Delecja pięciu aminokwasów w NKCC2 myszy C57BL/6 wpływa na analizę fosforylacji NKCC2, ale nie wpływa na czynność nerek

edmund.chen@wecistanche.com

WPROWADZANIE

Gruba kończyna wstępująca (TAL) ssakanerkama kluczowe znaczenie dla kontroli objętości płynu pozakomórkowego, stężenia moczu, homeostazy wapnia (Ca 2 plus ) i magnezu (Mg 2 plus ) oraz równowagi pH. 1 Głównym szlakiem transportu Na plus w TAL jest kotransporter Na plus - K plus - 2Cl − (NKCC2), który jest specyficznie hamowany przez diuretyki pętlowe. 1 Kotransport jonów Na plus , K plus i 2Cl − przez NKCC2 jest elektroobojętny, ale zależy od elektrogenicznego wydzielania K plus przez wierzchołkową nerkowyrdzeń zewnętrzny K plus kanał ROMK. 2 Wzajemne oddziaływanie NKCC2 z ROMK tworzy dodatni w świetle gradient elektrochemiczny, który zwiększa reabsorpcję Na plus i napędza transport parakomórkowy Ca 2 plus i Mg 2 plus . 3 Znaczenie NKCC2 dla TAL ifunkcja nerkiprzykładem jest zespół Barttera typu I, choroba genetyczna spowodowana mutacjami utraty funkcji w NKCC2, objawiająca się ciężkimnerkowymarnowanie soli i płynów, hipokaliemiczna zasadowica metaboliczna i hiperkalciuria. 3

NKCC2 jest członkiem rodziny rozpuszczonych nośników 12 (Slc12) białek transportujących błonę, która obejmuje również wszechobecną ekspresję NKCC1 i dystalnych kanalików krętych (DCT) specyficznych dla Na plus - Cl - kotransportera (NCC). 2 Aktywność NKCC2 dodatnio koreluje z fosforylacją kotransportera w kilku resztach seryny i treoniny cytoplazmatycznego N-końcowego ogona. 4 Sekwencje aminokwasowe otaczające te miejsca fosforylacji są wysoce konserwatywne i wykazują wysoki stopień podobieństwa między NKCC2, NKCC1 i NCC. 2 Fosforylacja NKCC2 jest stymulowana kilkoma drogami hormonalnymi i niehormonalnymi. Hormony takie jak wazopresyna argininowa (AVP) i angiotensyna II (ANGII) stymulują NKCC2 poprzez zwiększoną produkcję cAMP i aktywację kinazy białkowej A (PKA). Uważa się, że PKA bezpośrednio fosforyluje NKCC2 w Ser126, co wzmaga egzocytozę pęcherzyków zawierających NKCC2, a tym samym obfitość transportera w wierzchołkowej błonie komórkowej. 6 Podobnie zmiany w stężeniach chlorków wewnątrzkomórkowych regulują fosforylację NKCC2. Obniżone stężenie wewnątrzkomórkowego Cl − stymuluje kinazy bezlizynowe(K) WNK1 i WNK4 do fosforylacji i aktywacji dalszych kinaz związanych z kinazą prolinowo-alaniną (SPAK) związaną z Ste20- lub kinazą reagującą na stres oksydacyjny 1 (OXSR1 ). 7- 9 Po związaniu z motywem „RFxV” w NKCC2, te kinazy następnie fosforylują NKCC2 przy dwóch resztach treoniny (T96 i T101). 2 W defosforylacji tych reszt pośredniczy fosfataza kalcyneuryna, co podkreśla, że ​​NKCC2 jest celem kilku szlaków sygnałowych. 10

Aby zbadać funkcję NKCC2, kilka grup, w tym nasza, opracowało przeciwciała specyficzne dla fosfoformy przeciwko Thr96 i/lub Thr101. 11- 17 Przeciwciała zastosowano do oceny fosforylacji NKCC2 w heterologicznych układach ekspresyjnych 7,11,17,18,19,20 i modelach zwierzęcych, w tym szczurach 10,21,22,23,24,25 i myszach. 14,15,16,17,19,26,27 Jednakże, stosując nasze przeciwciało pT96/101 NKCC2, uzyskaliśmy niespójne wyniki w naszych różnych modelach mysich. Chociaż wykryliśmy silne sygnały pNKCC2 w nerkach myszy o podłożu genetycznym 129Sv, nie uzyskaliśmy wiarygodnych sygnałów pNKCC2 w nerkach myszy C57BL/6, ale zaobserwowaliśmy reakcję krzyżową przeciwciał pNKCC2 z pNCC. Podobne obserwacje poczyniły inne laboratoria, m.in. JA McCormick i AA McDonough (komunikacja osobista). 18,28,29 Ponadto, u myszy opisano uderzające różnice szczepów w przypadku:nerkowyfunkcja 30 obejmująca znacznie niższe wydalanie Ca2 z moczem w C57BL/6 w porównaniu z myszami 129Sv. 31 Dlatego postawiliśmy hipotezę, że myszy C57BL/6 wykazują ekspresję genetycznego wariantu NKCC2, który wpływa na fosforylację NKCC2 i prawdopodobniefunkcja nerkiwyjaśniające obserwowane różnice w odkształceniach. Poniższe badanie zostało zaprojektowane w celu systematycznego sprawdzania tej hipotezy.

Słowa kluczowe:homeostaza jonowa, nerki, NKCC2, fosforylacja, różnice szczepów

WYNIKI

2.1|Myszy C57BL/6 mają delecję pięciu aminokwasów w NKCC2, która zakłóca wykrywanie ufosforylowanego NKCC2Najpierw przyrównaliśmy dla kilku gatunków opublikowane N-końcowe sekwencje aminokwasowe (ID transkrypcji w Tabeli S1) NKCC2 i NCC (odpowiednio Figura 1A, B), które odpowiadają epitopom rozpoznawanym przez przeciwciała anty-pNCC i anty-pNKCC (Rysunek 1C). Dopasowanie potwierdziło wysoki stopień konserwacji miejsc fosforylacji NKCC2 i NCC 7, co prawdopodobnie wyjaśnia obserwowaną przez nas i innych reakcję krzyżową przeciwciał pNKCC2 i pNCC. 18,28,29 Co ciekawe i zgodne z naszą hipotezą, dopasowanie również ujawniło nie docenianą dotąd delecję pięciu aminokwasów w sekwencji NKCC2 z myszy C57BL/6 (ΔF{97-T101) (Figura 1A) . Sekwencjonowanie DNA z dwóch różnych kolonii myszy C57BL/6 utrzymywanych w The Jackson Laboratory w USA lub Janvier Labs we Francji potwierdziło delecję nukleotydów w eksonie 2 C57BL/6 NKCC2, która odpowiada wyżej wymienionej delecji aminokwasów (Figura S1 ,Tabela S2).

Aby scharakteryzować wpływ usunięcia pięciu aminokwasów na immunodetekcję całkowitego i ufosforylowanego NKCC2, systematycznie badaliśmy nerki myszy C57BL/6 i 129Sv za pomocą immunohistochemii i immunoblottingu. Immunofluorescencja z przeciwciałem przeciwko całkowitemu NKCC2 wykazała silny sygnał fluorescencyjny w wierzchołkowej błonie komórkowej TAL myszy 129Sv i C57BL/6. Jednakże, nasze wcześniej opracowane przeciwciało pT96/T101 NKCC2 wykazywało silne znakowanie wierzchołkowe TAL tylko u myszy 129Sv, podczas gdy TAL myszy C57BL/6 miały bardzo słabe barwienie immunologiczne (Figura 1D). Zgodnie z tym, analiza Western blot ujawniła silny prążek dla całkowitego NKCC2 w obu szczepach myszy, podczas gdy przeciwciało pT96/T101 NKCC2 wykryło silny prążek o oczekiwanej wielkości (170 kDa) tylko u myszy 129Sv (Figura 1E). Zamiast tego nerki myszy C57BL/6 ujawniły prążek przy 130 kDa, który odpowiada oczekiwanej wielkości NCC (Figura 1E). Podobne wyniki uzyskano z innymi przeciwciałami stosowanymi wcześniej do badania fosforylacji NKCC2 (Figura S2). Przeciwciało 11 pT212/T217 NKCC1 R5 wykazywało oprócz sygnału pNCC słaby sygnał o oczekiwanej wielkości dla pNKCC2 (Figura S2). Prążek immunoreaktywny dla pNKCC2 stał się bardziej intensywny, gdy był świeżynerkazastosowano lizaty. Zastosowanie buforu do lizy z detergentami (bufor RIPA) nie poprawiło, ale zmniejszyło intensywność sygnału (Figura S3).

FIGURA 1 Przeciwciało pT96/T101 NKCC2 nie wykrywa widocznego sygnału pNKCC2 u myszy C57BL/6. A, dopasowanie sekwencji aminokwasów NKCC2 różnych gatunków i dwóch szczepów myszy 129Sv i C57BL/6. Identyfikatory sekwencji NKCC2 dla różnych gatunków wymieniono w Tabeli S1. Wysoce konserwatywny region odpowiadający mysim Thr96 do mysiego Thr101 zaznaczono na szaro. B, Dopasowanie sekwencji aminokwasów NCC w różnych gatunkach. Identyfikatory sekwencji NCC dla różnych gatunków wymieniono w Tabeli S1. C, Lista epitopów powszechnie stosowanych i opublikowanych przeciwciał rozpoznających pT53 lub pT58NCC, jak również pNKCC2 w konserwatywnym locus wokół Thr96 do Thr101. D, Immunobarwienie całkowitej i pT96/T101 NKCC2 w kolejnych kriogenicznych skrawkach myszy z tłem 129Sv i C57BL/6. Skala=50 µm. E, Immunoblot całkowitej i pT96/T101 NKCC2 myszy z tłem 129Sv i C57BL/6. Wartości to średnie ± SEM, n=5 myszy na grupę, zielone strzałki wskazują na specyficzne prążki, podczas gdy czerwone groty strzałek wskazują na niespecyficzne prążki. W zestawie znajdują się markery masy cząsteczkowej. Oczekuje się, że prążki całkowite i pT96/T101 NKCC2 przy 170 kDa. F, Immunobloty dla NCC całkowitego i pT96/T101 NKCC2, całkowitego i pT53 i pT58 NCC u myszy NCC WT i NCC knockout (KO) o różnym pochodzeniu. Zielone strzałki wskazują określone pasma, a czerwone groty strzałek wskazują niespecyficzne pasma. W zestawie znajdują się markery masy cząsteczkowej. Prążki NCC całkowite i pT58 i pT53 spodziewane są przy 130 kDa, prążki NCC całkowite i pT96/T101 są spodziewane przy 170 kDa

Aby sprawdzić, czy nasze przeciwciało pT96/T101 NKCC2 rzeczywiście reaguje krzyżowo z ufosforylowanym NCC u myszy C57BL/6, zbadaliśmynerkalizaty z myszy typu dzikiego 129Sv i C57BL/6 oraz myszy knockout C57BL/6 NCC z przeciwciałami przeciwko całkowitemu NKCC2, pT96/T101 NKCC2, całkowitemu NCC i ufosforylowanemu NCC (pT53 i pT58 NCC) (Figura 1F). Przeciwciało pT96/T101 NKCC2 i przeciwciała przeciwko całkowitemu NCC i pNCC nie wykryły prążków przy 130- 170 kDa u myszy knockout C57BL/6 NCC (Figura 1F). Co ciekawe, immunoblot, jak również dodatkowe doświadczenia immunohistochemiczne (Figura S4) wskazują, że nie tylko przeciwciała pNKCC2 reagują krzyżowo z NCC u myszy C57BL/6, ale nasze przeciwciała pNCC (pT53 NCC i pT58 NCC) reagują krzyżowo z NKCC2 u 129Sv myszy w stosowanych stężeniach.

Wydalanie wapnia i magnezu z moczem różni się między myszami 129Sv i C57BL/6

Aby określić, czy delecja (F97-T101) w NKCC2 może wiązać się z różnicami fizjologicznymi między myszami 129Sv i C57BL/6, porównaliśmy spożycie wody, poziomy jonów w osoczu oraz wydalanie płynu moczowego i jonów między dwoma szczepami myszy. Jak podsumowano w Tabeli 1, większość ocenianych parametrów nie różniła się między szczepami. Jednak myszy C57BL/6 wykazywały niższe wydalanie Ca2 plus w moczu i wyższe wydalanie Mg2 plus w moczu niż myszy 129Sv. Poziomy Ca 2 plus i Mg 2 plus w osoczu były podobne dla obu grup, co sugeruje, że myszy były w stanie stacjonarnym, w którym homeostatyczna równowaga resorpcji jelitowej, mobilizacji tkanek (np. z kości) inerkowyosiągnięto wydalanie jonów Ca 2 plus i Mg 2 plus. Aby sprawdzić, czy różne szybkości wydalania Ca 2 plus i Mg 2 plus z moczem wynikają z różnic w jelitowym wchłanianiu tych jonów, porównaliśmy dzienne spożycie pokarmu, wydalanie kału oraz wydalanie Ca 2 plus i Mg 2 plus z kałem. szczepy myszy. Jak pokazano na rysunku S5, przyjmowanie pokarmu i wydalanie Ca 2 plus w kale były podobne, ale dzienne wydalanie Mg 2 plus w kale było niższe u myszy C57BL/6 niż u myszy 129Sv, co sugeruje, że myszy C57BL/6 mają wyższe jelitowe Mg 2 plus wchłanianie zwrotne niż myszy 129Sv. Zgodnie z tym założeniem, myszy C57BL/6 miały silniejszą ekspresję w okrężnicy kanału magnezowego TRPM6 (Figura S6), jak również tendencję do wyższych poziomów Mg2 plus w osoczu w porównaniu z myszami 129Sv, chociaż różnice nie osiągnęły istotności statystycznej. Aby ocenić możliwy udział kości, przeanalizowaliśmy metodą mikroCT gęstość mineralną kości w obu szczepach. Podobnie jak w poprzednich raportach, 32 myszy C57BL/6 miały raczej niską gęstość mineralną kości (Rysunek S7), co może wyjaśniać, dlaczego te myszy mają tendencję do oszczędzania jonów Ca 2 plus poprzez zmniejszonąnerkowyCa 2 plus wydalanie. Nerki myszy C57BL/6 są zgodne ze zwiększoną szybkością reabsorpcji Ca 2 w postaci kanalików

wyrażał więcej kanału TRPV5 Ca2 plus na poziomie białka niż nerki myszy 129Sv (Figura 2). Myszy C57BL/6 miały również znacznie większą ekspresję mRNA i białka NCC niż myszy 129Sv (Figura 2A). Podobnie, obfitość białka całkowitego NKCC2, całkowitego i ufosforylowanego NCC oraz całkowitego ENaC była wyższa u myszy C57BL/6 niż u myszy 129Sv (Figura 2B, C). Obfitość rozszczepionych proteolitycznie, a zatem aktywnych form - i - ENaC nie różniła się, co sugeruje, żenerkowyAktywność ENaC była podobna dla obu szczepów (Figura 2B,C).

Brak dowodów na zmianę funkcji grubej kończyny wstępującej u myszy C57BL/6 w porównaniu z myszami 129Sv

Wyższe ilości całkowitego NKCC2, całkowitego NCC i ufosforylowanego NCC w nerkach myszy C57BL/6 mogą być odpowiedzią kompensacyjną dla zmniejszonej fosforylacji NKCC2. Aby sprawdzić, czy aktywność NKCC2 i NCC różni się między szczepami myszy, przeprowadziliśmy odpowiednio test na bumetanid i tiazyd. Pojedyncze wstrzyknięcie bumetanidu lub hydrochlorotiazydu wywołało silną natriurezę, która była wyraźniejsza w przypadku bumetanidu niż hydrochlorotiazydu. Jednak odpowiedzi moczopędne były całkowicie podobne w obu szczepach, co sugeruje, że czynności funkcjonalne NKCC2 i NCC nie różniły się między myszami C57BL/6 i 129Sv (Figura 3A-D). Najwyraźniej obfitość białek i poziomy fosforylacji niekoniecznie odpowiadają czynnościom funkcjonalnymnerkowybiałka transportujące jony, na co ostatnio wskazywali również Hunter i współpracownicy. 33 W celu dalszej oceny funkcji TAL przeprowadziliśmy test ograniczenia wody, w którym myszy miały przez 24 godziny dostęp do zwilżonego pokarmu, ale nie do wody z kranu. W tych warunkach oba szczepy myszy zwiększyły osmolarność moczu do podobnych wartości (Tabela 1). Ponadto myszy C57BL/6 i myszy 129Sv wykazywały takie samo wydalanie z moczem uromoduliny (białko Tamm-Horsfall) (Tabela 1), która jest wytwarzana i wydalana z moczem w zależności od czynnościowej aktywności komórek TAL. 3

Krzyżowanie myszy 129Sv i C57BL/6 sugeruje, że delecja pięciu aminokwasów w NKCC2 nie segreguje określonego fenotypu

Przedstawione dane sugerują, że różnice szczepów w wydalaniu jonów z moczem inerkowyobfitość białka nie jest związana z delecją pięciu aminokwasów w C57BL/6 NKCC2, ale jest związana z innymi różnicami genetycznymi między dwoma szczepami myszy. Aby to dalej przetestować, skrzyżowaliśmy myszy 129Sv i C57BL/6 z pokoleniem F2, w którym różnice szczepów genetycznych (w tym te w NKCC2) powinny być losowe

rozprowadzane myszom. Następnie porównaliśmy myszy F2, które były albo homozygotyczne pod względem NKCC2 pełnej długości (f/f), homozygotyczne pod względem delecji NKCC2 (Δ/Δ) lub heterozygotyczne pod względem delecji NKCC2 (f/Δ). Z wyjątkiem oczekiwanych różnych wzorów wiązania przeciwciał swoistych dla fosfoformy przeciwko NKCC2 i NCC (oraz niejasnej różnicy w ekspresji ROMK na poziomie mRNA, ale nie na poziomie białka), żadna z wcześniej zidentyfikowanych różnic między tymi dwoma szczepami nie była widoczna w myszy f/f, Δ/Δ lub f/Δ z pokolenia F2 (Rysunek 4 i Tabela 2). W szczególności nie było różnic w wydalaniu Ca2plus lub Mg2plus z moczem, jak również w poziomach Ca2plus lub Mg2plus w osoczu, co sugeruje, że różnice szczepów między myszami 129Sv i C57BL/6 są niezależne od delecja pięciu aminokwasów w NKCC2.

Nowe przeciwciało pT96 NKCC2 wykrywa pNKCC2 w obu szczepach

Ponieważ delecja pięciu aminokwasów w NKCC2 utrudnia wiarygodne wykrycie fosforylacji NKCC2 u myszy C57BL/6 przy użyciu dostępnych przeciwciał, wytworzyliśmy nowe przeciwciało skierowane przeciwko fosfo-miejscu T96 u myszy C57BL/6. Króliki immunizowano fosfopeptydem, który odpowiadał sekwencji aminokwasowej C57BL/6 NKCC2 otaczającej T96 (YYLQ(p)TMDA). Surowice odpornościowe oczyszczono metodą powinowactwa i scharakteryzowano metodą immunoblottingu i immunohistochemii (Figura 5). Przeciwciało wykryło pojedynczy prążek o oczekiwanej wielkości 170 kDa w nerkach z nokautem 129Sv, C57BL/6 typu dzikiego i C57BL/6 NCC

myszy (Rysunek 5A). Prążek wyraźnie różnił się od tego wykrytego dla NCC przy 130 kDa. Defosforylacja 129Svnerkapróbki z fosfatazą alkaliczną z jelita cielęcego (CIAP) całkowicie wyeliminowały sygnał uzyskany z nowym przeciwciałem pT96 NKCC2, podczas gdy sygnał z niespecyficznym dla fosfoformy przeciwciałem NKCC2 był widoczny w próbkach kontrolnych i defosforylowanych (Figura 5B). Co ciekawe, fosforylacja NKCC2 została również w dużej mierze wyeliminowana, gdynerkaLizaty inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę bez CIAP (prawdopodobnie z powodu aktywności endogennej fosfatazy alkalicznej z kanalików proksymalnych). Doświadczenia z defosforylacją z użyciem fosfatazy lambda na kolejnych skrawkach parafinowo-nerkowych myszy C57BL/6 potwierdziły ponadto, że nowe przeciwciało rozpoznaje tylko ufosforylowane NKCC2 (Figura 5C). Ponadto immunofluorescencja na kolejnych krioskracjach wykazała, że ​​nowe przeciwciało barwi tylko wierzchołkową błonę komórkową TAL NKCC2- dodatnich, ale nie NCC-dodatnie DCT u myszy 129Sv i C57BL/6 (Figura 5D), co sugeruje, że nowe Przeciwciało pNKCC2 nie reaguje krzyżowo z pNCC. Ten wniosek został również potwierdzony przy użyciu lizatów komórkowych z komórek MDCKI wyrażających ludzkie NKCC2 (hNKCC2) i ludzkie NCC (hNCC). Immunobloty immunoprecypitacji (IP) i lizaty całych komórek wykazały, że nowe przeciwciało pT96 NKCC2 rozpoznaje ludzkie NKCC2, ale nie ludzkie NCC (Figura S8A). Co ciekawe, chociaż nowe przeciwciało wytworzono przeciwko pNKCC2 myszy C57BL/6, nowe przeciwciało wykrywało równoważnie fosforylację NKCC2 w nerkach obu szczepów myszy zarówno za pomocą immunohistochemii (Figura 6A), jak i immunoblottingu (Figura 6B).

Nowe przeciwciało pT96 NKCC2 umożliwia analizę regulowanej fosforylacji NKCC2

Fosforylacja, a tym samym aktywność NKCC2 i NCC są regulowane przez stężenia jonów pozakomórkowych. Niski poziom [Cl-]ex zwiększa fosforylację NKCC2 w Thr96 i Thr101 oraz NCC w Thr53 i Thr58 poprzez aktywację szlaku WNK/SPAK/OSR1. 7,8,18,29,35 Podobnie, wysoki [K+] gwałtownie zmniejsza fosforylację NCC, ale uważa się, że ma niewielki lub żaden wpływ na fosforylację NKCC2. 12,36,37,38 Aby sprawdzić, czy nowo opracowane przeciwciało pT96 NKCC2 jest w stanie wykryć ten rodzaj zróżnicowanej regulacji fosforylacji NKCC2,nerkaskrawki myszy C57BL/6 eksponowano ex vivo na odpowiednio 110 lub 5 mM [Cl -]ex i 3 lub 10 mM [Kplus]ex. Zgodnie z oczekiwaniami, niski [Cl −] ex silnie zwiększał fosforylację NCC i NKCC2 (Figura 7A, B), podczas gdy wysoki [K plus ] ex tylko zmniejszał fosforylację NCC, ale nie zmieniał fosforylacji NKCC2 (Figura 7C, D). Podobnie nowe przeciwciało wykryte równie dobrze zmienione

RYCINA 4 Brak istotnych zmian w mRNA i ekspresji białek głównychnerkowytransportery i kanały jonowe w krzyżówce pokolenia F2. A, Wykres słupkowy względnych poziomów ekspresji mRNA w trzech grupach myszy. Wszystkie wartości znormalizowano względem myszy f/f. Wartości to średnie ± SEM. B, Obfitość białka u myszynerkalizaty ze zwierząt pokolenia F2. Trzy grupy odpowiadają pełnej długości NKCC2 (f/f), NKCC2 homozygotycznemu pod względem delecji (Δ/Δ) lub NKCC2 heterozygotycznemu pod względem delecji (f/Δ/). W zestawie znajdują się markery masy cząsteczkowej. NKCC2 i pNKCC2 spodziewane przy 170 kDa, NCC i pNCC przy 130 kDa, TRPM6 przy 260 kDa, - ENaC przy 95 kDa i 34 kDa (rozszczepiony), - ENaC przy 100 kDa, - ENaC przy 100 kDa i 85 kDa (rozszczepiony) ROMK przy 55 kDa (dojrzały glikozylowany), 43 kDa (rdzeń glikozylowany) i 34 kDa (nieglikozylowany). Zielone strzałki wskazują konkretne pasma, a czerwone groty strzałek wskazują niespecyficzne pasma. C, Analiza densytometryczna obfitości białka porównująca myszy f/f i Δ/Δ. Intensywność prążków z Δ/Δ myszy znormalizowano do tych z f/f. (Wartości to średnie ± SEM; n=5 myszy/grupę; *P < 0,05,="" †="" p="">< 0,01,="" ‡="" p=""><>

Fosforylacja NKCC2, która została wywołana w komórkach MDCKI eksprymujących ludzkie NKCC2 (hNKCC2) lub mysie NKCC2 (mNKCC2(C57BL/6)) w warunkach hipotonicznego niskiego poziomu chlorku zewnątrzkomórkowego (Figura S8B). Wnerkaskrawki inkubowane przy 5 mM [Cl - ] ex , również wcześniej opisane przeciwciała przeciwko mysim pT96/T101 NKCC2 39 i przeciwko ludzkiemu pT212/T217 NKCC1 R5 11 wykrywają słabe sygnały dla NKCC2 i NCC, które stają się bardziej widoczne po załadowaniu większej ilości białek i obrazowaniu immunoblotów w ulepszonych ustawieniach (Rysunek S9).

DYSKUSJA

Myszy C57BL/6 i 129Sv to dwa z najczęściej używanych szczepów myszy w badaniach biomedycznych. Genom myszy C57BL/6 był pierwszym, który został zsekwencjonowany dla myszy 40 i od tego czasu służy jako genom referencyjny do analizy zmienności genetycznych i fenotypowych między szczepami myszy. 41- 44 Dlanerkabadania, jedna zasadnicza różnica między myszami C57BL/6 i 129Sv dotyczy ekspresji genu reniny. Podobnie jak ludzie, myszy C57BL/6 mają tylko jeden gen reniny, podczas gdy myszy 129Sv posiadają dwie kopie, co może wyjaśniać wyższą podatność tego szczepu myszy na nadciśnienie 45,46 i uszkodzenie nadciśnieniowe. 47 W niniejszym badaniu dodajemy kolejną ważną różnicę genetyczną, którą należy wziąć pod uwagę. Opisujemy niedocenioną dotąd delecję pięciu aminokwasów w NKCC2 (ΔF97- T101), obecną w C57BL/6, ale nie u myszy 129Sv, która zakłóca wykrywanie fosforylacji NKCC2 za pomocą większości wcześniej dostępnych przeciwciał, ale nie wpływa znacząco uderzeniefunkcja nerki.

Miejsca N-końcowej fosforylacji NKCC2 myszy T96 i T101 są wysoce konserwatywne wśród gatunków i między NKCC2, NKCC1 i NCC (Figura 1). 48 Dlatego nie jest zaskakujące, że przeciwciała skierowane przeciwko tym miejscom fosforylacji reagują krzyżowo z innymi kotransporterami. Wcześniejsze badania wykazały, że przeciwciała przeciwko ufosforylowanemu NCC również wykrywają ufosforylowane NKCC2 7,18,28,29 i że przeciwciało pNKCC1 umożliwia analizę poziomów fosforylacji zarówno NKCC1, jak i NKCC2. 11 Zgodnie z tym zaobserwowaliśmy reaktywność krzyżową naszych przeciwciał pNCC (pT53 i pT58) z ufosforylowanym NKCC2 oraz naszego przeciwciała pT96/pT101 NKCC2 z ufosforylowanym NCC. Jednak reaktywność krzyżową przeciwciał pNCC z NKCC2 obserwowano tylko w nerkach myszy 129Sv, ale nie w nerkach myszy C57BL/6. Odwrotnie, nasze wcześniej opracowane przeciwciało przeciwko NKCC2 pT96/pT101 wykazywało brak lub w najlepszym razie bardzo słaby sygnał dla pNKCC2 w nerkach myszy C57BL/6 i wykrywało głównie ufosforylowane NCC w tym szczepie. Teraz łączymy te mylące obserwacje z delecją pięciu aminokwasów w NKCC2 myszy C57BL6 (ΔF97-T101). Regulacja fosforylacji NKCC2 została zbadana

w różnych warunkach eksperymentalnych i dla różnych bodźców, w tym wazopresyny, 14,21,24,25,49 uromoduliny 19,20,50 i inhibitorów kalcyneuryny. 10,26 Podczas gdy większość badań przeprowadzono w heterologicznych układach ekspresji 10,19,20,25,50 lub na szczurach 10,24 i myszach 19,26 z ekspresją pełnej długości NKCC2, niektóre badania przeprowadzono również na myszach C57BL/6. 7,18,27,28,29,51 Jak donosimy tutaj, myszy C57BL/6 wykazują ekspresję wariantu NKCC2 z delecją pięciu aminokwasów, która zakłóca prawidłowe wykrywanie fosforylacji NKCC2 i która niesie ryzyko, że standardowe pT96/T101 NKCC2 przeciwciała i przeciwciało R5 anty-fosfo-NKCC1 reagują krzyżowo z ufosforylowanym NCC przynajmniej w warunkach stosowanych w naszej pracy. Nie jest możliwe oszacowanie wpływu tej reakcji krzyżowej na poprzednie wnioski eksperymentalne, ale zgodnie z naszymi obserwacjami dane pochodzące od myszy C57BL/6 należy ponownie przeglądać i interpretować z ostrożnością. Pomimo faktu, że delecja pięciu aminokwasów miała silny wpływ na wykrywanie fosforylacji NKCC2, nie mamy dowodów na to, że delecja znacząco wpływa na aktywność funkcjonalną kotransportera. Myszy C57BL/6 faktycznie miały wyższe wydalanie Mg2 plus w moczu i niższe Ca2 plus wydalanie 31 w moczu niż myszy 129Sv, ale stwierdziliśmy, że te różnice prawdopodobnie nie są związane ze zmienionym transportem parakomórkowym tych kationów wzdłuż TAL, ale są wynikiem zwiększonego zależnego od TRPM6- Mg 2 plus wychwyt w jelicie i zwiększonego zależnego od TRPV5- Ca2 plus reabsorpcja w DCT2 i CNT. To ostatnie powoduje dodatni bilans Ca 2 plus, który może pomóc w zwiększeniu niskiej gęstości mineralnej kości myszy C57BL/6. Odkrycie, że myszy C57BL/6 i 129Sv wykazują to samonerkowyodpowiedzi na diuretyki pętlowe i tiazydowe oraz na ograniczenie wody dalej sugerują, że delecja pięciu aminokwasów w NKCC2 nie zaburza znacząco funkcji TAL. Co najważniejsze, myszy z pokolenia F2 mieszańców myszy C57BL/6 i 129Sv mają te samenerkowyphenotype independent of whether mice express full length (f/f) NKCC2 or NKCC2

homozygotyczny (Δ/Δ) do usunięcia. Te obserwacje u myszy są zgodne z wcześniejszymi danymi funkcjonalnymi z heterologicznych systemów ekspresji. Podczas gdy mutacje pojedynczych reszt w NKCC1 (T217 u człowieka, T211 u myszy) lub NCC (T60 u człowieka, T58 u myszy) znoszą aktywność tych kotransporterów, mutacje odpowiedniej reszty w NKCC2 (T105 u człowieka, T101 u myszy) ) mają raczej niewielki lub nawet żaden wpływ na aktywność podstawową i stymulowaną aktywność NKCC2. 35,52,53 Nawet gdy obie reszty treoniny w NKCC2 są zmutowane do alaniny, aktywność funkcjonalna NKCC2 wciąż osiąga ~70 procent maksymalnej aktywności, 35 co sugeruje, że fosforylacja tych miejsc jest wskaźnikiem, ale nie jest niezbędna dla aktywności NKCC2.

Miejsca fosforylacji są często homologiczne między białkami. Stąd problem reaktywności krzyżowej przeciwciał swoistych dla fosfoformy nie jest wyjątkowy dla przeciwciał skierowanych przeciwko ufosforylowanemu NCC, NKCC2 i NKCC1, ale został zgłoszony również dla innych białek, takich jak kinazy zależne od cyklin 1 i 2 54 oraz zewnątrzkomórkowe kinazy regulowane sygnałowo 1 i 2. 55 Konsekwentnie, ilekroć stosuje się przeciwciała specyficzne dla stanu fosforylacji, potrzebne są rygorystyczne kontrole eksperymentalne w celu potwierdzenia specyficzności wykrytych sygnałów. Może to obejmować (a) potwierdzenie, że zastosowane przeciwciało wykrywa białko o oczekiwanej masie cząsteczkowej (immunoblotting) i/lub w oczekiwanej lokalizacji komórkowej i subkomórkowej (immunofluorescencja), (b) weryfikację, czy przeciwciało oddziałuje specyficznie z ufosforylowanym epitopem przez stosując testy kompetycyjne z fosforylowanymi i niefosforylowanymi peptydami oraz (c) wykazanie, że

przeciwciało jest specyficzne względem fosfoformy przez porównanie ufosforylowanych i defosforylowanych próbek tkanek. Te kontrole mogą być uzupełnione kontrolami genetycznymi, które obejmują badanie tkanek zwierząt z nokautem i/lub komórek heterologicznie wyrażających białko będące przedmiotem zainteresowania. W niniejszym badaniu zastosowaliśmy wyżej wymienione podejścia, aby dokładnie scharakteryzować nowe przeciwciało pT96 NKCC2, które wykrywa fosforylowane NKCC2 wnerkapróbki od myszy C57BL/6 i 129Sv równie dobrze. Przeciwciało jest specyficzne względem fosfoformy i nie wykazuje widocznej reaktywności krzyżowej z ufosforylowanym NCC w żadnym z testowanych warunków. Stosując to przeciwciało potwierdziliśmy, że niskie stężenia chlorków pozakomórkowych zwiększają fosforylację NKCC2 w tym miejscu,7,8, podczas gdy zmienione stężenia potasu pozakomórkowego nie odgrywają znaczącej roli regulacyjnej. 24 Podsumowując, nasza praca ujawnia krytyczną różnicę szczepów w sekwencji aminokwasowej mysiego NKCC2, która wpływa na wykrywanie, a tym samym analizę fosforylacji i regulacji NKCC2. Nowo opracowane przeciwciało pT96 NKCC2 omija to techniczne zastrzeżenie i umożliwia niezawodne wykrywanie zmienionej fosforylacji NKCC2 niezależnie od tła genetycznego modeli mysich. Co więcej, nasze badanie ponownie podkreśla, że ​​podczas analizy modeli mysich należy wziąć pod uwagę różnice genetyczne.

MATERIAŁY I METODY

Zwierząt,Samce myszy o dopasowanym wieku (6- 8 tygodnie) były albo ze szczepów wsobnych 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, dalej określanych jako 129Sv i C57BL/6, albo mieszanym szczepem hybrydowym 129S/B6 w pokoleniu F2. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze szwajcarskimi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zatwierdzone przez administrację weterynaryjną kantonu Zurych w Szwajcarii (Licencje: 141/2014, 185/2017 i 135/2018). Myszy poddano genotypowaniu pod kątem usunięcia 15 zasad przy użyciu standardowego PCR ze starterami przedstawionymi w Tabeli S3. Pełnej długości (f/f) NKCC2 ma oczekiwany produkt PCR o długości 87 pz, podczas gdy oczekiwana sekwencja delecji NKCC2 (Δ/Δ) ma 70 pz.

Przetwarzanie tkanekMyszy znieczulano kombinacją izofluranu (2 procent - 4 procent, 0,5 l/min; Provet; CH) i Temgesic (Buprenorfina; 0.05- 0. 4 mg/kg masy ciała; Indivor; CH). Do analizy biochemicznej myszy znieczulono i poddano perfuzji przez lewą komorę serca roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Zebrano nerki i dystalne okrężnice, szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -8 0 stopniu do dalszej obróbki. Do celów immunohistochemicznych nerki utrwalano przy użyciu 3% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4, 300 mOsm) przez perfuzję wsteczną głęboko znieczulonej myszy przez aortę brzuszną, a następnie krótkie płukanie 0,1 M buforem fosforanowym (0,2 M NaH2PO4 x H2O, 0,2 M NaH2PO4 x 2H2O, 0,1 M CaCl2). Następnie nerki usunięto, pokrojono na kawałki i zamrożono w płynnym propanie i przechowywano w temperaturze -80 stopni.

Metaboliczne badania klatkowePo przystosowaniu do klatek metabolicznych (Techniplast), myszy trzymano w klatkach metabolicznych przez cztery kolejne dni ze swobodnym dostępem do wody z kranu i standardowej karmy laboratoryjnej (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Masę ciała, spożycie pokarmu i wody odnotowywano codziennie, a po 24 godzinach zbierano mocz i kał.

Protokół ograniczenia wodyMyszy trzymano przez 24 godziny w klatkach metabolicznych (Techniplast) bez dostępu do wody wodociągowej. Standardowy proszek karmy laboratoryjnej (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) zmieszano z wodą 1:1, zebrano i analizowano mocz i kał po 24 godzinach. Po 24 godzinach myszy ponownie umieszczono w normalnych klatkach (T2L (IVC), LASC, UZH).

Pomiary biochemiczneStężenia Na plus , K plus , Ca2 plus w moczu analizowano metodą fotometrii płomieniowej (EFOX 5053, Eppendorf). Stężenia Mg2plus w moczu i osoczu zmierzono w Zurich Center for Integrative Rodent Physiology za pomocą systemu(-ów) SYNCHRON LX®, UniCel® DxC 800 Synchron® System i Multi Calibrator systemu Synchron®. Stężenie kreatyniny w moczu oznaczano metodą Jaffe. Gazometria i stężenie jonów mierzono w heparynizowanej krwi pełnej za pomocą analizatora gazometrii ABL825Flex (radiometr) bezpośrednio po pobraniu krwi z żyły głównej. Poziomy aldosteronu w osoczu i stężenie uromoduliny (UMOD) w moczu mierzono za pomocą dostępnych w handlu zestawów ELISA (odpowiednio zestaw Aldosterone ELISA firmy Cayman; #501090 i zestaw Mouse Uromodulin ELISA firmy Abcam; ab245726).

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

RNA wyizolowano z nerek i dystalnej części okrężnicy przy użyciu zestawu do izolacji SV total RNA (PROMEGA). Równe stężenia wyizolowanego RNA (250 ng w 129Sv vs C57BL/6 lub 500 ng w f/f, Δ/Δ i f/Δ) poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA za pomocą zestawu GoScript™ Reverse Transcriptase (PROMEGA). Wytworzone cDNA dalej rozcieńczano wodą wolną od DNAzy/RNAzy (1:5). Startery zostały zaprojektowane do ilościowej oceny całkowitego Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g i Kcnj1 (Tabela S3). Ilościową analizę PCR przeprowadzono przy użyciu LightCycler® 480 (Roche) w celu pomiaru poziomów ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. Względną ekspresję genu obliczono metodą delta Ct, stosując jako gen odniesienia p-aktynę.

Analiza Western blotNerki homogenizowano w niezawierającym detergentów buforze do lizy (DFLB) zawierającym 200 mM mannitolu, HEPES [4- (2-hydroksyetylo)- 1piperazynoetanosulfonowy kwasy] 80 mM, wodorotlenek potasu 41 mM, inhibitory proteazy (Complete Ultra, Roche) i inhibitory fosfatazy (PhosSTOP, Roche) przy użyciu 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) w homogenizatorze tkankowym Precellys 24 (Bertin Instruments, Montignyle- Bretonneux). Perełki sedymentowano przez wirowanie przez 10 minut (1987 rcf), a supernatant zawierający białko przechowywano w jednorazowych porcjach w temperaturze -80 stopni. Do analizy Western blot, 50 µg białka zdenaturowano w buforze Laemmli, rozdzielono metodą SDS-PAGE z użyciem 8% - 12% żeli, a następnie przeniesiono na błony nitrocelulozowe. Nieswoiste miejsca wiązania zablokowano przy użyciu 1x Odyssey Blocking Solution (Li-COR Biosciences) przed inkubacją błon z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Tabela S4) rozcieńczonymi w 0,2x Odyssey Blocking Solution w 4 stopniach przez 12 godzin. Po przemyciu w PBS- 0.1% Tween, błony inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi (kozie-przeciwkrólicze IRDye 800 lub kozie-przeciw-mysi barwnik IR 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences) rozcieńczony w 0,1x buforze blokującym kazeinę (Sigma). Wykryte prążki wizualizowano za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni Odyssey (Li-COR Biosciences). W celu zapewnienia równego obciążenia białka, membrany wybarwiono jednocześnie przeciwciałem przeciwko aktynie lub wybarwiono białko całkowite przy użyciu REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences) przed wykryciem przeciwciała. Prążki immunoreaktywne oznaczono ilościowo na Fidżi (ImageJ) i znormalizowano odpowiednio względem sygnału aktyny lub barwienia REVERT Total protein.

ImmunohistochemiaSkrawki kriostatu (grubość 4 µm) zablokowano pod kątem niespecyficznego wiązania przeciwciał z 10% normalną surowicą kozią, a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi (Tabela S4)

noc w 4 stopniach . Po przemyciu 1X PBS szkiełka inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi (Cy3 – skoniugowane kozie – anty-królicze IgG, numer produktu 111- 165- 144, 1:1000 i FITC – skoniugowane kozie – anty-mysie IgG , numer produktu 115- 095- 068, odpowiednio 1:100, oba z Jackson Immuno Research Laboratories) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Wszystkie przeciwciała rozcieńczono w 1% BSA/1xPBS. Jądra komórkowe barwiono DAPI (4′,6-diamidyno- 2-fentylindol, Sigma-Aldrich, Co.) w stężeniu 0,1 µg/ml. Obrazowanie wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) z monochromatyczną cyfrową kamerą fluorescencyjną Leica DFC350 FX (Leica Microsystems, 35578). Obrazy zostały przetworzone na Fidżi (ImageJ).

Wytwarzanie oczyszczonego przez powinowactwo króliczego anty-mysiego przeciwciała pT96 NKCC2Wytwarzanie przeciwciał zostało przeprowadzone przez serwis przeciwciał Pineda (Berlin, Niemcy). Króliki immunizowano fosfopeptydem zawierającym aminokwasy 105- 114 z mysiej sekwencji NKCC2 C57BL/6 (NH2-YYLQ(p)TMDAVCOOH). Monospecyficzną frakcję IgG oczyszczono przez powinowactwo wobec fosfopeptydu, a następnie wstępnie zaabsorbowano z defosfopeptydem, otrzymując frakcję przeciwciał specyficzną dla fosfoformy. Swoistość przeciwciał tej frakcji zbadano za pomocą immunohistochemii i analizy Western blot (Figura 5 i Figura S4).

Leczenie fosfataząLizaty białkowe inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C z cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną (CIAP) (1 U/1 µg białka) w celu wywołania hydrolizy 5'-fosforanowych grup ufosforylowanych białek, co hamowało specyficzne wiązanie pT96 Przeciwciało NKCC2 wobec białek na membranie Western blot z nitrocelulozy (Figura 5B). Wykorzystano zarchiwizowane zatopione w parafinie nerki od myszy C57BL6. Traktowanie skrawków fosfatazą alkaliczną z jelita cielęcia (Sigma Aldrich) przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem z niewielkimi modyfikacjami. 56 Po zablokowaniu wolnych grup aldehydowych skrawki płukano pięciokrotnie w buforze fosfatazy alkalicznej (100 mm Tris, 50 µm CaCl2, 0,1 mm MgCl2, 8,4 µm leupeptyny, 4 mm Pefablock, pH 9,0). Później skrawki inkubowano w buforze fosfatazy alkalicznej z lub bez fosfatazy alkalicznej cielęcej (~130 jednostek/ml) w inkubatorze w temperaturze 35 stopni przez 2 godziny. Następnie przeprowadzono badania immunohistochemiczne i mikroskopię świetlną, jak opisano szczegółowo. 57

Dopasowanie sekwencji aminokwasówSekwencje aminokwasowe dla różnych gatunków i szczepów myszy uzyskano z otwartej bazy danych „Ensembl Genome Browser” (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 Źródła identyfikatorów transkryptów są wymienione w Tabeli S1. Sekwencje zostały dopasowane przy użyciu Qiagen © CLC Main Workbench 20.

Plastry nerekNerkaskrawki myszy C57BL/6 zastosowano do doświadczeń ex vivo, jak opisano wcześniej. 12 W skrócie, myszy pościły przez noc ze swobodnym dostępem do wody, aby uniknąć jakichkolwiek potencjalnych skutków spożycia jonów w diecie na poziomy fosforylacji NKCC2 i NCC. Nerki usunięto znieczulonym zwierzętom, pocięto na plastry o grubości 280 µm za pomocą wibrującej krajalnicy (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) i umieszczono w roztworze Ringera (w mM): 98,5 NaCl, 25 NaHCO 3 , 3 KCl, 1 Na 2 HPO 4 , 2,5 CaCl 2 , 1,8 MgCl 2 i 25 glukozy przez 30 minut w temperaturze 30,5 stopnia z ciągłym bulgotaniem 95% O 2 i 5% CO 2 . Następnie roztwór Ringera został zastąpiony podobnymi roztworami, ale z różnymi stężeniami Cl − (5 mM dla niskiego Cl − , 110 mM dla normalnego Cl − ) i K plus (3 mM dla normalnego K plus , 10 mM dla wysokiego K plus ) dla dodatkowe 30 minut. Na koniec plastry szybko zamrożono w ciekłym azocie.

StatystykaDo porównania dwóch grup zastosowano niesparowany test t-Studenta i test Welcha w przypadku nierównych wariancji (GraphPad Prism, wersja 8.0.2). Dla wielokrotnych porównań przeprowadzono jedno- lub dwukierunkową analizę ANOVA, a następnie wielokrotny test porównawczy Tukeya (GraphPad Prism, wersja 8.0.2). Dane są wyświetlane jako średnie ± SEM (w tabelach i na rysunkach). Różnice uznawano za istotne, gdy P <>

PODZIĘKOWANIE  Autorzy dziękują dr Gary Shull (University of Cincinnati, Cincinnait, OH) za dostarczenie myszy NCC-KO, dr Biff Forbush (Yale School of Medicine, New Haven, CT) za jego przeciwciało „R5” pNKCC1 oraz dr Henrik Dimke ( University of Southern Denmark, Odense, Dania) dla jego mysiego monoklonalnego całkowitego przeciwciała NCC. Autorzy dziękują również Monique Carrell i Inger Merete Paulsen za pomoc techniczną oraz dr Eszter Banki za zapewnienienerkapróbki. Pomiary gęstości mineralnej kości oraz część analizy moczu i osocza zostały wykonane odpowiednio przez dr Petrę Seebeck i Nadine Nägele (Zurich Integrative Rodent Physiology, University of Zurich). Bardzo ceniony był bardzo pomocny wkład dr Alicii McDonough (Uniwersytet Południowej Kalifornii) i Dr Olivier Devuyst (Uniwersytet w Zurychu).

KONFLIKT INTERESÓW Grupa JL otrzymuje tantiemy za licencjonowane przeciwciała przeciwko NCC i fosforylowane Nedd4- 2 odpowiednio od Milipore i Abcam. W obecnym badaniu nie zastosowano obu przeciwciał. Ponadto JL otrzymał w 2019 roku honorarium od VIFOR za ustną prezentację na sympozjum organizowanym przez VIFOR.