Nanocząsteczka ukierunkowana na nerki zwiększająca gęstość limfatyczną nerek obniża ciśnienie krwi u myszy z nadciśnieniem

1. Wstęp

Identyfikacja składników żywności o właściwościach immunomodulacyjnych wraz z ich odpowiednimi celami molekularnymi cieszy się w ostatnich latach coraz większym zainteresowaniem. Ze względu na dużą różnorodność ligandów nadrodzina kanałów jonowych (kanały TRP) potencjału receptora przejściowego stanowi bardzo interesującą klasę potencjalnych struktur docelowych.

Nadrodzina kanałów TRP ssaków obejmuje sześć pokrewnych rodzin białek, mianowicie rodzinę ankyryn (TRPA), kanoniczną (TRPC), melastatynę (TRPM), mukolipinę (TRPML), policystynę (TRPP) i rodzinę waniloidów (TRPV), wszystkie z nich które zazwyczaj mają sześć segmentów transbłonowych, które łączą się jako tetramery, tworząc przepuszczalne dla kationów pory o różnej selektywności kationowej.[1]Kanał TRPV1 może być zdecydowanie najintensywniej badanym członkiem nadrodziny TRP. TRPV1 został początkowo zidentyfikowany jako receptor kapsaicyny, ostrego składnika papryczek chili.[2] Później wykazano, że również ostre składniki imbiru, gingerole, aktywują TRPV1.[3]

KLIKNIJ TUTAJ, ABY POBRAĆ ZIOŁOWY CISTANCHE NA NERKI

Biologiczna rola TRPV1 w komórkach nieneuronalnych jest nadal przedmiotem szeroko zakrojonych badań, jednak dostępne wyniki sugerują, że funkcje te wykraczają daleko poza percepcję zmysłową i termiczną. Na przykład 12-tygodniowa interwencja z dzienną dawką 0 0,15 mg noniwamidu, agonisty TRPV1, strukturalnego analogu kapsaicyny, zapobiegało wywołanemu dietą przyrostowi masy tkanki tłuszczowej i zwiększeniu poziomu serotoniny w osoczu u zdrowych osób z nadwagą.[4]

W adipocytach 3T3-L1 aktywacja TRPV1 przez noniwamid zmniejszała akumulację lipidów podczas różnicowania i dojrzewania poprzez tłumienie ekspresji PPAR𝛾.[5] W makrofagach kapsaicyna i noniwamid osłabiały indukowane przez LPS uwalnianie cytokin prozapalnych, takich jak IL6, CXCL8 i TNF-alfa, w sposób zależny od TRPV1-.[6] Jednak szczególne funkcje TRPV1 w leukocytach ludzkiej krwi pozostają niejasne. W ludzkich komórkach NK 10 i 50 µM kapsaicyny indukowały wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+, co wskazuje na funkcjonalny kanał TRPV1.[7]

Jednakże osłabione funkcje efektorowe komórek NK, takie jak degranulacja cytotoksyczna i wydzielanie cytokin, indukowane przez wstępne traktowanie komórek kapsaicyną przez 1 godzinę w zakresie stężeń 10–100 μM, były w dużej mierze niezależne od TRPV1.[7] Udokumentowano, że w komórkach T TRPV1 bierze udział w procesach sygnalizacji receptora komórek T, proliferacji i różnicowaniu komórek T, a także wytwarzaniu cytokin.[8] Poprzednia praca naszej grupy również wykazała funkcjonalną ekspresję TRPV1 w ludzkich pierwotnych limfocytach T.[9] Ponadto analizy odpowiedzi na dawkę dla stężeń w zakresie od 0,03 do 300 μmol L-1 wykazały, że [6]-gingerol hamuje wydzielanie cytokin przez pierwotne ludzkie leukocyty przy wartości IC50 wynoszącej 82,2 μmol L-1.

Jednakże oznaczenie ilościowe [6]-gingerolu w próbkach osocza zdrowych osób wykazało średnie maksymalne stężenie w osoczu wynoszące zaledwie 42,0 ±16,3 nmol L-1 po spożyciu 1 l herbaty imbirowej. Ponieważ te stężenia [6]-gingerolu nie miały istotnego wpływu na wydzielanie cytokin we wcześniejszych badaniach, [9] nie jest jasne, czy po spożyciu 1 l herbaty imbirowej w osoczu krwi osiąga się odpowiednie dla diety stężenie 50 nmol L-1 , jest wystarczająca do modulowania komórkowej odpowiedzi immunologicznej w innych ludzkich pierwotnych leukocytach.

W przypadku ludzkich neutrofili wiedza na temat funkcjonalnej roli TRPV1 jest ograniczona. Podczas gdy Köse i Nazıroglu˘ [10] wykazali przepływ Ca2+- w neutrofilach w odpowiedzi na 10 µM kapsaicyny zmniejszany przez antagonistę TRPV1, kapsazepinę, inne wyniki nie wykazały, że kapsaicyna indukuje napływ Ca2+ przy badaniu w stężeniu zakres 1–100 µM, pomimo wykrywalnej ekspresji TRPV1RNA.[11]

Neutrofile to najliczniejsze leukocyty w ludzkiej krwi, stanowiące 60–70% wszystkich krążących białych krwinek. Są to pierwsze komórki odpornościowe rekrutowane do miejsc zakażenia; dlatego często określa się je jako pierwszą linię obrony.[12] Rekrutację neutrofili wyzwalają między innymi orchemokiny bakteryjne lub peptydowe N-formylometionino-leucylo-fenyloalanina (fMLF), takie jak CXCL8 (IL-8).[13]

Mechanizmy obronne neutrofili obejmują fagocytozę[14], uwalnianie enzymów przeciwdrobnoustrojowych poprzez degranulację[15] wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS)[16] i tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili.[17]Oprócz tych bezpośrednich mechanizmów obronnych, neutrofile dodatkowo przyczyniają się do kolejnych odpowiedzi immunologicznych poprzez uwalnianie różnych cytokin i chemokin.[18] Ponadto neutrofile mogą przejść proces inicjowania, który umożliwia im silniejszą reakcję na późniejszą pełną aktywację.[16b]

W ostatnich latach przybyło dowodów na to, że składniki roślin spożywczych i leczniczych mogą modyfikować jedną lub więcej z wymienionych reakcji obronnych ludzkich neutrofili. Modyfikacje te obejmują zwiększoną aktywność fagocytotyczną[19] i wytwarzanie ROS[20] zwiększoną chemotaksję w kierunku fMLF[21] i tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili.[20] Jednakże nie zidentyfikowano aktywnego związku(ów). Składniki Ferula akitschkensis (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranylaceton, octan andizobornylu) znieczulały neutrofile na indukowany fMLF i CXCL8-napływ Ca2+ i hamowały chemotaksję indukowaną fMLF, przy czym indukowany geranylacetonem w efektach pośredniczył TRPV1.[22]

W oparciu o dostępne dane postawiliśmy hipotezę, że indukowana ligandem aktywacja TRPV1 przez [6]-gingerol może wpływać na ogólne funkcje neutrofili, bezpośrednio lub poprzez wzmocnienie ich odpowiedzi na bodźce aktywujące. W ramach tej hipotezy w szczególności staraliśmy się wyjaśnić, czy zweryfikowane stężenie istotne pod względem odżywczym jest wystarczające do modulowania komórkowej odpowiedzi immunologicznej w ludzkich pierwotnych neutrofilach jako części populacji leukocytów. '

Ponadto staraliśmy się porównać poziomy ekspresji RNA wszystkich członków nadrodziny TRP ssaków w pięciu najważniejszych typach komórek w ludzkiej krwi, aby uzyskać jakościowo i ilościowo kompleksowy przegląd ekspresji kanałów TRP w ludzkich leukocytach.

2. Wyniki

2.1. Obfitość i względne poziomy transkrypcji kanałów TRP w ludzkich leukocytach

W celu oceny ekspresji RNA kanałów TRP w leukocytach krwi, z krwi zdrowych dawców wyizolowano pięć najważniejszych typów komórek leukocytów i analizowano ekspresję RNA kanałów TRP za pomocą ilościowej metody RT-PCR (ryc. 1).

Specyficzne transkrypty TRPV, jak również rodziny TRPM, wykryto z dużą częstością 75–100% we wszystkich analizowanych typach komórek. Średnia ogólna częstotliwość, biorąc pod uwagę wszystkie typy komórek, wyniosła 96% dla rodziny TRPV i 98% dla rodziny TRPM. Transkrypty specyficzne dla TRPC były znacznie mniej liczne, wahając się od 0% w monocytach, komórkach NK, komórkach T i komórkach B do 100% w komórkach NK i komórkach T, przy ogólnej średniej częstości wynoszącej zaledwie 53% (ryc. 1A). Transkrypt specyficzny dla TRPC5-wykryto jedynie w innychutrofilach, z częstotliwością 70%.

Ponadto transkrypt specyficzny dla TRPA1- ogólnie ujawnił raczej niską liczebność analizowanych typów komórek z częstotliwością 100% w neutrofilach, 25% w monocytach, 80% w komórkach NK, 100% w komórkach T i 60% w Komórki B. Podobnie transkrypt specyficzny dla TRPML3-wykazywał niską częstotliwość w neutrofilach (50%), monocytach (25%), komórkach NK (40%) i komórkach B (20%), ale częstotliwość 100% w Komórki T. Transkrypt specyficzny dla TRPV1-wykryto we wszystkich typach komórek, wykazując częstotliwość 100% w monocytach, komórkach NK i komórkach T oraz częstotliwość 90% w neutrofilach i 80% w komórkach B.

Jeśli chodzi o względną ekspresję RNA, w porównaniu z odpowiednimi częstotliwościami, kanały TRP ujawniły wzór ekspresji bardziej specyficzny dla typu komórki, jak widać przez porównanie odpowiednich wartości Δct w różnych analizowanych typach komórek (Figura 1B). Na przykład TRPP3 wykryto z częstotliwością 100% we wszystkich typach komórek, ale wyraźnie stwierdzono najwyższy poziom ekspresji w monocytach.

Natomiast kanał TRPV2 wykryto we wszystkich badanych typach komórek, przy porównywalnie wysokim poziomie ekspresji RNA, a także wysokiej częstotliwości. Podobnie poziomy transkryptu TRPV1 były podobne we wszystkich badanych typach komórek (Figura 1B).

2.2. Ekspresja powierzchniowa TRPV1 na neutrofilach

Obecna wiedza na temat funkcji TRPV1 w ludzkich neutrofilach jest nadal niejasna. Aby dokładniej zbadać rolę TRPV1 w ludzkich neutrofilach, zbadaliśmy następnie, czy kanał TRPV1 ulega ekspresji na powierzchni pierwotnych ludzkich neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej żywych komórek (ryc. 2).

Wyizolowane neutrofile barwiono pod kątem CD15 jako markera powierzchniowego neutrofili (ryc. 2A, B) i jednocześnie albo barwiono przeciwciałem skierowanym przeciwko epitopowi w pierwszej pętli zewnątrzkomórkowej białka TRPV1 (ryc. 2B), albo odpowiednią kontrolą izotypową, przy czym ta ostatnia służyła jako surogat do pomiaru nieswoistego wiązania (ryc. 2A). W populacji CD15+ analizowano intensywność fluorescencji FITC. Barwienie neutrofili przeciwciałem TRPV1 doprowadziło do wyraźnie rozróżnialnego sygnału fluorescencji w porównaniu z kontrolą izotypową, potwierdzając w ten sposób powierzchniową ekspresję TRPV1 w pierwotnych ludzkich neutrofilach (Figura 2C). Analiza neutrofili od czterech indywidualnych dawców ujawniła porównywalną ekspresję powierzchniową TRPV1 (Figura 2D).

2.3. [6]-Gingerol indukowany wzrostem wewnątrzkomórkowego Ca2+

Ponieważ indukowana ligandem aktywacja TRPV1 spowoduje napływ Ca2+, [23] wewnątrzkomórkowe stężenia Ca2+ w neutrofilach oznaczono za pomocą barwnika Fura2+-wrażliwego na Ca-2. Na podstawie naszych wcześniejszych ustaleń[9] wybrano stężenie 50 nM dobrze znanego ligandu TRPV1 [6]-gingerolu i czas inkubacji 2 godziny. Analizy wykazały, że inkubacja neutrofilów z 50 nM [6]-gingerolem spowodowała zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+, które wynosiło średnio 18,4% ± 1,0% wartości maksymalnej, określonej przez zastosowanie 1 μM jonoforeionomycyny. Wzrost wywołany DMSO wyniósł 4,7% ± 1,2% (Rysunek 3).

2.4. Wpływ [6]-Gingerolu na ekspresję TRPV1

Następnie chcieliśmy przeanalizować wpływ stymulacji TRPV1 przez [6]-gingerol na ekspresję TRPV1 na poziomie transkryptu za pomocą q-RTPCR, jak również na poziomie białka powierzchniowego poprzez barwienie żywych komórek. W tym celu ludzkie neutrofile inkubowano z 50 nM [6]-gingerolem przez 2 godziny i określano ilościowo odpowiednie poziomy ekspresji.

Ta 2-godzinna inkubacja nie miała wpływu ani na poziom transkryptu TRPV1, ani na białko (Figura 4), a także nie uległa zmianie, z wyjątkiem IL6, IL17A, IL24, C5 i GDF5, badanej ekspresji RNA powszechnych genów cytokin i chemokin (Rysunek S1, Tabela S2 ,Informacje dodatkowe).

2.5. Wpływ [6]-Gingerolu na ekspresję markerów powierzchniowych neutrofilów

Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kup więcej szczegółów specyfikacji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

POBIERZ NATURALNY ORGANICZNY EKSTRAKT Z CISTANCHE Z 25% ECHINAKOZYDEM I 9% AKTEOZYDEM