Nowatorski peptyd netryny-1-pochodzący z peptydu, który zwiększa ochronę przed śmiercią neuronów i łagodzi krwotok śródmózgowy u myszy, część 3
Aug 19, 2024
Grupom leczonym solą fizjologiczną, TAT lub TE1 (rozpuszczonym w soli fizjologicznej) podawano myszom 2 razy dziennie przez 5 dni poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe w całkowitej objętości 0,1 ml na zwierzę. Peptydy podawano w sposób zaślepiony w dawkach 12 mg/kg.
Sól fizjologiczna jest powszechnie stosowanym buforem fizjologicznym, szeroko stosowanym w eksperymentach medycznych i biologicznych. Ale czy wiedziałeś? Sól fizjologiczna może również poprawić naszą pamięć!
Przede wszystkim sól fizjologiczna odgrywa ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórek. Może utrzymać normalne ciśnienie osmotyczne komórek oraz utrzymać prawidłową morfologię i funkcję komórek. W mózgu duża liczba komórek nerwowych potrzebuje soli fizjologicznej jako substancji podstawowej, a suplementacja soli fizjologicznej może wspomagać normalne funkcjonowanie komórek mózgowych, dostarczać mózgowi wystarczającą ilość tlenu i składników odżywczych oraz czynić mózg zdrowszym.
Po drugie, sól fizjologiczna może promować przekazywanie sygnałów między neuronami mózgu i zwiększać zdolność mózgu do uczenia się. Badania wykazały, że w procesie uczenia się zadaniowego wstrzyknięcie soli fizjologicznej może znacząco poprawić efekty uczenia się uczniów, poprawić stan emocjonalny uczniów, zmniejszyć lęk i stres związany z nauką. Jednocześnie sól fizjologiczna może również zwiększać liczbę neuronów i złożoność neuronów w hipokampie, co sprzyja tworzeniu i utrzymywaniu pamięci.
Ponadto sól fizjologiczna może poprawić środowisko metaboliczne mózgu i zmniejszyć różne szkodliwe skutki dla mózgu, takie jak uszkodzenia, zmiany chorobowe, niedokrwienie i niedotlenienie. Są to czynniki, które mogą uszkodzić mózg, a wstrzyknięcie soli fizjologicznej może zwiększyć zdolność mózgu do radzenia sobie i zmniejszyć jego uszkodzenia, poprawiając w ten sposób pamięć i zdolność myślenia mózgu.
Ogólnie rzecz biorąc, sól fizjologiczna jest idealną substancją poprawiającą pamięć. Może mieć wiele pozytywnych skutków na mózg, w tym zwiększać liczbę i złożoność neuronów, poprawiać środowisko metaboliczne i promować przekazywanie sygnałów między neuronami. Dlatego też, gdy potrzebujemy poprawić naszą pamięć, równie dobrze możemy rozważyć wstrzyknięcie soli fizjologicznej, aby zapewnić lepszą ochronę i wsparcie dla naszego mózgu. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić naszą pamięć, ponieważ może także regulować równowagę neuroprzekaźników, takich jak zwiększenie poziomu acetylocholiny i czynników wzrostu, które są bardzo ważne dla pamięci i uczenia się. Ponadto Cistanche może również poprawić przepływ krwi i promować dostarczanie tlenu, co może zapewnić mózgowi wystarczające odżywienie i energię, poprawiając w ten sposób witalność i wytrzymałość mózgu.
Kliknij i poznaj sposoby na poprawę swojej pamięci
4.13. Mysi model ICH indukowany kolagenazą
W celu wywołania ICH powszechnie stosuje się wstrzyknięcie kolagenazy [60]. Samce myszy C57BL/6 (w wieku 8 do 12 tygodni) znieczulono izofluranem (2 do 5%) i umieszczono w ramce stereotaktycznej.
Podczas zabiegu temperaturę ciała każdego zwierzęcia utrzymywano na poziomie 37°C za pomocą koca homeotermicznego. Używając instrumentu stereotaktycznego (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Chiny) i strzykawki (Hamilton Company, Reno, NV, USA), 0.3 µLof kolagenazy (0.{{12 }}45 jm; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) wstrzyknięto do prawego prążkowia (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) przy szybkości przepływu 0,1 µl/min.
Zwierzętom kontrolnym wstrzyknięto łącznie 0,3 µl soli fizjologicznej. Wszystkie zabiegi chirurgiczne przeprowadzono w warunkach aseptycznych. W badaniu tym wzięło udział ponad 66 samców myszy, a przed każdym eksperymentem zwierzęta przydzielano losowo do grup [57].
4.14. Analiza behawioralna
Neurologiczną analizę behawioralną myszy po powstaniu krwiaka mózgu przeprowadzono za pomocą testu usuwania taśmy klejącej [61] i testu cylindra [60]. Test usuwania zwężającego się kleju przeprowadzono umieszczając taśmę samoprzylepną w obszarze podstawy każdej przedniej łapy (prawej i lewej) myszy.
Każdą mysz umieszczono w nowej klatce.
Dla każdej łapy rejestrowano czas od przyklejenia taśmy do pomyślnego jej usunięcia przez mysz. Na każdą łapę można było czekać maksymalnie 300 s. Pomiędzy eksperymentami zwierzęta trzymano w klatkach domowych, w obiekcie wolnym od patogenów.
Test cylindra przeprowadzono umieszczając mysz w przezroczystym cylindrze ze szkła akrylowego (średnica: 8 cm; wysokość: 25 cm) przed 2 lustrami i kamerą na 5 minut. Aby uzyskać optymalny obraz, kamerę umieszczono centralnie przed dwoma lustrami i cylindrem.
W celu oceny niezależnego używania kończyn przednich oceniano (1) zdolność myszy do kontaktu ze ścianą cylindra jedną kończyną przednią podczas pełnego odchowu oraz (2) zdolność myszy do lądowania na podłodze tylko jedną kończyną przednią po pełnym odchowaniu. W zwolnionym tempie zliczono co najmniej 20 punktów kontaktowych na każdą kończynę przednią.
W celu analizy wyjściowej przed operacją test przeprowadzono dwukrotnie na mysz z 1-godzinną przerwą pomiędzy próbami. Kończyna przednia wyrażana jest jako stosunek niezależnego użycia prawej i lewej kończyny przedniej.
4.15. Analiza objętości krwiaka
Aby określić, czy leczenie zmniejszyło objętość krwiaka, myszy uśmiercono 5 dni po ICH; mózgi usunięto i zamrożono błyskawicznie w OCT. Skrawki czołowe pocięto na plasterki o grubości 30 µm i umieszczono bezpośrednio na szkiełkach szkiełkowych. Aby określić ilościowo objętość krwiaka, skrawki digitalizowano na standardowych poziomach koronowych.
Niewidomy użytkownik zmierzył kontury i krwiak w lewej i prawej półkuli w każdej sekcji. Objętość krwiaka i obrzęk zmierzono i obliczono za pomocą ImageJ (NIH).
Co najmniej 5 mózgów na grupę poddano pomiarom krwiaków i zmierzono objętość krwiaka w całym mózgu.
4.16. Barwienie Fluoro-Jade C
Neurodegenerację u myszy po ICH indukowanym kolagenazą oceniano poprzez barwienie zestawem do barwienia Fluoro-jade C Ready-to-Dilute Staining Kit (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australia) zgodnie z protokołem producenta [62].
W skrócie, myszy kontrolne i myszy ICH (peptyd ±ip) uśmiercono 5 dni po modelowaniu, a mózgi poddano obróbce zgodnie z protokołem stosowanym w eksperymencie immunocytochemicznym.
Pływające skrawki mózgu zanurzano w 1% roztworze wodorotlenku sodu na 5 minut, płukano przez 2 minuty w 70% etanolu, a następnie płukano przez 2 minuty w wodzie destylowanej. Następnie pływające sekcje zanurzono na 10 min w 0,06% roztworze nadmanganianu potasu (KMnO4 w wodzie destylowanej).
Skrawki przemyto ddH2O przed zanurzeniem w 0.0001% roztworze barwiącym fluorojadeit (Fluoro-jade C w wodzie destylowanej) na 20 minut, delikatnie wytrząsając w ciemności.
Skrawki przemyto ddH2O, osadzono na powlekanych szkiełkach i suszono w temperaturze pokojowej przez noc w ciemności. Barwienie fluoro-jadeitu C w obszarze wokół krwiaka badano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 880. Ilościowe zabarwienie fluorojadetu przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ.
4.17. Immunofluorescencja tkankowa
Barwienie immunofluorescencyjne tkanek przeprowadzono przy użyciu serii skrawków o grubości 30-µm. Skrawki inkubowano z następującymi przeciwciałami pierwotnymi: mysimi przeciwciałami antyNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, USA) lub mysimi przeciwciałami anty-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, USA) w temperaturze 4 ◦C przez noc. Po przemyciu PBS skrawki inkubowano ze skoniugowanym z Alexa Fluor 488-oślim przeciwciałem anty-mysim (1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, Kalifornia, USA).
4.18. Test TUNEL
Do identyfikacji komórek apoptotycznych z fragmentacją jądrowego DNA w obszarze okołokrwiakowym mózgu zastosowano test terminalnego znakowania trifosforanu dezoksyurydyny (dUTP) (TUNEL) za pośrednictwem terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej.
Barwienie przeprowadzono przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do jednoetapowego testu apoptozy TUNEL (Beyotime, C1090, Nanjing, Chiny) i przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Po immunofluorescencji tkankowej przeprowadzono reakcję TUNEL.
Skrawki mózgu inkubowano z mieszaniną reakcyjną TUNEL (1 godz. w 37°C), a następnie skrawki przemywano PBS i barwiono kontrastowo DAPI. Kolokalizację barwienia NeuN-TUNEL zbadano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 880.
Neurony TUNEL-dodatnie (NeuN-dodatnie) w obszarze okołokrwiniakowym wewnątrz prążkowia oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ na trzech różnych zdjęciach każdej myszy wykonanych przy obiektywie 20X. Kolokalizacja barwienia GFAP-TUNEL była podobna do kolokalizacji barwienia NeuN-TUNEL.
4.19. Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo
Testy przepuszczalności bariery krew-mózg przeprowadzono in vivo w sposób opisany wcześniej [63–65]. W skrócie, myszom kontrolnym i myszom ICH (peptyd ±ip) wstrzyknięto dootrzewnowo znakowany FITC dekstran 4 kDa (100 µl 2 mM roztworu podstawowego w PBS, Sigma Aldrich,46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA). po modelowaniu 5 dni, następnie znieczulenie 5 minut później.
Po czasie krążenia znacznika wynoszącym 10 minut zwierzęta przygotowano do perfuzji przezsercowej i pobrano ~ 300 µl krwi z jamy klatki piersiowej tuż po nakłuciu przedsionka, a następnie perfuzję przez 3 minuty za pomocą PBS. Pobrano półmózgowie (wolne od płatów węchowych, móżdżku i tylnej części mózgu) i jedną nerkę, które natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C.
Do pomiaru fluorescencji próbki rozmrożono w lodzie, zważono i homogenizowano w PBS (400 µl dla hemicerebrum i 600 µl dla nerki), a następnie wirowano przez 20 minut w temperaturze 4°C i 15,000× g.
Supernatanty (100 µl), a także równe objętości surowicy (rozcieńczenie 1/5 w PBS) załadowano do czarnej płytki 96- i zmierzono fluorescencję przy odpowiednim wzbudzeniu (490 nm)/emisji (520 nm ) w czytniku płytek (Tecan, Männedorf, Szwajcaria). W celu odjęcia wartości autofluorescencji wykorzystano pozorowane zwierzęta (bez wstrzyknięcia znacznika). Wskaźnik przepuszczalności (ml/g) obliczono jako stosunek RFU tkanki/g masy tkanki do RFU/ml surowicy.
4.20. Barwienie fluorescencyjne lektyny
Aby uwidocznić mikronaczynia mózgowe, użyliśmy skoniugowanej z fluoresceiną lektyny Lycopersicon esculentum (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, Kalifornia, USA) do zanurzenia skrawków na 1 godzinę.
Skrawki obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 880 pod obiektywem 20×, a obrazy przetwarzano przy ustawieniu gamma 1,3. Wykonano trzy obrazy z 3 wcześniej określonych obszarów w obszarze okołokrwiakowym mózgu koronowego zwierzęcia. Zaślepiony badacz określił ilościowo punkty rozgałęzień naczyń w każdym mózgu. Punkt rozgałęzienia zdefiniowano jako pojedyncze naczynie znakowane fluoresceiną, wyraźnie rozdzielające się na 2 odrębne i oddzielne ścieżki naczyń [66].
4.21. Analiza statystyczna
Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono na ślepo i przeprowadzono niezależnie 3 razy, jak opisano wcześniej [67]. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono odpowiednio za pomocą jednokierunkowej ANOVA, dwukierunkowej ANOVA i testu Studenta, stosując GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA ) i oprogramowanie SPSS w wersji 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
Parametry statystyczne można znaleźć w odpowiednich legendach rysunków. Istotność statystyczną ustalono na *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]
5. Wnioski
Domena EGF3 Netrin-1 ma kluczowe znaczenie dla interakcji Netrin-1 z DCC i może aktywować różne ścieżki sygnalizacyjne. Skrócony peptyd E1 Netryny-1 (reszty 407–422) oddziałuje z DCC, chroniąc neurony przed toksycznością wywołaną heminą.
Zastosowanie peptydu E1 poprawia regenerację funkcjonalną w eksperymentalnym modelu ICH. Ponadto peptyd E1 może chronić neurony przed zwyrodnieniem i apoptozą po ICH.
Wkład autorów: Konceptualizacja, LL, Z.-XH i X.-JZ; metodologia, LL, K.-JL i J.-BC; walidacja H.-LY i X.-XH; śledztwo, X.-JZ; weryfikacja danych, JY; zasoby LL i Z.-XH; pisanie LL, Z.-XH i X.-JZ; nadzór, Z.-XH, X.-JZ; pozyskanie finansowania, Z.-XHand X.-JZ Wszyscy autorzy przeczytali i zgodzili się z opublikowaną wersją manuskryptu.
Finansowanie: Badanie to zostało sfinansowane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31671065 i 32071018) oraz Plan Rozwoju Nauki i Technologii prowincji Jilin (202520YY01017404).
Oświadczenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt Uniwersytetu Northeast Normal (NENU/IACUC, AP2016200299). Normy Narodowe Chińskiej Republiki Ludowej (GB/T 35892–2018), Wytyczne dotyczące zwierząt laboratoryjnych dotyczące etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt były wytycznymi dotyczącymi naszej opieki nad zwierzętami i protokołów.
Oświadczenie o świadomej zgodzie: Nie dotyczy.
Podziękowania: Ta praca była wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31671065 i 32071018) oraz Plan Rozwoju Nauki i Technologii prowincji Jilin (202520YY01017404).
Konflikt interesów: Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów. Fundatorzy nie mieli żadnego udziału w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu manuskryptu lub w decyzji o publikacji wyników.
Referencje
1. Kirshner, HS Medyczne leczenie krwotoku śródmózgowego: powrót do podstaw. Wewnętrzne J. Clin. Praktyka. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]
2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; i in. Szybkie obniżenie ciśnienia krwi u pacjentów z ostrym krwotokiem śródmózgowym. N.angl. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef] [PubMed]
3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Krwotok śródmózgowy. Lancet (Londyn. Angl.) 2009, 373, 1632–1644. [Odniesienie]
4. Zachowaj, RF; Hua, Y.; Xi, G. Krwotok śródmózgowy: mechanizmy urazu i cele terapeutyczne. Lancet Neurol. 2012, 11,720–731. [Odniesienie]
5. Schrag, M.; Kirshner, H. Postępowanie w krwotoku śródmózgowym: seminarium fokusowe JACC. J. Am. Kol. Kardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]
6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Chirurgia krwotoku śródmózgowego. W chirurgii nerwowo-naczyniowej Podejścia chirurgiczne w przypadku chorób nerwowo-naczyniowych; Lipiec, J., Wahjoepramono, EJ, wyd.; Springer: Singapur, 2019; s. 201–210,7. Broughton,
7. Broughton, BR; Reutensa, DC; Sobey, CG Mechanizmy apoptotyczne po niedokrwieniu mózgu. Udar 2009, 40, e331 – e339. [CrossRef] [PubMed]
8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffmana, HJ; Prawo, SK; Moestrup, SK Identyfikacja receptora zmiatającego hemoglobinę. Natura 2001, 409, 198–201. [Odniesienie]
9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Krwotok śródmózgowy: składniki krwi i neurotoksyczność.Brain Sci. 2019, 9, 316. [Odn.Krzyż]
10. Deiner, MS; Kennedy'ego, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 i DCC pośredniczą w prowadzeniu aksonów lokalnie przy tarczy wzrokowej: utrata funkcji prowadzi do hipoplazji nerwu wzrokowego. Neuron 1997, 19, 575–589. [Odniesienie]
11.Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netryny są dyfundującymi czynnikami chemotropowymi dla aksonów spoidłowych w embrionalnym rdzeniu kręgowym. Komórka 1994, 78, 425–435. [Odniesienie]
12. Flores, C. Rola netryny-1 w organizacji i funkcjonowaniu mezokortykolimbicznego układu dopaminowego. J. Psychiatria Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [Odniesienie]
For more information:1950477648nn@gmail.com
