Obiecujący ultra mały jednopłytkowy system nośny do lepszego dostarczania do skóry -mangostyny ​​jako serum przeciw plamom starczym, część 1

Abstrakcyjny: Jeśli można go skutecznie dostarczyć do miejsca działania, mangostan ma potencjał do opracowania nowych kosmeceutyków ze względu na jego działanie blokujące melanogenezę. Badanie to miało na celu opracowanie ultramałego, jednowarstwowego systemu nośnikowego mangostanu i ocenę jego skuteczności jako serum przeciw plamom starczym u ludzi in vivo. Ultramałe, jednowarstwowe nośniki zostały zoptymalizowane przy użyciu 25-planu czynnikowego z pięcioma czynnikami (olej kokosowy z pierwszego tłoczenia, lecytyna sojowa, Tween 80 oraz czas i szybkość mieszania) oraz dwoma poziomami (niski i wysoki); odpowiedź wielkości kropelek analizowano przy użyciu Design Expert 12®. Badanie przeciw plamistości przeprowadzono poprzez przechwytywanie obrazów cyfrowych ludzkiej skóry po miejscowym zastosowaniu ultramałego jednowarstwowego nośnika zawierającego mangostan w nocy przez dwa kolejne tygodnie. Ich wyniki przeanalizowano przy użyciu Motic Live Imaging 3.{32}} oraz standardowego wyniku dla czerwieni, zieleni i błękitu. Zoptymalizowana formuła serum została potwierdzona składem 2,3% oleju kokosowego z pierwszego tłoczenia, 1% lecytyny i 28,3% Tween 8 0 (polisorbat 80) przy prędkości mieszania 1500 obrotów na minutę przez 15 min. Włączenie 3 procent -mangostyny ​​do zoptymalizowanej formuły podstawowej dało ultramałe jednowarstwowe globule nośnika o wielkości 16,5 nm, z potencjałem zeta -25,8 mV i wskaźnikiem polidyspersyjnym 0,445. Fizyczna charakterystyka obciążonego mangostanem ultramałego jednowarstwowego nośnika obejmowała transmitancję 90,94 procent, wartość pH 6,5, lepkość 38 cP, ciężar właściwy 1,042 g/ml i skuteczność uwięzienia 72,46 procent. Transmisyjny mikroskop elektronowy potwierdził obecność kulistych nanokropelek w układzie. Miejscowe stosowanie ultramałego jednowarstwowego nośnika zawierającego mangostan na noc przez 2 kolejne tygodnie wykazało działanie przeciw plamom starczym, wyrażone poprzez znaczne zmniejszenie intensywności i powierzchni plam u ochotników (p < 0,05).

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniem DNA spowodowanym przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silną zdolność wychwytywania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA i mają pewien ochronny wpływ na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i może wychwytywać reaktywne formy tlenu i zapobiegać degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ naprawczy na uszkodzenia anionów wolnych rodników tyminy.

Kliknij Suplement Cistanche Tubulosa

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Słowa kluczowe: -mangostan; nanonośnik; ultra mały nośnik jednopłytkowy; serum kosmeceutyczne; nanoemulsja

1. Wstęp

Plamy starcze (plamy wątrobowe) są najczęstszą postacią przebarwień skóry [1]. Występują najczęściej na skórze, która przez wiele lat była narażona na działanie promieni słonecznych, na przykład na grzbietach dłoni, wierzchniej części stóp, twarzy, ramionach i górnej części pleców i często są niepożądaną oznaką starzenia. W związku z tym istnieje szeroka gama dostępnych produktów wybielających skórę, o różnej skuteczności i skutkach ubocznych. Nieustannie koncentruje się na opracowywaniu zoptymalizowanych produktów kosmeceutycznych, które zapewniają wysoce skoncentrowany efekt rozjaśnienia skóry w krótszym czasie niż w przypadku produktów konwencjonalnych [2]. Innym celem jest rozwój kosmeceutyków na bazie naturalnych, ponieważ są one często postrzegane przez społeczeństwo bardziej pozytywnie, a zatem zapewniają korzyści marketingowe. Wyzwaniem w opracowaniu formuły opartej na fitoskładnikach jest skuteczne dostarczenie składnika aktywnego do miejsc docelowych przez warstwę barierową warstwy rogowej naskórka [3]. Nanokosmeceutyki oferują potencjał zwiększonego przenikania przez skórę dzięki stosunkowo prostym procedurom aplikacji i możliwości ukierunkowanego dostarczania. Przykładami nanokosmeceutyków na bazie fitozwiązków [4–7] są witaminy E i D-panthenol Nanotopes™ [8,9].

-mangostyna (1,3,6,trihydroksy-7-metoksy-2,8-bis(3-metylobut-2-en-1-yl){{ 10}}H-ksantan- 9-ma potencjał hamowania procesu powstawania melaniny (przebarwień) [10].Związek wykazuje silne działanie antymelanogenne wobec komórek czerniaka B16F1 poprzez hamowanie aktywności tyrozynazy enzymu ważnego w syntezie melaniny i wywieraniu wpływu depigmentacyjnego na prawidłowe ludzkie melanocyty naskórka (NHEM) [11], dzięki czemu mangostyna może być stosowana jako składnik kosmetyków lub leków do leczenia plam, ostudy lub melanoza.

Jako związek polifenolowy mangostan jest podatny na utlenianie, co może ograniczać skuteczność po nałożeniu na skórę. Skuteczne podejście do formułowania musi zatem zwiększać zarówno przenikanie przez skórę, jak i stabilność związku aktywnego. Kilka podejść wykazało zwiększoną stabilność i dostarczanie mangostanu przez skórę [12], w tym liposomy [13], niosomy [14] i proteasomy [15].

Nasze badania skupiają się na matrycy Ultra-small Unilamelar Carrier (USUC): systemie nanonośników określanym również jako NanotopeTM. Układ ten charakteryzuje się znacznie mniejszym rozmiarem kropel (mniejszym lub równym 40 nm) w porównaniu z innymi liposomami jednowarstwowymi lub wielowarstwowymi (100–300 nm) [8]. Mniejsze kropelki są wytwarzane przez ustaloną proporcję fazy olejowej, środka powierzchniowo czynnego, środka powierzchniowo czynnego i fazy wodnej; współczynniki uzyskuje się z procedury optymalizacyjnej. W USUC faza rozproszona jest otoczona pojedynczą warstwą fosfatydylocholiny (surfaktant) stabilizowanej kosurfaktantem w ośrodku dyspergującym [16]. Mniejsza wielkość kropelek sprzyja głębokiej penetracji do warstwy rogowej naskórka [8].

Opisujemy tutaj rozwój systemu nanonośników USUC dla -mangostanu, charakterystykę fizyczną i testy in vivo na ludzkich ochotnikach. Optymalizacja formuły została przeprowadzona przy użyciu 25-planu czynnikowego [6,17] i była niezbędna do zapewnienia dobrej jakości USUC o optymalnej wielkości i stabilności kropel.

2. Materiały i metody

2.1. Materiały

-mangostynę (czystość większa lub równa 90 procent) zakupiono z Institut Teknologi Bandung (Mark Herb, Bandung, Indonezja). Inne składniki obejmowały lecytynę sojową (spożywczą; Shankar Soya Products, Indore, Indie), olej kokosowy z pierwszego tłoczenia (VCO; Wahana, Padang, Indonezja) i Tween 80 (Bratachem, Dżakarta, Indonezja). Wszystkie inne chemikalia były klasy pro-analitycznej.

2.2. Eksperymentalny projekt

Optymalizacja została przeprowadzona przy użyciu {{0}}planu czynnikowego składającego się z trzech zmiennych składu (stężenia Tween 80 (X1), lecytyny sojowej (X2) i VCO (X3)) oraz dwóch zmiennych procesowych: czasu trwania mieszania ( X4) i prędkości (X5) (z dwoma poziomami – wysokim i niskim) [18]. Przygotowano trzydzieści dwa podstawowe formuły USUC, stosując czynniki i poziomy opisane w Tabeli 1. Zmienną zależną była wielkość kropelek USUC. Wymagany był rozmiar w zakresie 0–40 nm [19]. Efekty każdej zmiennej i jej interakcji określono za pomocą równania czynnikowego w następującej postaci:

2.3. Optymalizacja formuły bazowej USUC

Formuły zasad USUC przygotowano ze spontanicznym miareczkowaniem fazy wodnej. Lecytynę sojową i Tween 80 mieszano mieszadłem magnetycznym (IKA® C-MAG HS 7, Staufen, Niemcy) w temperaturze 75°C, dodając podczas mieszania VCO. Do mieszaniny powoli miareczkowano wodę, aż do uzyskania przezroczystego roztworu [8]. 32 zasady scharakteryzowano pod względem wielkości ich cząstek (kropelek) przy użyciu analizatora wielkości cząstek (Shimadzu SALD 2300, Tokio, Japonia).

Dane analizowano za pomocą programu komputerowego Design Expert® wersja 12 (StatEase®, Minneapolis, MN, USA) w celu dopasowania równania czynnikowego z dodanymi interakcjami i skorelowania odpowiedzi z badanymi zmiennymi [17]. Efekt i interakcje między zmiennymi niezależnymi opisano za pomocą trójwymiarowych wykresów powierzchniowych i konturowych [19].

Przygotowanie -Mangostyny ​​USUC

-mangostynę (3 procent wag./obj.) rozpuszczono w VCO przed przygotowaniem USUC, jak opisano powyżej. Skład VCO, lecytyny sojowej i Tween 80 oraz warunki procesu mieszania były takie same jak dla zoptymalizowanej zasady USUC [8,20,23].

2.4. Charakterystyka USUC załadowanego mangostyną

2.4.1. Właściwości fizykochemiczne

Charakterystyka USUC obejmuje badanie organoleptyczne, wartość pH, procent transmitancji, stabilność fizyczną poprzez cykle zamrażania i rozmrażania, lepkość, ciężar właściwy, wielkość kropel, wskaźnik polidyspersyjności (PDI) i potencjał zeta [21,24,25]. pH preparatów USUC mierzono za pomocą pH-metru (Hanna Instrument, Woonsocket, RI, USA), który został wcześniej skalibrowany. Pomiar ten wykonywano raz w tygodniu podczas 8-tygodniowego przechowywania w temperaturze pokojowej [26]. Transmitancję mierzono za pomocą spektrofotometru UV-Vis (SHIMADZU UV{8}}, Tokio, Japonia) przy długości fali 650 nm. Transmitancja bliska 100 procent wskazuje na przezroczystość próbek cieczy [27,28].

Fizyczną stabilność zasad USUC oceniono za pomocą testu cyklu zamrażania i rozmrażania: USUC przechowywano w temperaturze -5 ◦C przez 24 godziny, a następnie w 25 ◦C przez kolejne 24 godziny. Ten test powtarzano przez trzy cykle. Właściwości fizykochemiczne USUC, takie jak pH, lepkość, ciężar właściwy i transmitancja, oceniano po trzech cyklach [29].

Lepkość zasad USUC mierzono za pomocą lepkościomierza typu cup-and-bob (Brookfield DV2T, Middleboro, MA, USA) przy użyciu wrzeciona numer 3 przy prędkości 100 obrotów na minutę w trzech powtórzeniach. Ciężar właściwy zasad USUC określono za pomocą piknometru w temperaturze 25 ◦C [20,30].

Wielkość kropel, wskaźnik polidyspersyjności (PDI) i potencjał zeta USUC -mangostyny ​​określono za pomocą analizatora wielkości cząstek (HORIBA Scientific SZ-100, Kioto, Japonia) w temperaturze 25°C [31].

2.4.2. Oznaczanie wydajności enkapsulacji (EE)

Ilość -mangostyny ​​uwięzionej w formule USUC została uwolniona poprzez ekstrakcję USUC załadowanego -mangostanem octanem etylu (1: 2), a następnie sonikacją przez 10 minut (Elmasonic S 80 (H), Singen, Niemcy) . Stężenie β-mangostyny ​​w roztworze octanu etylu mierzono za pomocą zwalidowanej spektrofotometrycznej metody analitycznej przy λ max 314 nm [24].

Efektywność uwięzienia (EE) została obliczona za pomocą następującego równania:

2.4.3. Analiza Micros copic za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)

Morfologię USUC obciążonego -mangostanem obserwowano przy użyciu TEM (JEOL JEM 1{4}}10, Tokio, Japonia) przy 80,0 KV i 30,{6}}× powiększeniu. Próbkę 10 µl naniesiono na siatkę, zabarwiono octanem uranylu i wysuszono. Obserwację prowadzono w temperaturze pokojowej [8,24,32].

2.4.4. Wizualna ocena USUC załadowanego mangostyną u ochotników

Testy płatkowe przeprowadzono na wewnętrznej stronie przedramienia 10 ochotników i pozostawiono na 24 godziny, aby sprawdzić potencjalne reakcje podrażnieniowe, takie jak czerwone, swędzące wysypki na skórze. Test działania przeciwplamiskowego USUC -mangostyny ​​przeprowadzono na 2 ochotniczkach w wieku odpowiednio 57 i 40 lat. Eksperyment został przeprowadzony na podstawie atestu etycznego wydanego przez Wydział Lekarski Uniwersytetu Andalas (dokument nr 181/UN.16.2/KEP-FK/2020 z dnia 23 grudnia 2020 r.). USUC z dodatkiem mangostanu nakładano cienką warstwą na wypryski i całą twarz na noc przez 2 kolejne tygodnie. Obie ochotniczki wypełniły świadomą zgodę na udział w tym badaniu i zgodziły się nie używać żadnego kremu rozjaśniającego do twarzy podczas testu. Przed sfotografowaniem ochotniczki oczyściły twarze komercyjnym bezolejowym środkiem do demakijażu. Twarze ochotników sfotografowano za pomocą jednoobiektywowej lustrzanki cyfrowej (Nikon D 810, Melville, NY, USA) przed i po leczeniu. Każde zdjęcie twarzy zostało wykonane z odległości 30–40 cm aparatem wyposażonym w 36 megapikseli i wymiary 7360 × 4912. Intensywność ciemnych plam walidowano, mierząc wartości czerwieni, zieleni i błękitu (model kolorów RGB ) z Adobe® Photoshop dla Windows i OS X (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA). Rozmiar ciemnych plam określono za pomocą mikroskopu (Olympus, Ningbo, Chiny) wyposażonego w Motic Live Imaging 3.0. [33–35].

2.5. Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Zastosowano prosty test t w celu potwierdzenia zoptymalizowanej formuły w stosunku do przewidywanej odpowiedzi; przeprowadzono sparowany test t w celu zidentyfikowania znaczącej poprawy parametrów stanu skóry. Zastosowano dwuczynnikową analizę ANOVA (= 0,05) w celu ustalenia istotnej różnicy między średnimi, a następnie test wielokrotnego rozstępu Duncana przy 5-procentowym poziomie istotności [18].

3. Wyniki

3.1. Optymalizacja formuły bazowej

Trzydzieści dwa podstawowe formuły USUC przygotowano z różnymi czynnikami, jak opisano w Tabeli 2. Pomiar zmiennej odpowiedzi wykazał szeroki zakres wielkości kropelek od 11,3 nm do 184,5 µm. Tylko sześć preparatów (F1, F3, F9, F12, F25 i F28) spełniało kryteria systemu USUC, z wielkością kropel mniejszą lub równą 40 nm [8]. Dane w Tabeli 2 poddano dalszej analizie za pomocą oprogramowania Design Expert® w celu uzyskania modelu regresji, a następnie określenia zoptymalizowanego wzoru.

3.2. Odpowiedź (Y): Wpływ zmiennych niezależnych na wielkość cząstek

Przeprowadzono ocenę wielkości kropelek jako odpowiedzi (Y). Na etapie projektowania eksperymentu modelowano pięć czynników lub zmiennych niezależnych, a następnie generowano powierzchnię odpowiedzi dla wielkości kropel. Rycina 1 przedstawia trójwymiarowe wykresy odpowiedzi-powierzchni wpływu zmiennych niezależnych na wielkość cząstek. Otrzymane równanie silni jest podane w równaniu (3):

Odpowiedź wielkości kropelek wzrosła, gdy skład Tween 80 i lecytyny sojowej był na wyższych poziomach (ryc. 1a). Zmniejszenie poziomu VCO i zwiększenie poziomu Tween 80 spowodowało odpowiedź wielkości kropli 20–70 nm (ryc. 1b). Wpływ związku między Tween 80 a czasem mieszania na odpowiedź wielkości kropelek wykazał, że dłuższy czas mieszania skutkował odpowiedzią wielkości kropelek 20–100 nm (ryc. 1c). Odpowiedź wielkości kropli 20,000 nm uzyskano przy prędkości mieszania 1200–1350 obr./min i zawartości Tween 80 wynoszącej 20 procent. Wzrost poziomu Tween 80 przy niższym poziomie szybkości mieszania zwiększył odpowiedź wielkości kropelki nawet o 80, 000 nm, na co wskazuje obszar od niebieskiego do zielonego (ryc. 1d). Rosnąca zawartość lecytyny sojowej i VCO skutkowała większymi wartościami wielkości kropel, co oznaczono obszarem od niebieskiego do zielonego (50, 000–100, 000 nm) (ryc. 1e). Zwiększenie zawartości lecytyny i użycie dłuższego czasu mieszania skutkowało większym rozmiarem kropel, na co wskazuje obszar od niebieskiego do zielonego (50, 000–100, 000 nm) (ryc. 1f). Zwiększenie zawartości lecytyny sojowej przy wysokiej prędkości mieszania zwiększyło rozmiar kropel, co oznaczono obszarem od zielonego do żółtego (50, 000–150, 000 nm) (ryc. 1g). Ocena zawartości VCO i czasu mieszania w zależności od wielkości kropelek wykazała, że ​​czas mieszania wynoszący 15 minut i poziom VCO równy<1.5% resulted in a droplet size of 40 nm (Figure 1h). The droplet-size profiles were varied,  with different levels of combination for both VCO versus stirring speed and stirring speed versus stirring time (Figure 1i,j).

3.3. Określenie optymalnej formuły przez Software Design Expert®

Analiza została przeprowadzona za pomocą Design Expert® w celu wygenerowania nałożonych wykresów konturowych. Na rycinie 2 żółty obszar reprezentuje obszar predykcji optymalnej formuły bazowej z odpowiedzią wielkości kropel. Oszacowana optymalna formuła bazowa została znaleziona przy stężeniu 28,2 Tween 80 procent i 1 procent lecytyny sojowej, przy pożądanej wartości 1,{7}}. Wartość celowości bliższa 1 wskazuje na zdolność modelu do stworzenia zoptymalizowanej formuły. Zoptymalizowane warunki wytwarzania bazy USUC obejmowały prędkość mieszania 1500 obr./min przez 15 min. Ta kompozycja i te warunki dały przewidywaną odpowiedź 34,04 nm. Przygotowanie zoptymalizowanej formuły do ​​potwierdzenia (tabela 3) dało wielkość kropel 36 nm, co nie różni się istotnie od przewidywanej odpowiedzi (p większe lub równe 0,05).

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】