik transkrypcyjny, promując ekspresję genów w dół. Spośród trzech zidentyfikowanych izoform podjednostek HIF — HIF-1 , HIF-2 i HIF-3 — wiadomo, że komórki nabłonka kanalików nerkowych wyrażają HIF-1 (Tanaka i in. ., 2016). Wcześniejsze badania wykazały przejściową lub regionalną akumulację HIF wnerkaz CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), a ten HIF jest aktywowany w warunkach obniżonej prężności tlenu w środowisku PChN. Nieprzystosowanie do hipoksji w PChN może być spowodowane obecnością czynników hamujących szlaki HIF (Asai i wsp., 2016; Tanaka i wsp., 2013; Thangarajah i wsp., 2009). Ochronny wpływ aktywacji HIF opisano w kilku modelach zwierzęcych, w tym szczurach z cukrzycą indukowaną streptozotocyną i szczurach z 5/6 nefrektomią (Deng i wsp., 2010; Nordquist i wsp., 2015). doktorat Inhibitory zwróciły ostatnio uwagę jako nowe podejścia terapeutyczne do anemii nerek u pacjentów z CKD (Akizawa i wsp., 2019; Chen i wsp., 2017, 2019; Coyne i wsp., 2017; Miyata i wsp., 2011; Pergola i wsp., 2017, 2019; ., 2016; Provenzano i in., 2016). Jednak szczegóły dotyczące progresji hipoksji nerkowej i sposobu, w jaki dochodzi do akumulacji HIF wnerkaz PChN pozostają niejasne. Zależna od tlenu hydroksylacja HIF- zachodzi w cytozolu, dlatego ważne jest, aby zmierzyć wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe ciśnienie tlenu. Istnieje kilka metod pomiaru prężności tlenu, w tym użycie mikroelektrod lub obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego zależnego od poziomu tlenu we krwi (BOLD-MRI). Wykorzystaliśmy mikroskopię obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) do ilościowego pomiaru wewnątrzkomórkowego stanu tlenu (Hirakawa i in., 2017; Yoshihara i in., 2015). BTPDM1 jest barwnikiem fosforyzującym opartym na kompleksie irydu (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoesan-pirydyna, aac=acetyloaceton) z kationową grupą dimetyloaminową, która jest biernie dystrybuowane w lizosomach wewnątrzkomórkowych. Został zsyntetyzowany jako sonda fosforenowa do pomiaru wewnątrzkomórkowego ciśnienia tlenu (Yoshihara i in., 2015). PLIM z BTPDM1 umożliwił akwizycję obrazów o wysokiej rozdzielczości ciśnienia parcjalnego tlenu w komórkach kanalików nerkowych na powierzchni nerek zdrowych myszy, dostarczając danych wskazujących na obecność gradientu tlenu, nawet w zdrowych nerkach (Hirakawa i wsp., 2018 ).

W żywych narządach występują gradienty tlenu, w tymnerki, nawet w normalnych warunkach (Hirakawa i wsp., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov i wsp., 2015), a zatem takich gradientów można się spodziewać również w PChN. Hipoperfuzja jest spowodowana rozrzedzeniem mikronaczyń w PChN, w którym postępujące uszkodzenie kłębuszków skutkuje zmniejszeniem przepływu krwi w naczyniach włosowatych okołokanalikowych, nasilając zwłóknienie śródmiąższowe. Zwłóknienie śródmiąższowe upośledza dyfuzję i dostarczanie tlenu do komórek kanalików i prowadzi do rozrzedzenia mikronaczyń, dodatkowo pogarszając niedotlenienie kanalikowo-śródmiąższowe (Mimura i Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Biologiczne skutki hipoperfuzji pozostają jednak niejasne, ponieważ większość badań dotyczyła wpływu hipoksji i HIF-1 na hodowane komórki w warunkach jednorodnej perfuzji i prężności tlenu (Rexius-Hall et al., 2017). Wcześniejsze badania wykazały, że hodowane komórki jednowarstwowe przykryte szkiełkiem nakrywkowym zapewniają dobry model hipoperfuzji indukowanej przez barierę dyfuzyjną w pożywce hodowlanej. Modelowana hipoperfuzja jest związana z gradientem tlenu, ponieważ szkiełko nakrywkowe zapobiega dyfuzji tlenu z górnej części podłoża do komórek (Pitts i Toombs, 2004; Takahashi i Sato, 2010; Yoshihara i in., 2015). W pojedynczej warstwie hodowanych komórek przykrytej szkiełkiem nakrywkowym wewnątrzkomórkowe ciśnienie tlenu spada wraz z odległością od krawędzi szkiełka nakrywkowego z powodu ograniczonej dyfuzji tlenu do hodowanych komórek. W rezultacie powstaje gradient tlenu od krawędzi do środka szkiełka nakrywkowego, a wewnątrzkomórkowe napięcie tlenu może spaść do zakresu beztlenowego w środku szkiełka nakrywkowego (Takahashi i Sato, 2010; Yoshihara i in., 2015). . W obecnym badaniu skupiliśmy się na aktywacji HIF i zbadaliśmy, czy występuje niezależna od tlenu zmiana ekspresji HIF w obecności hipoperfuzji z gradientem tlenu. Ponieważ hipoperfuzja z gradientem tlenu występuje w kanalikach nerkowych in vivo, obserwacja niezależnego od tlenu wpływu na ekspresję HIF w modelu szkiełek nakrywkowych może dostarczyć wglądu w mechanizm leżący u podstaw niewydolności akumulacji HIF w CKD.

ekstrakt z cistanchena nerkę

2|MATERIAŁY I METODY

2.1|Hodowlę komórkową

Hodowane komórki inkubowano w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2. Inkubację w warunkach hipoksji przeprowadzono w osobistym inkubatorze CO2/wielogazowym APM-30D (Astec). Niedotlenienie wywołano za pomocą worka do anoksji, AnaeroPack i zestawów do hodowli beztlenowych #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Komórki HK-2 (Homo sapiens, humannerka, samiec, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), unieśmiertelnioną linię komórek nabłonka kanalika proksymalnego z normalnej nerki dorosłego człowieka, hodowano w mieszaninie pożywki/składników odżywczych firmy Dulbecco F{{2} } Szynka (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) i roztwór penicyliny-streptomycyny (15070063, Thermo Fisher Scientific) na 10 cm szalce hodowlanej. Do pasażu komórki HK-2 zdysocjowano za pomocą trypsyny (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i odwirowano przy 300 g przez 5 min.

Komórki raka szyjki macicy HeLa i ludzki embrionalnynerkakomórki 293 (HEK293) hodowano w DMEM z niską (1000 mg/l) glukozą (D6046, Sigma Aldrich) zawierającą 5% FBS w 10 cm szalce do hodowli. Komórki te pasażowano jako komórki HK-2.

Komórki nabłonka kanalika proksymalnego nerki (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) utrzymywano przy użyciu zestawów RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Do pasażu komórki RPTEC zdysocjowano przy użyciu trypsyny, zobojętniono roztworem zobojętniającym trypsynę (CC-5002, Lonza Ltd.) i odwirowano przy 200 g przez 5 minut.

2.2|Ustalenie modelu hipoperfuzji przez założenie szkiełek nakrywkowych

Okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm (C015001, Matsunami) czyszczono ultradźwiękami i przed użyciem przechowywano w 99,5% etanolu. Zastosowano dwie metody, oparte na obserwacji komórek poza szkiełkiem nakrywkowym.

Hodowane komórki jednowarstwowe umieszczono pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a dnem szalki (ryc. S1a, b) lub metodą alternatywną (ryc. S1c), jak opisano poniżej. Wybrano metodę tradycyjną lub alternatywną, aby stworzyć nasz model szkiełek nakrywkowych do obrazowania na żywo, czy to obrazowania tlenowego, czy obrazowania PH. W przypadku immunocytochemii (ICC) wybrano metodę alternatywną, ponieważ przy użyciu metody tradycyjnej większość komórek często odrywała się od dna szalki podczas zdejmowania szkiełka nakrywkowego w celu utrwalenia komórek (ryc. S2a).

2.2.1|Metoda tradycyjna

Dnia 1 komórki umieszczono na dnie 27 mm szklanej szalki (3910-035, Iwaki) przy konfluencji 100 procent * (około 5,0 x 105/szalkę). Hodowano je przez noc w DMEM/F12 zawierającym 10% FBS bez roztworu antybiotyku. Dnia 2 na hodowane komórki umieszczono szkiełko nakrywkowe na wskazany okres (Figura S1b).

2.2.2|Alternatywna metoda

Komórki wysiano na szkiełku nakrywkowym w 35 mm szalce do hodowli przy 100 procentowej konfluencji (około 5,0 x 105/szalkę) w dniu.

1. Hodowano je przez noc w DMEM/F12 zawierającym 10% FBS bez roztworu antybiotyku. Dnia 2 szkiełko nakrywkowe odwrócono, aby przymocować powierzchnię komórek do dna nowej 27 mm szklanej szalki na określony czas (Figura S1c).

Stworzyliśmy również model szkiełek nakrywkowych wykorzystując okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 10 mm (CS01005, Matsunami) (Rysunek S2b).

2.3|Obrazowanie tlenu na żywo za pomocą BTPDM1

Hodowane komórki przygotowano w dniu 1, jak opisano powyżej. Dnia 2 komórki przepłukano dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) i inkubowano z 500 nM BTPDM1, kationowym barwnikiem lipofilowym na bazie irydu, stosowanym jako wewnątrzkomórkowa sonda fosforyzująca (Yoshihara et al., 2015), w DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej (21041-025, Thermo Fisher Scientific) przez 30 min. Po dwukrotnym przemyciu komórek HBSS umieszczono je pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a dnem naczynia, jak opisano powyżej. Intensywność fosforescencji z BTPDM1 w hodowanych komórkach przykrytych szkiełkiem nakrywkowym obserwowano przy użyciu filtra wzbudzenia i emisji, a fosforescencję BTPDM1 (Hirakawa i wsp., 2015) wykrywano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego BZ-X710 (Keyence Corporation). Obrazy uzyskane z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego dostosowano do jasności i kontrastu przy użyciu oprogramowania do analizy BZ-X.

2.4|Immunocytochemia

Komórki na szkiełku nakrywkowym hodowano z 200 µM chlorowodorkiem pimonidazolu (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) w DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej przez 1 godzinę, po czym szkiełko nakrywkowe odwrócono i przyczepiono do naczynia ze szkła nakrywkowego, jak opisane wcześniej. Komórki następnie hodowano w DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej przez określony czas. Gdy nie stosowano barwienia kontrastowego pimonidazolem, pomijano wstępne leczenie pimonidazolem.

Po zakończeniu okresu hodowli, każde szkiełko nakrywkowe zebrano, a komórki natychmiast utrwalono metanolem/acetonem (1:1) na lodzie, gdzie pozostawały przez 30 min. Po dwukrotnym przemyciu roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), błonę komórkową permeabilizowano przez 30 min, inkubowano z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) przez 30 min, a następnie z blokiem białkowym bez surowicy (X0909, DAKO) przez 10 min. Komórki wybarwiono pierwszym przeciwciałem, a następnie drugim przeciwciałem fluorescencyjnym. Listę pierwszych przeciwciał podano w Tabeli S1. Jeżeli gospodarzem był królik, jako pierwsze przeciwciało zastosowano świńską poliklonalną antykróliczą immunoglobulinę FITC (F0205, rozcieńczenie 1:20, DAKO). Fluorescencyjne przeciwciało Alexa Fluor 594 streptawidyna (S11227, rozcieńczenie 1:500, Thermo Fisher Scientific) zostało użyte jako pierwsze przeciwciało, jeśli gospodarzem była mysz, a następnie biotynylowane anty-mysie IgG (H plus L) (BA{{23} }, rozcieńczenie 1:1000, Vector Laboratories), jako drugie przeciwciało. Barwienie jądrowe przeprowadzono przy użyciu trichlorowodorku bisbenzymidu H 33342 (B2261, Sigma Aldrich) dla każdej próbki.

Sygnały fluorescencyjne obserwowano przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego BZ-X710 (Keyence Corporation) z następującymi filtrami: Texas Red o długości fali wzbudzenia (Ex) 560/40 nm, długości fali emisji (Em) 630/75 nm, GFP ( Np.: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) i DAPI (np.: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Obrazy dostosowano pod kątem jasności i kontrastu za pomocą oprogramowania do analizy BZ-X.

2.5|ICC HIF komórek HK-2 traktowanych chlorkiem kobaltu

Alternatywną metodę zmodyfikowano w celu uzyskania modelu szkiełek nakrywkowych komórek HK-2 poddanych działaniu chlorku kobaltu. Komórki HK-2 wysiano w gęstości półzlewnej (2,5 × 105/płytkę) na szkiełku nakrywkowym w dniu 1 i potraktowano 300 µM heksahydratu chlorku kobaltu (C 8661, Sigma Aldrich) przez 16 godzin Dzień 2. W dniu 3 szkiełko nakrywkowe odwrócono, aby przymocować powierzchnie komórek do dna nowej 27 mm szklanej szalki na 3 godziny i przeprowadzono ICC HIF.

2.6|Western blotting

Aby zbadać akumulację HIF{{0}} przy różnych ciśnieniach tlenu i przy różnych poziomach pH, ​​1.0 × 106 komórek HK-2 na 10 cm szalkę hodowlaną inkubowano w warunkach normoksji, 2% tlenu, 1% tlenu lub anoksji przez 5 godzin lub w DMEM/F12 przy pH 7,4, pH 6,0 lub pH 5,0 przez 5 godzin.

Komórki te poddano lizie w buforze RIPA zawierającym 50 mM Tris-bufor (pH 8,0), 150 mM NaCl, 00,5 procent wag./obj. sodu deoksycholan, 0,1 procent wag./obj. SDS i 1,0 procent wag./obj. NP40.

Do analizy Western blotting bufor do próbek SDS zawierający {{0}},35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 procent SDS, 36 procent gliceryny, 0,012 procent błękitu bromofenolowego i 0,1 M ditiotreitolu (DTT) dodano do białek. Białka zawierające bufor do próbek SDS eluowano przez gotowanie w 95 stopniach przez 5 min.

Białka rozdzielono przez elektroforezę na 10procentowym żelu poliakrylamidowym SDS. Białka przeniesiono następnie na membranę AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) w buforze do przenoszenia (48 mM bufor Tris-base, 39 mM glicyna, 0,04 procent SDS i 20 % obj./obj. metanol) przy użyciu Trans-Blot® System transferu TurboTM (Bio-Rad). Błony inkubowano w temperaturze pokojowej z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeciwciałami anty-HIF1 (NB100-134, rozcieńczenie 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) i przeciwciałami antyaktynowymi (A2066 , rozcieńczenie 1:2000, Sigma Aldrich, RRID:AB_476693), a następnie w przeciwciele drugorzędowym poliklonalna kozia antykrólicza immunoglobulina/HRP (P0448, rozcieńczenie 1:10000, DAKO, RRID:AB{26 }}). Do wykrywania użyto PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific). Chemiluminescencję obserwowano przy użyciu analizatora Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Odtwarzalność potwierdzono wykonując co najmniej trzy niezależne eksperymenty. Intensywność prążków określono ilościowo za pomocą oprogramowania National Institutes of Health ImageJ (Schneider i in., 2012).

2.7|Test reportera lucyferazy

Przeprowadzono test reporterowy lucyferazy, aby zmierzyć akumulację HIF1 w inkubacji hodowli homogennej hipoksji. Wcześniej skonstruowaliśmy znakowany gen lucyferazy sterowany przez element reagujący na hipoksję (HRE) i opracowaliśmy wektor reporterowy reagujący na hipoksję (konstrukcja transgeniczna). Skonstruowano go z tandemowych kopii HRE z genu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego szczura subklonowanego w regionie 5' jednostki transkrypcyjnej am-promotor CMV-lucyferaza (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

Komórki HK{{0}} w stężeniu 1,0 × 105 na studzienkę przygotowano w 12-płytkach do hodowli studzienek (150628, Thermo Fisher Scientific). Komórki kotransfekowano 500 ng wektorów pGL3-podstawowych HRE-lucyferazy i 30 ng wektorów kontrolnych lucyferazy pRL-SV40 Renilla (Promega), stosując 2 µl odczynnika do transfekcji FuGENE® HD (E2311, Promega) na dobrze. Komórki HK-2 kotransfekowane 500 ng wektorów lucyferazy pGL3-podstawowych i 30 ng wektorów kontrolnych lucyferazy pRL-SV40 Renilla (Promega) zastosowano jako kontrolę negatywną.

Transfekowane komórki inkubowano w warunkach normoksji, 2% niedotlenienia, 1% niedotlenienia lub worka anoksyjnego przez 5 godzin. Komórki następnie zebrano przy użyciu 100 ?l buforu do lizy białek pasywnych, do testu z podwójną lucyferazą. Do pomiarów użyto luminometru LB9507 (EG i Berthold). Aby skorygować wydajność transfekcji, względną wartość jednostki światła lucyferazy świetlika podzielono przez wartość lucyferazy Renilla.

cistanche dla ed

2,8|Analiza apoptozy

Hodowane komórki przykryto szkiełkiem nakrywkowym na 0 min, 15 min, 30 min, 1 godz., 3 godz., 6 godz. i 24 godz., a następnie zebrano przy użyciu trypsyny. Komórki traktowane 3% nadtlenkiem wodoru (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) przez 30 min przygotowano jako kontrolę apoptotyczną. Analizę ilościową apoptozy przeprowadzono przy użyciu zestawu Muse Annexin V i Dead Cell Kit (MCH100105, Millipore) w analizatorze Muse™ Cell Analyzer (Millipore), zgodnie z instrukcjami producenta.

2.9|Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Ekstrakcję całkowitego RNA i syntezę cDNA przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta odpowiednio dla RNAiso Plus (9109, Takara) i PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). Real-time PCR przeprowadzono przy użyciu THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) w systemie CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Poziomy transkrypcji znormalizowano do poziomu ekspresji mRNA β-aktyny. qRT-PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach przy użyciu starterów specyficznych dla genu. HIF-1 amplifikowano przy użyciu starterów do przodu, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ i odwrotnych, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -aktynę amplifikowano przy użyciu starterów do przodu, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ i odwrotnych 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′.

2.10|Transfekcja siRNA

W celu zbadania indukowanego przez RNAi knockdown HIF-1 w komórkach HK-2, w sześciostudzienkowych płytkach przygotowano 50 × 104 HK-2 komórek na studzienkę. Dwa rodzaje RNAi — HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] i siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) — zostały użyte z Lipofectamine RNAiMAX Odczynnik do transfekcji (Thermo Fisher Scientific). Jako kontrolę negatywną zastosowano Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Zmieszano 1,5 µl każdego siRNA i 5 µl RNAiMAX. Komórki transfekowane siRNA inkubowano w warunkach normoksycznych lub hipoksji (1 procent O2) przez 48 godzin i ekstrahowano RNA. Skuteczność knockdown-HIF-1 zbadano za pomocą qRT-PCR.

2.11|Obrazowanie na żywo efektów gradientu PH

Zwizualizowaliśmy wewnątrzkomórkowy gradient pH żywych komórek pod szkiełkiem nakrywkowym. Komórki traktowano wewnątrzkomórkowym wskaźnikiem pH pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) zgodnie z instrukcjami producenta, przed wprowadzeniem modelu szkiełka nakrywkowego. Do obserwacji przejścia w czasie gradientu intensywności fluorescencji pod szkiełkiem nakrywkowym zastosowano odwrócony mikroskop fluorescencyjny BZ-X710 (Keyence Corporation) z filtrem GFP.

2.12|Analiza ilościowa pierścienia HIF

2.12.1|Miejsce powstania pierścienia HIF

Zmierzyliśmy odległość pierścieni HIF i obszarów dodatnich pod względem pimonidazolu od krawędzi szkiełka nakrywkowego za pomocą ImageJ w następujący sposób. Określono pola zewnętrznego i wewnętrznego okręgu pierścienia HIF i okręgu dodatniego dla pimonidazolu i obliczono promień każdego okręgu. Każdą wartość odjęto od 7,5 mm, który jest promieniem szkiełka nakrywkowego 15 mm, aby obliczyć jego odległość od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty ICC z HIF w każdych warunkach.

2.12.2|Definicja pierścienia HIF

Wykorzystaliśmy obrazy fluorescencyjne uzyskane z modelu szkiełek nakrywkowych inkubowanych w normoksji i neutralnym pH. Zdefiniowaliśmy położenie pierścienia HIF oraz jego zewnętrzną i wewnętrzną stronę w skali 2,5–3,0 (0,22–0,45 mm), 00,5 Skala –1.0 (1,12–1,35 mm) i odpowiednio 5.0–5,5 (2,24–2,47 mm) od krawędzi szkiełka nakrywkowego, przy użyciu ImageJ. Zmierzyliśmy pięć lokalizacji sygnałów HIF-1 na próbkę i obliczyliśmy średnią. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty ICC z HIF.

sproszkowany ekstrakt z cistanche

2.13|Pomiar ciśnienia tlenu za pomocą obrazu PLIM

2.13.1|Budowa linii kalibracyjnej do pomiaru ciśnienia tlenu

Sporządzono krzywą kalibracji komórek HK-2 w oparciu o metodę opisaną w naszym poprzednim raporcie (Yoshihara et al., 2015). Komórki HK-2 obciążone 500 nM BTPDM1 przez 30 min hodowano w wielogazowym inkubatorze ze zmiennym stężeniem tlenu, wyposażonym w odwrócony mikroskop fluorescencyjny, który był podłączony do systemu pomiaru czasu życia. Linia kalibracyjna oparta na analizach Sterna-Volmera została skonstruowana z wykorzystaniem czasu życia fosforescencji (PL) komórek HK-2 w kilku różnych prężnościach tlenu przy użyciu

Równanie (1)

gdzie τp reprezentuje PL w pO2, τ0 reprezentuje PL w odtlenieniu, kq reprezentuje stałą szybkości hartowania, a pO2 reprezentuje ciśnienie cząstkowe tlenu. Używając tej linii kalibracyjnej, ciśnienie tlenu można obliczyć z PL.

2.13.2|Obraz PLIM modelu szkiełka nakrywkowego

Przygotowano komórki HK-2 obciążone 500 nM BTPDM1 przez 30 min. Skonstruowano model szkiełka nakrywkowego i hodowano go w inkubatorze wielogazowym o zmiennym stężeniu O2, wyposażonym w odwrócony mikroskop fluorescencyjny, połączony z systemem pomiaru czasu życia.

Obrazy mikroskopii obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) rejestrowano przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w konfokalny system skanowania (Hirakawa i in., 2018). Obrazy PLIM uzyskano po 30 min inkubacji w 21% O2 lub 4% O2. Wykonano cztery obrazy PLIM na próbkę, z górnego, dolnego, lewego i prawego regionu w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego, w celu określenia średniego PL, biorąc pod uwagę zmienność PL w szkiełku nakrywkowym.

2.13.3|Identyfikacja pierścienia HIF na obrazie PLIM

Pimonidazol był dodatni poniżej 10 mmHg ciśnienia tlenu. Odpowiednik PL ciśnienia tlenu 10 mmHg wynosił 4034,6 ns, zgodnie z linią kalibracyjną, więc można było zidentyfikować zewnętrzną linię koła pimonidazolu na obrazie PLIM. Następnie miejsca zewnętrznych i wewnętrznych pierścieni HIF na obrazie PLIM można było znaleźć za pomocą analizy ilościowej odległości. Zmierzyliśmy zakres średnich PLs równoważnych pierścieniowi HIF w 21 procentach O2 i 4 procentach O2.

2.13.4|Pomiar ciśnienia tlenu pierścienia HIF

Obliczyliśmy zakres ciśnień tlenu pierścienia HIF z PL, korzystając z linii kalibracyjnej. Obrazy PLIM analizowano przy użyciu SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Analiza statystyczna

Do porównania grup eksperymentalnych i kontrolnych zastosowano test Dunnetta, a wartości < 0,05="" uznano="" za="" wskazujące="" na="" różnice="" istotne="" statystycznie.="" do="" porównania="" trzech="" lub="" więcej="" grup="" zastosowano="" test="" t-studenta="" i="" zastosowano="" skorygowaną="" wartość="" p="" bonferroniego.="" wszystkie="" analizy="" statystyczne="" przeprowadzono="" przy="" użyciu="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" założono,="" że="" wartości="" pochodzą="" z="" populacji="" o="" rozkładzie="" normalnym="" i="" są="" przedstawione="" jako="" średnia="" ±="" odchylenie="" standardowe="">

co to jest cistanche?

3|WYNIKI

3.1|Tworzenie gradientu tlenu w modelu hipoperfuzji

Potwierdziliśmy istnienie gradientu tlenu w modelu hipoperfuzji wywołanego założeniem szkiełka nakrywkowego poprzez bezpośrednią ocenę prężności tlenu przy użyciu fosforescencji. Pomiar intensywności fosforescencji może przewidzieć przybliżony trend w ciśnieniu tlenu (Hirakawa i in., 2015; Yoshihara i in., 2015). Zaobserwowaliśmy intensywność fosforescencji modelu szkiełek nakrywkowych komórek HK-2 traktowanych BTPDM1. Obrazy intensywności fosforescencji wykazały niedotlenienie w większości obszaru wewnątrz szkiełka nakrywkowego, ale brak niedotlenienia przy krawędzi, obserwacja sugerująca istnienie gradientu tlenu wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego w komórkach HK-2 pokrytych szkiełko nakrywkowe (rysunek 1a). Ponieważ intensywność fosforescencji zależy od stężenia sondy i czasu wzbudzenia, pomiar czasu życia fosforescencji (PL) jest przydatny do ilościowej analizy ciśnienia tlenu (Yoshihara et al., 2015). Zatem do ilościowego pomiaru prężności tlenu hodowanych komórek wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego uzyskaliśmy obrazy PLIM komórek HK-2 przykrytych szkiełkiem nakrywkowym przez 30 min (Figura 1b). PL wydłużony wraz ze wzrostem odległości od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Potwierdziliśmy, że ciśnienie tlenu, obliczone za pomocą linii kalibracyjnej (rysunek S3), zmniejszało się wraz ze wzrostem odległości od krawędzi szkiełka nakrywkowego, co stanowi dowód na istnienie gradientu tlenu wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego (rysunek 1c). Badanie profilu czasowego intensywności fosforescencji wykazało, że gradient tlenu zaczął tworzyć się 10 min po założeniu szkiełka nakrywkowego

(Rysunek 1d).

3.2|Unikalny rozkład HIF-1 w modelu hipoperfuzji „pierścień HIF”

Zbadaliśmy rozkład HIF-1 w modelu hipoperfuzji z gradientem tlenu. ICC HIF-1 w komórkach HK-2 wykazywał wzmocnienie w kształcie pączka na krawędzi obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu, który nazwaliśmy „pierścieniem HIF” (Rysunek 2a). Intensywność sygnału HIF-1 była znacznie wyższa na pierścieniu HIF niż w jego obszarach wewnętrznych lub zewnętrznych (rysunek 2b). Zjawisko to zostało potwierdzone przy użyciu ICC z innym przeciwciałem HIF-1 (Figura S4a) lub innymi kanalikowymi liniami komórkowymi (Figura S4b,c). Przeprowadziliśmy również analizę ICC HIF-1 w innych rodzajach hodowanych komórek, takich jak komórki raka szyjki macicy HeLa. Chociaż słaba adhezja tych komórek do szkiełka nakrywkowego utrudniała szczegółową ocenę dystrybucji HIF-1, zaobserwowaliśmy wzmocnienie HIF-1 w kształcie pączka w komórkach HeLa (Rysunek S4d).

Pierścień HIF i obszar dodatni pod względem pimonidazolu zaczęły tworzyć się kilka godzin po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego, a po 3 godzinach pierścień HIF wydawał się statyczny (ryc. 2c). Powalenie HIF-1 spowodowało zniknięcie sygnału HIF-1, w tym pierścienia HIF (Figura 2d, Figura S4e), wskazując, że pierścień HIF był zależny od HIF-1.

Aby zbadać możliwość, że tworzenie pierścienia HIF jest zależne od tlenu, zbadaliśmy rozkład HIF-1 w modelu szkiełka nakrywkowego podczas inkubacji z różnymi napięciami tlenu. Natychmiast po wykonaniu modelu szkiełka nakrywkowego umieściliśmy szalkę w komorach hipoksyjnych z różnymi napięciami tlenu. Podczas inkubacji w warunkach hipoksji zaobserwowaliśmy, że zarówno pierścień HIF, jak i obszar dodatni pod względem pimonidazolu wydawały się rozszerzać na zewnątrz (ryc. 3a). Zmierzyliśmy odległość każdego pierścienia HIF i obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu od krawędzi szkiełka nakrywkowego w warunkach normoksji, inkubacji 4% O2 i 1% O2. Zarówno pierścień HIF, jak i obszar dodatni pod względem pimonidazolu rozszerzały się na zewnątrz wraz ze spadkiem ciśnienia otaczającego tlenu (ryc. 3b). Wyniki te wskazują, że pierścień HIF był zależny od HIF-1 i prężności tlenu.

Aby potwierdzić, że akumulacja w kształcie pączka jest specyficznym zjawiskiem HIF, przeprowadziliśmy ICC z genami porządkowymi w modelu szkiełka nakrywkowego. Sygnały GAPDH i aktyny utrzymywały się na całym obszarze szkiełka nakrywkowego i były porównywalne między obszarem pierścienia HIF a innymi obszarami (Figura S5a,b).

3.3|Pomiar zakresu ciśnienia tlenu pierścienia HIF

Potwierdziliśmy pierścieniowe zwiększenie akumulacji HIF-1 w hodowanych komórkach przykrytych szkiełkiem nakrywkowym, zjawisko zależne od prężności tlenu. Aby określić zakres zaangażowanych prężności tlenu, przeanalizowaliśmy ciśnienie tlenu w pierścieniu HIF przy użyciu techniki czasu życia fosforescencji. Otrzymaliśmy obrazy PLIM modelu szkiełka nakrywkowego po 30 min inkubacji w 21 procentach O2 lub 4% O2 (rysunek 4a). Pierścień HIF utworzył się na krawędzi kręgu pimonidazolu w ICC HIF (ryc. 3b). Zidentyfikowaliśmy miejsce na obrazie PLIM, które było równoważne obszarowi dodatniemu pod względem pimonidazolu w ICC HIF, a następnie zidentyfikowaliśmy miejsce odpowiadające pierścieniowi HIF (ryc. 4b), stosując analizę ilościową danych odległości od pierścienia HIF i Obszar dodatni pod względem pimonidazolu (ryc. 3b). Zmierzyliśmy również zakres PLs pierścienia HIF, a następnie użyliśmy linii kalibracyjnej (Rysunek S3) do obliczenia ciśnienia tlenu pierścienia HIF w 21 procentach O2 (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg) i 4 procent O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Rysunek 4c).

3.4|Akumulacja HIF-1 przy jednorodnym napięciu tlenu

Podczas gdy słabe sygnały HIF-1 poza pierścieniem HIF w modelu szkiełek nakrywkowych można przypisać niewystarczającemu niedotlenieniu, te wewnątrz pierścienia, gdzie HIF-1 powinien być silniej aktywowany przez niższe ciśnienie tlenu, muszą być kontrolowane przez zjawisko niezależne od tlenu. W celu zbadania zjawisk powodujących brak maksymalnej akumulacji HIF-1 w obszarze beztlenowym występujące tylko w modelu hipoperfuzji, zbadaliśmy, czy istnieje odwrotna zależność między prężnością tlenu a akumulacją HIF-1 podczas inkubacji z jednorodnym ciśnieniem tlenu. Analiza Western blot lizatów komórkowych przy różnych jednorodnych prężnościach tlenu wykazała wzrost akumulacji HIF-1 podczas inkubacji beztlenowej (Figura 5a). Test reporterowy HRE-lucyferaza wskazał również, że akumulacja HIF-1 była zwiększona wraz z niższym prężnością tlenu w warunkach jednorodnej prężności tlenu (Figura 5b). Wyniki te wskazują, że akumulacja HIF-1 była zależna od ciśnienia tlenu, z maksymalną akumulacją obserwowaną w zakresie beztlenowym. Charakterystyka HIF-1 powinna różnić się między modelem hipoperfuzji a modelem z jednorodną prężnością tlenu. Spekulowaliśmy, że unikalne zjawisko akumulacji HIF-1 w tym modelu hipoperfuzji może być zdeterminowane innym czynnikiem niż prężność tlenu.

3.5|Tworzenie pierścienia HIF było niezależne od PhD

Zbadaliśmy, czy degradacja HIF-1, możliwy mechanizm tworzenia pierścienia HIF, była podwyższona wewnątrz pierścienia HIF. Ten pomysł wydawał się nieważny, ponieważ hydroksylacja przez doktora, proces ograniczający szybkość degradacji HIF, wymaga tlenu jako substratu. Chlorek kobaltu jest szeroko stosowany jako chemiczny stabilizator HIF. Skonstruowaliśmy model szkiełek nakrywkowych komórek HK-2 traktowanych chlorkiem kobaltu i przeprowadziliśmy analizę ICC HIF. Sygnał HIF-1 nie wzrósł wewnątrz pierścienia HIF, co stało się niejasne z powodu zwiększonego sygnału HIF-1 poza pierścieniem (rysunek 6c). ICC komórek HK-2 z knockdown PHD2, która uważana jest za główną hydroksylazę prolilową HIF w eksperymentach z hodowlą komórkową (Strowitzki i wsp., 2019), dała podobne wyniki (Rysunek S6). Wyniki te wskazują, że oś PHD-VHL degradacji HIF nie była związana z tworzeniem pierścienia HIF.

3.6|Wpływ pH na akumulację HIF-1

W poprzednim raporcie opisano zastosowanie modelu szkiełka nakrywkowego miocytów sercowych, które wykazywały spadek pH wewnątrz szkiełka nakrywkowego (Pitts & Toombs, 2004). Zbadaliśmy pH pod szkiełkiem nakrywkowym i jego wpływ na tworzenie pierścieni HIF. Traktowaliśmy komórki HK-2 wewnątrzkomórkowym wskaźnikiem pH, którego intensywność fluorescencji pozwala na ocenę pH w komórkach. Obrazowanie na żywo wykazało, że pH spadło na większości obszaru wewnętrznego, ale nie w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego, co sugeruje istnienie gradientu pH wokół krawędzi w modelu szkiełka nakrywkowego (ryc. 6a). Analiza ilościowa korelacji między intensywnością fluorescencji a odległością od krawędzi szkiełka nakrywkowego wykazała, że ​​ta pierwsza wzrastała wraz ze wzrostem odległości, co potwierdza istnienie gradientów pH i tlenu wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego (ryc. 6b). Analiza Western blot lizatów komórkowych przy jednorodnym stężeniu tlenu wykazała, że ​​inkubacja z podłożem o pH 5,0 hamowała akumulację HIF-1 w warunkach hipoksji (Rysunek S7a-d). Potwierdziliśmy również, że akumulacja HIF-1 w warunkach hipoksji w różnych warunkach pH spadła poniżej pH 6,0 (rysunek S8a-c).

W jednym z raportów podkreślono znaczenie warunków lekko kwaśnych, przy pH około 6,0. Według tego badania, reoksygenacja po niedotlenieniu spowodowała zakwaszenie ośrodka, co spowodowało sekwestrację jąderkową VHL. Z kolei degradacji HIF zapobiegano w miotubulach C2C12, neuronach PC12 i 786-0 komórkach raka nerki (Mekhail i wsp., 2004). W naszym badaniu nie stwierdzono zmian w dystrybucji VHL w komórkach kanalików między regionami z akumulacją HIF-1 a tymi, w których był on tłumiony, w modelu szkiełek nakrywkowych z wartościami pH od 5.0 do 7,4 (Rysunek S9a–c). Komórki rurkowe są wystawione na szeroki zakres warunków pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), więc zbadaliśmy zmienność pierścienia HIF w pożywkach o różnym pH wartości od 5,0 do 8,5. Pierścień HIF był wyraźnie obserwowany w pożywce o pH 8,5 i 7,4 (Figura 6c). Pierścień HIF również istniał przy pH 6,5, ale był zasłonięty (Figura 6c). Sygnał HIF-1 był osłabiony na całym obszarze szkiełka nakrywkowego przy pH 5,0. (Rysunek 6c). Przeprowadziliśmy dalszą analizę ilościową zależności pozycyjnej między pierścieniem HIF a krawędzią obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu (ryc. 7a) i odkryliśmy, że pozycja pierścienia zmieniała się w zależności od pH. Krąg wewnętrzny miał tendencję do rozszerzania się na zewnątrz przy pH 6,5 w porównaniu z pH 7,4, podczas gdy okrąg zewnętrzny znacząco kurczył się do wewnątrz przy pH 8,5, w oparciu o krawędź obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu (Figura 7b,c). Potwierdziliśmy również, że aktywność genów porządkowych utrzymywała się w modelu szkiełka nakrywkowego w warunkach inkubacji w kwasie (ryc. S10). Dlatego wydaje się, że pH odgrywa ważną rolę w mechanizmie powstawania pierścienia HIF.

4|DYSKUSJA

W tym badaniu zidentyfikowaliśmy unikalną dystrybucję HIF-1 w komórkach kanalików nerkowych, wykorzystując model hipoperfuzji indukowanej przez założenie szkiełka nakrywkowego. Odkryliśmy, że tworzenie i utrzymanie pierścienia HIF były regulowane przez ciśnienie tlenu i pH, z których oba występowały w gradiencie na krawędzi szkiełka nakrywkowego modelu szkiełka nakrywkowego. W oparciu o te wyniki, proponujemy możliwy mechanizm tworzenia pierścienia HIF, obejmujący akumulację HIF-1 wraz ze zmniejszaniem się prężności tlenu oraz tłumienie akumulacji z powodu niskiego pH w pewnej odległości od krawędzi szkiełka nakrywkowego (ryc. 8 ).

Hipoperfuzja jest indukowana przez rozrzedzenie mikronaczyń w CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). W naszej poprzedniej pracy wykorzystaliśmy obrazowanie in vivo do wykazania obecności gradientu tlenu w komórkach kanalików nerkowych zdrowych nerek myszy (Hirakawa i wsp., 2018). Oczekuje się, że ciśnienie tlenu będzie niejednorodne w komórkach kanalików w CKD. Pozostaje jednak niejasne, czy istnienie hipoperfuzji z gradientem tlenu wpływa na system obronny przed hipoksją, HIF. W tym badaniu zbadaliśmy dystrybucję HIF w hodowanych komórkach kanalików proksymalnych w modelu hipoperfuzji i odkryliśmy, że gradient tlenu w hodowanych komórkach kanalików nerkowych był z powodzeniem modelowany przy użyciu okrągłego szklanego szkiełka nakrywkowego. Dowody z eksperymentów z zastosowaniem jednorodnej prężności tlenu wskazują, że HIF-1 , którego hydroksylacja i późniejsza degradacja są głównie zależne od tlenu, akumulują się. Oznacza to, że ilość HIF-1 wzrasta wraz ze spadkiem ciśnienia tlenu. Jednak w naszym modelu szkiełka nakrywkowego HIF-1 był tłumiony w obszarze beztlenowym i miał największą akumulację w pewnej odległości od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Ta akumulacja HIF w kształcie pączka nigdy wcześniej nie była pokazywana. Wykazaliśmy, że ruch pierścienia HIF można zaobserwować niezależnie od prężności tlenu w atmosferze inkubującej, ale jego położenie zależało od prężności tlenu. Zakres prężności tlenu na pierścieniu HIF zmierzono na poziomie około 4–20 mmHg przy użyciu PLIM z BTPDM1. Większość wcześniejszych badań, które koncentrowały się na hodowanych komórkach w atmosferze z jednorodnym ciśnieniem tlenu, wykazało, że ilość białka HIF-1 wzrosła w zakresie niedotlenienia lub niedotlenienia (Ameri i in., 2002; Carrera i in. , 2014). Zatem w naszym modelu na tworzenie pierścienia HIF musiał mieć wpływ inny czynnik niż napięcie tlenu; był niezależny od doktoratu, ograniczającego szybkość procesu degradacji HIF. Przełomem w wyjaśnieniu mechanizmu powstawania pierścienia HIF było odkrycie przez nas roli gradientu pH oraz gradientu tlenu w modelu nakrywkowym, które ograniczały dopływ mediów podobnie do hipoperfuzji in vivo Model. W tym modelu hipoperfuzji wewnątrzkomórkowe pH zmniejszało się wraz ze wzrostem odległości od krawędzi szkiełka nakrywkowego, a wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego obserwowano gradient pH. Wykazaliśmy, że akumulacja HIF-1 była stłumiona przy niskim pH, około pH 5,0, w porównaniu z inkubacją przy około obojętnym pH przy jednorodnym napięciu tlenu. Zewnętrzna krawędź pierścienia HIF rozszerzyła się na zewnątrz przy pH 6,5, a wewnętrzna krawędź pierścienia HIF skurczyła się do wewnątrz przy pH 8,5, w oparciu o krawędź obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu. Pierścień HIF był przesłonięty w warunkach kwasowych, a sygnał HIF-1 zniknął przy pH 5,0. W ten sposób wyjaśniliśmy znaczenie pH dla tworzenia pierścienia HIF w modelu szkiełka nakrywkowego. Wykazaliśmy możliwość, że pierścień HIF został utworzony przez zahamowanie akumulacji HIF-1 przez niskie pH wewnątrz pierścienia.

Kilka wcześniejszych badań metodą szkiełek nakrywkowych wykorzystywało komórki rakowe. Według jednego doniesienia wykorzystującego ludzką linię komórek wątrobiaka Hep3B, która wyraża zależne od tlenu przesunięcie ku czerwieni zielonego białka fluorescencyjnego (AcGFP1), obrazowanie na żywo komórek przykrytych prostokątnym szkiełkiem nakrywkowym wykazało przesunięcie ku czerwieni wraz ze wzrostem odległości od krawędzi szkiełka nakrywkowego (Takahashi i Sato, 2010). Widmo emisyjne komórek wątrobiaka przesunęło się od długości fali fluorescencji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) do czerwonego w miarę zmniejszania się prężności tlenu. W innym badaniu zmierzono ciśnienie tlenu w komórkach SCC-7 z okrągłym szkiełkiem nakrywkowym 15-mm przy użyciu techniki czasu życia fosforescencji. Ciśnienie tlenu wyniosło 6,9 mmHg i 166 mmHg, obliczone na podstawie PL, które wynosiło odpowiednio 3,89 µs i 893 µs, 0–2 mm wewnątrz i 0–1 mm na zewnątrz krawędzi szkiełka nakrywkowego (Yoshihara et al., 2015). Metodę szkiełek nakrywkowych zastosowano również w przypadku miocytów sercowych, układu, który przyciągnął uwagę jako obiecujący model niedokrwienno-reperfuzyjny in vivo. Kelly i wsp. wykazali, że miocyty przykryte szkiełkiem nakrywkowym z czasem ulegały wyraźnym zmianom morfologicznym, którym towarzyszyły zmiany w potencjale błony mitochondrialnej i dynamice błony komórkowej, co ostatecznie doprowadziło do śmierci miocytów. Wykazali również, że wewnątrzkomórkowe pH miocytów przykrytych szkiełkiem nakrywkowym gwałtownie spada do około pH 4 w środku szkiełka nakrywkowego (Pitts i Toombs, 2004). Model szkiełek nakrywkowych, hamujący dyfuzję tlenu lub składników odżywczych do hodowanych komórek pod szkiełkiem nakrywkowym, może naśladować model in vivo stref niedokrwienia, normalnych i brzeżnych odpowiednio w środku, na zewnątrz i na krawędzi szkiełka nakrywkowego. W kilku badaniach wykorzystano ten model jako model niedokrwienia-reperfuzji miocytów in vitro (Chun i wsp., 2015; Pitts i wsp., 2008; Solhjoo i O'Rourke, 2015; Wang i wsp., 2012). Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nasze badanie jest pierwszym, w którym zastosowano metodę szkiełek nakrywkowych do komórek kanalikowych. W naszym systemie odległość od krawędzi szkiełka nakrywkowego do obszaru odpowiadającego 10 mmHg ciśnienia tlenu, w którym pimonidazol powinien być dodatni, wynosiła 1,22 mm, a ciśnienie tlenu spadło do zera w odległości 2 mm od krawędzi szkiełka nakrywkowego . Wynik ten może być zgodny z wcześniejszymi doniesieniami, w których stosowano szkiełko nakrywkowe o średnicy około 15 mm, wykazując istnienie gradientu tlenu w odległości co najmniej 2 mm od krawędzi (Akiyama i in., 2018; Yoshihara i in., 2015). Zbadaliśmy szybkość apoptozy komórek pod szkiełkami nakrywkowymi (ryc. S11) i odkryliśmy, że GAPDH i aktyna były utrzymywane nawet wewnątrz pierścienia HIF, co wskazuje, że pierścień HIF nie był spowodowany tylko apoptozą komórek lub śmiercią wewnątrz pierścienia HIF.

W kilku badaniach zmierzono ciśnienie tlenu w nerkach przy użyciu różnych metod. Kilka przykładów pomiaru prężności tlenu w normalnych nerkach było następujące: 50 mmHg i 30 mmHg w korze i rdzeniu za pomocą mikroelektrod; oraz 49 mmHg i 41 mmHg w segmentach S1 i S2 komórek kanalikowych kory przy użyciu PLIM (Hirakawa i wsp., 2017, 2018; Zhang i wsp., 2014). Napięcie tlenu w chorych nerkach byłoby niższe. Zgodnie z wcześniejszym doniesieniem, w którym stosowano mikroelektrody tlenowe, szczury z cukrzycą miały niższe ciśnienie tlenu w miąższu nerek: odpowiednio 36 mmHg i 11 mmHg w korze i rdzeniu (Heyman i wsp., 2013; Palm i wsp., 2003). Ponieważ mikroelektrody tlenowe mierzą średnie ciśnienie tlenu w miąższu, w przypadku chorych nerek oczekuje się szerszego zakresu. Wewnątrzkomórkowe ciśnienie tlenu spadło do zera mmHg w modelu niedokrwionej nerki, której tętnica i żyła boczna nerkowa zostały zaciśnięte (Hirakawa i wsp., 2015). Biorąc pod uwagę te wyniki, zakres prężności tlenu na pierścieniu HIF, około 4–20 mmHg, wydawał się być wiarygodny in vivo.

Odkryliśmy ponadto, że pH wpływa na tworzenie pierścieni HIF, a także na napięcie tlenu. Ponieważ komórki nabłonka kanalików w nerkach są stale narażone na działanie płynu moczowego, pH komórek kanalików powinno mieć wpływ na pH moczu. Biorąc pod uwagę szeroki zakres pH moczu, postanowiliśmy zbadać komórki inkubowane w zakresie pH 5,0–8,5. Przeprowadzono badania dotyczące zakresu pH w zdrowych nerkach. Jedno z badań wykazało, że pH kory wynosiło 7,39 ± 0.{{10}}8, a rdzeń wynosił 7,20 ± {{2{39} }}}.09, jak zmierzono przy użyciu mikroelektrod (Burke et al., 1999). Inne badanie, wykorzystujące obrazowanie pH oparte na MRI, wykazało wartości pH odpowiednio 7,3 ± 0,13 i 7,0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). W mysim modelu CKD z kwasicą stwierdzono, że pH nerek spadło z 6,5 do 6,32, a w ciężkim przypadku do 5,83 (Pavuluri i wsp., 2019). Obserwacje te dostarczyły dowodów na spadek pH i zmiany w CKD. Jednak wpływ pH na HIF-1 wywołany przewlekłą hipoksją w CKD nie został wystarczająco dobrze zbadany. W niniejszym badaniu zaobserwowano przesunięcie pierścienia HIF między pH 6,5 a pH 7,4, zakres pH, który jest prawdopodobny w CKD. Wynik ten potwierdza hipotezę, że łagodny spadek pH wpływa na akumulację HIF-1 w CKD. W oparciu o dowody spadku pH poniżej 6,0 w ciężkich przypadkach PChN konieczna jest również ocena stanu fizjologicznego HIF-1 przy niższym pH. Chociaż pojawiły się doniesienia, że ​​kwaśne środowisko, nawet w normoksji, stabilizuje HIF-1, większość z tych doniesień dotyczyła warunków łagodnej kwasowości powyżej pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . W tej pracy wykazaliśmy tłumienie akumulacji HIF-1 w komórkach kanalikowych przy pH 5,0 i tłumienie sygnałów HIF-1 w modelu szkiełek nakrywkowych inkubowanych przy pH 5,0. Dlatego spadek pH nerek w CKD in vivo może być skorelowany z niewystarczającą aktywacją HIF, a także z obecnością toksyn mocznicowych w niedotlenionej nerce, nasilających progresję PChN (Tanaka i wsp., 2013).

Nasze badanie ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, w obszarze hipoperfuzji pożywka powinna być uboga w składniki odżywcze, oprócz obecności niedoboru tlenu i obniżonego pH. Trudno jednak określić wpływ pH, prężności tlenu i innych czynników wywołanych hipoperfuzją. W organizmie w narządach i komórkach występuje niedokrwienie, patologiczna hipoperfuzja krwi spowodowana kombinacją niskiego poziomu tlenu i niskiego poziomu składników odżywczych. Ważne jest zrozumienie różnic między wykrywaniem niedotlenienia a wykrywaniem niedokrwienia. Pomimo trudności w wyjaśnieniu biologicznego wpływu każdego czynnika, nasz model hipoperfuzji jest fizjologicznie prawdopodobny, naśladując stan patologiczny in vivo. Po drugie, wykonanie modelu szkiełka nakrywkowego wymaga umiejętności i praktyki, ponieważ większość komórek czasami odkleja się podczas zdejmowania szkiełka nakrywkowego, zwłaszcza przy użyciu metody tradycyjnej (rysunek S2a). Ten problem zależał od użytej linii komórkowej. Na przykład trudno nam było nałożyć model szkiełka nakrywkowego na ogniwa HEK 293, ponieważ ich przyczepność do szkiełka nakrywkowego była stosunkowo słaba. Po trzecie, pożądane było zminimalizowanie uszkodzeń hodowanych komórek pod szkiełkiem nakrywkowym. Liczba uszkodzonych komórek rosła wraz ze wzrostem okresu ich pokrycia, na co wskazuje analiza apoptozy. Ustaliliśmy, że 3 godziny były odpowiednie do oszacowania pierścienia HIF, gdy wydawał się statyczny, a około 10% komórek uległo apoptozie (ryc. S11). Czwartym ograniczeniem była trudność w przymocowaniu hodowanych komórek do szkiełka nakrywkowego w jednolity sposób w każdej próbce (Rysunek S2b,c). Różnica w przywiązaniu między tradycyjną a alternatywną metodą wykonania modelu nakrywkowego również mogła mieć wpływ na badanie. Zmierzyliśmy zakres prężności tlenu równoważnej pierścieniowi HIF za pomocą techniki czasu życia fosforescencji, w której stworzyliśmy model szkiełka nakrywkowego tradycyjną metodą. Ponieważ pierścień HIF podczas immunocytochemii wizualizowano za pomocą alternatywnej metody, rzeczywiste ciśnienie tlenu może być inne. Zminimalizowaliśmy te błędy, wykorzystując dowody, że pimonidazol był dodatni przy 10 mmHg lub niższym prężności tlenu. Piątym ograniczeniem jest to, że pH wewnątrzkomórkowe niekoniecznie jest takie samo jak pH pożywki hodowlanej. Kilka wcześniejszych raportów wykazało, że wewnątrzkomórkowe pH jest w pewnym stopniu zgodne z pH pożywki (Michl et al., 2019), mogliśmy ocenić jedynie trend wewnątrzkomórkowego pH, zmieniając pH pożywki. In vivo zależność między pH regionów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, takich jak mocz lub płyn ustrojowy, jest bardziej skomplikowana niż w komórkach hodowanych. W związku z tym w przyszłości konieczne będą dalsze badania dotyczące sposobu, w jaki zmiana pH reguluje akumulację białka HIF-1 in vivo.

Korzyść Cistanche: poprawa nerkafunkcjonować

Innym ograniczeniem jest to, że pH powinno mieć wpływ na marker hipoksji, pimonidazol. W naszym modelu szkiełka nakrywkowego porównaliśmy odległość krawędzi obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu od środka szkiełka nakrywkowego w różnych warunkach pH. Krawędź obszaru dodatniego pod względem pimonidazolu była porównywalna między pH 6,5, 7,4 i 8,5 (Figura S12a,b). Poprzednie badanie wykazało również utrzymanie wiązania pimonidazolu przy różnych wartościach pH (Kleiter i wsp., 2006). Na podstawie tych dowodów doszliśmy do wniosku, że pimonidazol jest odpowiednim markerem hipoksji w naszych eksperymentach ze szkiełkami nakrywkowymi. Ostatecznym ograniczeniem jest to, że biorąc pod uwagę zakres prężności tlenu od około 4 mmHg do 20 mmHg (od 0,52 procent O2 do 2,6 procent O2) pierścienia HIF, Pt(II)- i Pd(II)-porfiryny, które są szeroko stosowane jako biologiczne sondy tlenowe mają zalety przy pomiarach bardzo niskich stężeń tlenu ze względu na znacznie dłuższy czas życia fosforescencji w porównaniu z sondami wykorzystującymi kompleksy Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Ogólnie jednak ilościowy pomiar tlenu oparty na fosforescencji, obliczony za pomocą równania Sterna-Volmera, ma lepsze wyniki w niskich zakresach O2 (Papkovsky i Zhdanov, 2016). Kilka wcześniejszych badań wykazało, że pomiar prężności tlenu w oparciu o kompleks Ir(III) wynosi zaledwie około 10 mmHg (Akiyama i in., 2018; Yoshihara i in., 2015). Dlatego uważamy, że zakres napięcia tlenu pierścienia HIF powinien być dokładnym wynikiem.

5|WNIOSKI

Podsumowując, stwierdziliśmy, że zrozumienie roli tlenu i pH jest niezbędne do zrozumienia stanu fizjologicznego HIF-1 w PChN i można je uzyskać, badając komórki kanalików z hipoperfuzją. Model szkiełek nakrywkowych, z ograniczeniami dopływu pożywki, był dobrym modelem hipoperfuzji in vivo, zwłaszcza w kanalikach w CKD, ponieważ rozrzedzenie naczyń włosowatych okołokanalikowych jest główną cechą CKD (Mimura i Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Ten model hipoperfuzji może również naśladować gradienty tlenu i pH in vivo, takie jak guzy i zmiany niedokrwienne. Model zapewnia obiecujące podejście do wyjaśnienia tych mechanizmów biologicznych.

KONFLIKT INTERESÓW

Wszyscy autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

WKŁAD AUTORÓW

Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania ogólnej koncepcji. TH przeprowadziło całość eksperymentów. TH i YH przeanalizowali wyniki i sporządzili liczby. TH napisał oryginalny rękopis. KM, TY i ST przeprowadzili eksperyment przy użyciu techniki czasu życia fosforescencji i zredagowali część manuskryptu. YH, TT i MN zredagowali cały rękopis. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczny rękopis.

ODNIESIENIE

Akiyama H., Takahashi I., Shimoda Y., Mukai R., Yoshihara T. i Tobita S. (2018). Ir(iii) kompleksowe obrazowanie tlenowe żywych komórek i dna oka za pomocą bramkowanej kamery ICCD. Nauki fotochemiczne i fotobiologiczne, 17 (6), 846-853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y. i Hirakata, H. (2019). Enarodustat, terapia konwersyjna i podtrzymująca w przypadku niedokrwistości u pacjentów hemodializowanych: randomizowane, kontrolowane placebo badanie fazy 2b, po którym następuje badanie długoterminowe. Nefron, 143 (2), 77-85.

Ameri K., Burke B., Lewis CE i Harris AL (2002). Regulacja elementu VL30 szczura w ludzkich komórkach raka piersi w niedotlenieniu i niedotlenieniu: rola HIF-1. British Journal of Cancer, 87 (10), 1173-1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S. i Watanabe-Akanuma, M. (2016). Aktywacja receptora węglowodorów arylowych pośredniczy w tłumieniu ekspresji erytropoetyny zależnej od czynnika indukowanego hipoksją przez siarczan indoksylu. Amerykański Czasopismo Fizjologii. Fizjologia komórki, 310(2), C142-C150.

Burke TJ, Malhotra D. i Shapiro JI (1999). Czynniki utrzymujące gradient pH w nerkach: rola architektury naczyniowej. Nerka International, 56 (5), 1826-1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ i Macip, S. (2014). Rola czynnika transkrypcyjnego HIF-1alfa w zwiększonym podziale komórek przy fizjologicznych napięciach tlenu. PLoS jeden, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019 ).

Roxadustat na niedokrwistość u pacjentów z chorobą nerek niepoddawanych dializie. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Badania fazy 2 nad doustnym inhibitorem hydroksylazy prolilowej FG-4592, indukowanym hipoksją, w leczeniu niedokrwistości w Chinach. Nefrologia, dializa, transplantacja, 32(8), 1373-1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T. i Nangaku, M. (2011). Siarczan indoksylu, reprezentatywna toksyna mocznicowa, hamuje wytwarzanie erytropoetyny w sposób zależny od HIF. Badania laboratoryjne, 91(11), 1564-1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H. i Księżyc, IS (2015). Roztwór glukoza-insulina-potas chroni miocyty komorowe noworodków szczurów w modelu niedokrwienia/reperfuzji szkiełek nakrywkowych in vitro. Koreański Dziennik Obiegowy, 45(3), 234-241.

Coyne, DW, Goldsmith, D. i Macdougall, IC (2017). Nowe opcje anemii przewlekłej choroby nerek. Międzynarodowy dodatek nerkowy, 7(3), 157-163. pocałunek.2017.09.002

Deng A., Arndt MA, Satriano J., Singh P., Rieg T., Thomson S. i in. (2010). Ochrona nerek w przewlekłej chorobie nerek: aktywacja czynnika indukowanego niedotlenieniem vs. blokada angiotensyny II. Amerykański Czasopismo Fizjologii. Fizjologia nerek, 299 (6), F1365-F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK i Acker, T. (2016). Kwasica działa poprzez HSP90 w sposób niezależny od doktora/VHL, promując funkcję HIF i utrzymanie komórek macierzystych w glejaku. Badania nad rakiem, 76(19), 5845-5856. MOŻE-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S. i Heyman, SN (2006). Ostra na przewlekła niewydolność nerek u szczura: kompensacja funkcjonalna i tolerancja na hipoksję. American Journal of Nefrology, 26 (1), 22-33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S. i Khamaisi, M. (2013). Dlaczego cukrzyca jest czynnikiem ryzyka nefropatii pokontrastowej? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Obrazowanie przyżyciowej fosforescencji kory nerkowej dokładnie mierzy niedotlenienie nerek. Kidney International, 93 (6), 1483-1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T. i Nangaku, M. (2017). Niedotlenienie nerek w PChN; Patofizjologia i metody wykrywania. Granice w fizjologii, 8, 99.