Nierandomizowane badanie badające wpływ spożycia brązowego ryżu na mikroflorę jelitową, uwagę i krótkotrwałą pamięć roboczą u tajskich dzieci w wieku szkolnym, część 2

2.4. Ilościowa analiza mikroflory kałowej

Próbki kału pobrano od dzieci na początku badania, w 4., 15., 56. i 61. tygodniu oraz w 71. tygodniu w sterylizowanych pojemnikach i natychmiast zamrożono w temperaturze -80°C. Ekstrakcję mikrobiologicznego DNA i ilościowy pomiar bezwzględnej obfitości mikrobioty kałowej przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [29].

Związek między miarami ilościowymi a pamięcią jest tematem wartym zbadania. W przypadku wielu problemów życiowych problemy z pamięcią często dokuczają ludziom, np. niemożność zapamiętania ważnych rzeczy, zapominanie o terminach spotkań itp. W tej chwili ilościowe metody pomiaru mogą pomóc nam zrozumieć sytuację pamięci i wprowadzić ukierunkowaną poprawę .

Ilościowe metody pomiaru mogą określić ilościowo pamięć ludzi za pomocą środków naukowych. Na tej podstawie zaproponowano konkretne i skuteczne metody treningu pamięci. W życiu codziennym możemy również stosować proste metody ćwiczenia pamięci, takie jak zapamiętywanie słów, poezji itp. Są to skuteczne sposoby na rozwijanie dobrej pamięci.

Jednocześnie możemy poprawić pamięć we wszystkich aspektach życia. Na przykład, jeśli chcemy zapamiętać nowe słowo ze słownika, możemy je przeczytać kilka razy, zapisać je kilka razy lub powiązać z jego znaczeniem, dzięki czemu pamięć będzie głębsza.

W dobie eksplozji informacji często czujemy się przytłoczeni informacją. Często musimy pamiętać o wielu rzeczach, ale nie wiemy, jak sobie z tymi informacjami poradzić. W tej chwili możemy użyć ilościowych metod pomiaru, aby określić stan naszej pamięci, a następnie trenować i doskonalić się w oparciu o określone sytuacje. Dzięki rozsądnym metodom zapamiętywania możemy skutecznie poprawić naszą pamięć i zapewnić większą wygodę w naszym życiu i pracy.

Krótko mówiąc, związek między pomiarem ilościowym a pamięcią jest nierozerwalny. Musimy zastosować metody naukowe, aby odkryć warunki naszej pamięci, a następnie przeprowadzić skuteczny trening w oparciu o konkretne sytuacje. Wierzę, że jeśli będziemy wytrwale ćwiczyć, uda nam się wzmocnić pamięć i poprawić jakość życia. Widać, że trzeba poprawić pamięć, a Cistanche desericola potrafi znacząco poprawić pamięć, bo Cistanche desericola potrafi także regulować równowagę neuroprzekaźników, np. zwiększać poziom acetylocholiny i czynników wzrostu. Substancje te są bardzo ważne dla pamięci i uczenia się. Ponadto mięso może również poprawić przepływ krwi i promować dostarczanie tlenu, co może zapewnić mózgowi wystarczającą ilość składników odżywczych i energii, poprawiając w ten sposób witalność i wytrzymałość mózgu.

Kliknij Poznaj suplementy, aby zwiększyć pamięć

W skrócie, genomowy DNA drobnoustroju ekstrahowano z próbek kału przy użyciu zestawu innuPREP Stool DNA Kit (Analytik Jena Biometra, Jena, Niemcy), a stężenie i czystość DNA określono przy użyciu płytki Take 3Micro-Volume Plate (Biotek, Winooski, VT, USA).

Następnie określono ilościowo bezwzględną liczebność genów rRNA mikrobioty 16 za pomocą qPCR przy użyciu cyklerów termicznych Real-Time Thermal CyclersCFX96 TouchTM (Bio-Rad, Singapur) w oparciu o specyficzne startery przedstawione w tabeli S1.

Warunki qPCR i ocenę liczby kopii mikrobioty przeprowadzono zgodnie z poprzednim protokołem [37]. Log10 liczby kopii 16S rRNA na gram mokrego kału przedstawiono w naszych danych uzupełniających.

2.5. Analiza statystyczna

Rozkład danych zbadano za pomocą testu Shapiro – Wilka i testu Levene’a (pakiet statystyk w wersji 4.0.3). Do wizualizacji danych wykorzystano pakiet R ggplot2 [38]. Korektę wartości p Benjamina-Hochberga (BH) zastosowano do korekty wartości q testów wielokrotnych. Istotność określono przy q < 0.05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono w programie R w wersji 4.0.3 [39].

Różnice w średniej bezwzględnej liczebności mikroflory jelitowej pomiędzy grupami interwencyjnymi dla każdego punktu czasowego określono za pomocą testu t lub testu sumy rang Wilcoxona zgodnie z normalnością rozkładu danych.

Zmiany w mikroflorze jelitowej pomiędzy punktami czasowymi każdej fazy (w obrębie osobników) oceniano za pomocą testów t dla par lub testów rang ze znakiem Wilcoxona po istotnych wynikach z jednokierunkowej powtarzalnej analizy ANOVA lub testu Friedmana (p < 0,05 ). Zmiany w bezwzględnej liczebności mikrobioty jelitowej pomiędzy tygodniami wyrażono jako zmiany krotności transformacji log2 (Log2FC).

Zależności pomiędzy bezwzględną liczebnością mikroflory jelitowej a wiekiem dzieci w wieku szkolnym określono za pomocą współczynnika korelacji rang Pearsona lub Spearmana.

Związek między mikroflorą jelitową a interwencją w każdym punkcie czasowym, po uwzględnieniu zmiennych demograficznych (wiek, płeć, BMI z-score, sposób porodu, akt urodzenia i pochodzenie etniczne), oceniano za pomocą permutacyjnej wieloczynnikowej analizy wariancji (PERMANOVA) przy użyciu funkcji Adonisa . Aby zbadać wpływ interwencji na przestrzeni tygodni każdej fazy, przeprowadzono badanie PERMANOVA, wykorzystując uczestników jako warstwy i korygując współzmienne. Warunek jednorodności na podstawie odległości euklidesowej zmierzono za pomocą funkcji betadyny.

Permutację przeprowadzono przy 999 w pakiecie R wegańskie(2.6-2) [40]. Następnie określiliśmy wpływ interwencji na mikroflorę jelitową, stosując analizę redundancji (RDA) z uwzględnieniem współzmiennych.

Terapie wykorzystano jako ograniczone zmienne objaśniające, a bezwzględną liczebność mikroflory jelitowej jako zmienne odpowiedzi. Znaczenie ograniczeń oceniono za pomocą testu permutacji typu ANOVA (permutacja=999). Krokowego doboru zmiennych objaśniających dokonano za pomocą funkcji schodkowej opartej na kryteriach AIC.

Wyniki poznawcze pomiędzy grupami interwencyjnymi w każdym tygodniu porównywano za pomocą testu t Welcha dla dwóch prób lub testu sumy rang Wilcoxona. Różnicę w wynikach poznawczych na przestrzeni tygodni każdej fazy (w obrębie badanych) określono za pomocą testu rang ze znakiem Wilcoxona po istotnych wynikach testu Friedmana (p < 0,05).

Wykorzystaliśmy RDA do określenia wpływu interwencji na wyniki poznawcze dzieci w wieku szkolnym, uwzględniając wiek i płeć. Wpływ punktów czasowych na liczebność mikroflory jelitowej oceniano również za pomocą RDA, wykorzystując uczestników jako warstwy.

Warunki RDA przebiegały jak opisano powyżej. Aby określić związek między wydajnością poznawczą a mikroflorą jelitową, wykorzystaliśmy współczynnik korelacji rang Spearmana.

Przeprowadzono analizę wieloczynnikową (MFA) w celu zbadania różnic w mikroflorze jelitowej, które można wytłumaczyć interwencją i zmiennymi gospodarza (wiek i płeć) przy użyciu programu FactoMine R w wersji 2.4 [41] i wizualizacji za pomocą programu Factoextra w wersji 1.0. 7 [42].

3. Wyniki

3.1. Charakterystyka dzieci w wieku szkolnym

Po kontroli jakości danych (ryc. 1) przeanalizowaliśmy pozostałe 85 i 57 dzieci odpowiednio w fazie I i II. Dzieci na początku badania miały średnio 7,02 i 10,52 lat odpowiednio w grupach WR i SLR.

Wyjściowa charakterystyka grup kontrolnych i interwencyjnych różniła się istotnie pod względem wieku (p < {{0}}.0001), masy ciała (p < 0,0001), wzrostu (p < 0,0001), BMI z- wynik (p=0,03) i rodzaj karmienia (p=0,02) (Tabela S2).
Podobny wzorzec zaobserwowano również we wszystkich punktach czasowych badania, z wyjątkiem BMI, które nie różniło się istotnie pomiędzy grupami w 71. tygodniu (tabele S3–S7).

3.2. Wpływ interwencji ryżu Sinlek na mikroflorę jelitową dzieci w wieku szkolnym

Biorąc pod uwagę każdy z punktów czasowych, nie było znaczących różnic w bezwzględnej liczebności mikroflory jelitowej pomiędzy grupą kontrolną (WR) a grupą interwencyjną Sinlek (SLR) w pierwszej fazie interwencji (faza I; wartość wyjściowa, tydzień 4 i tydzień 15). ).

Porównania wielowymiarowe przy użyciu PERMANOVA (na marginesie) wykazały również, że interwencja w fazie I nie miała znaczącego wpływu na zmiany w mikroflorze jelitowej po uwzględnieniu zmiennych demograficznych (plik uzupełniający S1).

Następnie ustaliliśmy związek między liczebnością mikroflory jelitowej a wiekiem i odkryliśmy, że bakterie Lactobacillus były ujemnie skorelowane z wiekiem na początku badania (korelacja Pearsona; R {{0}} −0,24, p {{ 3}}.026) i tydzień 4 (korelacja Pearsona; R=-0,3, p=0,002) (ryc. 2b, d). Jednakże w drugiej fazie interwencji (faza II) zmiany w liczebności drobnoustrojów zaznaczono w 61. i 71. tygodniu. Liczebność bakterii ogółem (q= 0.032) i Firmicutes (q= 0.032 ) uległy znacznemu zwiększeniu, podczas gdy poziom Gammaproteobacteria (q <0,0001) znacznie się obniżył po interwencji SLR w 61. tygodniu (ryc. 2e – g).

Bakterie te były również istotnie powiązane z wiekiem, gdzie stwierdzono liczebność bakterii ogółem (korelacja Pearsona; R {{0}} −0.32, p=0.0 15) i Firmicutes (korelacja Pearsona; R=-0,32, p=0,014, ryc. 2h) malała wraz ze wzrostem wieku, podczas gdy bezwzględna liczebność Gammaproteobacteria była dodatnio skorelowana z wiekiem (korelacja Pearsona; R { {11}},62, p < 0,0001, ryc. 2i).

W 71. tygodniu poziom Bacteroidetes był znacząco obniżony w grupie SLR (q < 0.0001) (ryc. 2j), a jego liczebność była dodatnio skorelowana z wiekiem (korelacja rang Spearmana; R { {4}},57, p < 0,0001, ryc. 2l).

Biorąc pod uwagę zmiany w liczebności mikroflory jelitowej na przestrzeni tygodni (w obrębie osobników) w grupach kontrolnych i interwencyjnych, zaobserwowaliśmy podobne wzorce w obu grupach uczestników. Wydawało się, że Gammaproteobacteria ulega dużym wahaniom po interwencji: jej liczebność znacznie spadła w tygodniu 4 i 61 (ryc. 3a, b, S1c i S2c, plik uzupełniający S2).

Poziom tych bakterii zdawał się jednak powracać w punkcie końcowym każdej fazy (tydzień 15. i tydzień 71.). Co więcej, liczebność Bacteroidetes w grupie SLR była niższa w 71. tygodniu w porównaniu z 56. i 61. tygodniem (ryc. 3a i S2e). Podczas fazy II zaobserwowano również stopniowy spadek liczebności dwóch taksonów drobnoustrojów, mianowicie Ruminococcus i Bacteroides, przy czym ich liczebność była najniższa w punkcie końcowym badania (tydzień 71) (ryc. 3b i S2f, g), niezależnie od interwencji.

Ponadto oceniliśmy, czy istniały różnice w liczebności mikroflory jelitowej pomiędzy zabiegami i na przestrzeni tygodni, wykorzystując uczestników jako warstwy. PERMANOVA wskazała, że ​​obecność leczenia i/lub punkt czasowy badania (tydzień) podczas obu faz miał znaczący marginalny wpływ na obfitość mikroflory jelitowej (p < 0.05).

Rozproszenia (wariancje) między grupami i model uwzględniający zmienne demograficzne o znaczeniu statystycznym podsumowano w pliku uzupełniającym S3. Dalej badaliśmy siłę powiązania i zmienność mikroflory jelitowej wyjaśnioną interwencją z wykorzystaniem RDA. Istotne różnice stwierdzono jedynie w fazie II.

Obfitość Gammaproteobacteria była bardziej wzbogacona w grupie kontrolnej (WR) niż w grupie SLR, podczas gdy większa całkowita liczba bakterii, Firmicutes i Bacteroidetes była powiązana z interwencją SLR w 61. tygodniu (RDA1 wyjaśnił 30,58% całkowitej wariancji, R2adj {{5} }.29,p=0.001, rysunek 3c). W 71. tygodniu liczebność Bacteroidetes była większa w grupie kontrolnej niż w grupie SLR (RDA1 wyjaśnił 8,18% całkowitej wariancji, R2adj=0.06, p=0.005, ryc. 3d) .

Następnie przystąpiliśmy do stopniowego doboru zmiennych objaśniających (zmiennych interwencyjnych i demograficznych) w oparciu o AIC. Model ujawnił, że jedynie interwencja w znaczący sposób wyjaśniała różnice w profilach mikroflory jelitowej dzieci w wieku szkolnym (q=0,035).

3.3. Wydajność poznawcza między grupami kontrolnymi i interwencyjnymi

W fazie I odkryliśmy znaczące różnice między grupami kontrolnymi i interwencyjnymi w wynikach poznawczych. Grupa SLR wykazała znacząco wyższe wyniki w teście blokowania Corsiego (określanym jako MMG, gra dopasowywania pamięci) i ogólną wydajność (OVP) w teście czujności psychomotorycznej (PVT-B), podczas gdy czas reakcji (RT) i przerwy były krótsze niż w grupie kontrolnej. grupę (Rysunek 4).

W fazie II wzorce wydajności poznawczej pozostały niezmienione. Porównaliśmy także wyniki poznawcze (w obrębie badanych) w tygodniach każdej fazy i odkryliśmy, że grupa kontrolna (faza I) radziła sobie lepiej z błędami w 15. tygodniu w porównaniu z wartością wyjściową i 4. tygodniem (q=0,02) (ryc. S3). RT był wyższy w 15. tygodniu w porównaniu z 4. tygodniem (q=00,008), podczas gdy nie wykryto żadnych znaczących różnic w MMG ani OVP. MMG było jedynym wynikiem poznawczym, który był znacząco wyższy w grupie SLR (faza I) w 15. tygodniu w porównaniu z wartością wyjściową (q=0.003) i 4. tygodniem (q=0.03) (Rysunek S4) .

W fazie II nie było znaczących różnic na przestrzeni tygodni w żadnym z pomiarów sprawności poznawczej ani w grupie kontrolnej, ani w grupie SLR. Co więcej, do RDA uwzględniono także wiek i płeć, a wyniki nie wykazały wpływu interwencji na sprawność poznawczą dzieci w którejkolwiek grupie w dowolnym momencie w ciągu 71 tygodni badania.

Stwierdzono jednak, że wiek znacząco opisuje zmienność wyników poznawczych na początku badania (p=0,008), w tygodniu 4 (p=0,005) i w tygodniu 15 (p=0 0,028) (ryc. 5), dla którego wiek był dodatnio skorelowany z MMG i OVP. Nie stwierdzono istotnego wpływu interwencji, wieku lub płci na funkcje poznawcze w 56., 61. i 71. tygodniu.

Rozważając profile poznawcze na przestrzeni tygodni każdego leczenia w każdej fazie, zarówno tydzień (p=0.001), jak i płeć (p=0.001) istotnie opisywały różnice w funkcjonowaniu poznawczym grupy kontrolnej (faza I). , dla którego płeć żeńska i tydzień 15 były dodatnio skorelowane z MMG i OVP (rysunek S5a).

Dzieci radziły sobie lepiej w MMG w 15. tygodniu w grupie lustrzanek jednoobiektywowych (faza I), podczas gdy płeć żeńska była dodatnio skorelowana z potknięciami i RT (rysunek S5b). Oceniono także wpływ leczenia dostosowanego do wieku i płci dla każdej fazy, kontrolując tydzień (punkty czasowe). RDA wykazało, że wiek miał silny związek z OVP i MMG w fazie I (ryc. S6a), podczas gdy w fazie II wyniki dotyczące RT i porażek były gorsze w grupie SLR niż w grupie kontrolnej (ryc. S6b).
Ogólnie rzecz biorąc, wiek i punkty czasowe były bardziej powiązane z wynikami poznawczymi dzieci w wieku szkolnym niż interwencja, a efekt interwencji obserwowano jedynie podczas ograniczania próbek w każdym tygodniu fazy II po dostosowaniu do wieku i płci.

3.4. Związek między mikroflorą jelitową a zdolnościami poznawczymi dzieci w wieku szkolnym

Na podstawie współczynników korelacji Spearmana stwierdziliśmy słabe korelacje między mikroflorą jelitową a wynikami poznawczymi we wszystkich punktach interwencji. Kilka powiązań było istotnych (p < {0}},05), ale tylko jedno powiązanie wykryto w 4. tygodniu dla grupy SLR (Roseburia vs. Lapses, rho=-0,40, q {{6 }}.04), pozostał istotny po korekcie w przypadku wielokrotnych porównań (rysunek S7).

Kilka powiązań bliskich istotności stwierdzono w 56. i 71. tygodniu. Powiązania zidentyfikowane w grupie SLR w 56. tygodniu obejmowały Faecalibacterium–RT (rho=0.62, q=0.07 ), Prevotella – OVP (rho=-0,55, q {{10}},08), Gammaproteobacteria – OVP (rho=-0,58, q=0,07) i Faecalibacterium–OVP (rho=-0,64, q=0,05). W 71. tygodniu stężenie Faecalibacterium było dodatnio skorelowane z RT w grupie kontrolnej (rho=0,62, q=0,07).

Uwzględniając wiek i płeć, przeprowadzono dalszą analizę związku między mikroflorą jelitową a wynikami poznawczymi w każdym punkcie czasowym przy użyciu MFA w celu ujawnienia różnic między indywidualnymi profilami grup leczonych (plik uzupełniający S4).

Chociaż indywidualną zmienność wyjaśniono liczebnością mikroflory jelitowej w Dim 1 obu faz (p < 0.0001), w Dim odnotowano silną separację pomiędzy grupą kontrolną i SLR 2 (rysunki 6 i 7). Na profil kontrastu pomiędzy tymi dwiema grupami miał wpływ wiek i OVP, które były dodatnio skorelowane z Dim 2 (p < 0,0001), podczas gdy zarówno RT, jak i przerwy były skorelowane ujemnie (p < 0,0001).

Jednakże Gammaproteobacteria wywarła największy wpływ na opisanie indywidualnych zmienności tego wymiaru w 61. tygodniu (p < 0.0001). Poziom tej bakterii był niższy w grupie SLR (współrzędna=-1,35, p < 0,0001).

Pomimo nierównej wielkości próbek MFA wskazało, że na różnice w profilach dzieci w wieku szkolnym w tym nierandomizowanym badaniu klinicznym większy wpływ miał wiek i zdolności poznawcze niż mikroflora jelitowa, co sugeruje mniejszy wpływ interwencji na zmienność indywidualną w tym badaniu.

4. Dyskusja

W naszym badaniu nie zaobserwowaliśmy żadnych znaczących zmian w bezwzględnej liczebności mikroflory jelitowej po pierwszej fazie interwencji polegającej na stosowaniu ryżu Sinlek u dzieci w wieku szkolnym. Jednakże istotne różnice między grupami odnotowano w fazie II (tygodnie 61. i 71.) w przypadku bakterii ogółem, Firmicutes, Bacteroidetes i Gammaproteobacteria.

Zaobserwowaliśmy także znaczące różnice w wynikach poznawczych pomiędzy grupą kontrolną i grupą interwencyjną w obu fazach. Nie znaleźliśmy silnej korelacji między mikroflorą jelitową a wydajnością poznawczą w żadnym momencie.

Dalsze analizy sugerują, że w tej kohorcie interwencja ryżu Sinlek nie przyczyniła się do zmian w mikroflorze jelitowej i profilach poznawczych dzieci w wieku szkolnym, ponieważ na wyniki wpływał głównie wiek.

For more information:1950477648nn@gmail.com