Część 1 Akteozyd hamuje osteoklastogenezę za pośrednictwem RANKL poprzez hamowanie indukcji C-Fos i szlaku NF-kB oraz tłumienie produkcji ROS

Część 1 Jak Acteosides promują wzrost kości?

Więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Instytut Medycyny Klinicznej Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, SouthKorea, 2 Department of Orthodontics, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South Korea, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Korea Południowa

Abstrakcyjny

Liczne badania wykazały, że cytokiny zapalne są ważnymi mediatorami osteoklastogenezy, powodując w ten sposób nadmierną resorpcję kości i osteoporozę.Akteozyd, główny składnik aktywny Rehmannia glutinosa, szeroko stosowany w tradycyjnej medycynie Wschodu, ma potencjał przeciwzapalny i antyoksydacyjny. W tym badaniu stwierdziliśmy, że strona CTE znacznie hamowała różnicowanie i tworzenie osteoklastów z makrofagów szpiku kostnego (BMM) i makrofagów RAW264.7 stymulowanych przez aktywator receptora ligandu czynnika jądrowego kappaB (NF-kB) (RANKL). Wstępne leczenie akteozydem zapobiegało również resorpcji kości przez dojrzałe osteoklasty w sposób zależny od dawki. Atenuowany akteozyd (10 mM) stymulowana przez RANKL aktywacja kinazy p38, kinazy regulowane sygnałem pozakomórkowym i kinaza c-Jun N-końcowa, a także tłumiona aktywacja NF-kB przez hamowanie fosforylacji podjednostki p65 i inhibitora kBa. Ponadto, za pośrednictwem RANKL wzrost ekspresji c-Fos i czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T, cytoplazmatycznego 1 (NFATc1) oraz produkcji czynnika martwicy nowotworu-a, interleukiny (IL)-1b , a IL-6 zostały najwyraźniej zahamowane przez wstępne traktowanie akteozydem. Ponadto doustny akteozyd zmniejszał utratę kości wywołaną wycięciem jajników i wytwarzanie zapalnych cytokin do poziomu kontrolnego. Nasze dane sugerują, żeakteozydhamuje różnicowanie i dojrzewanie osteoklastów z prekursorów osteoklastów poprzez hamowanie wywołanej przez RANKL aktywacji kinaz białkowych aktywowanych mitogenami i czynników transkrypcyjnych, takich jak NF-kB, c-Fos i NFATc1. Łącznie wyniki te sugerują, żeakteozydmoże działać jako środek antyresorpcyjny, zmniejszając utratę masy kostnej poprzez blokowanie aktywacji osteoklastów.

Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z:ali.ma@wecistanche.com

Kliknij, aby uzyskać efekty Cistanche

Wstęp

Kość podlega ciągłej przebudowie dzięki zrównoważonej aktywności osteoklastów i osteoblastów [1]. Osteoklasty powstają z hematopoetycznych komórek prekursorowych linii monocytów/makrofagów, podczas gdy osteoblasty są z linii mezenchymalnej [2]. Aktywacja anormalnych osteoklastów lub zmniejszona osteoblastogeneza może zakłócić homeostazę kości, ostatecznie powodując takie choroby jak osteoporoza, zapalenie stawów i rak kości [3,4]. Osteoporoza to powszechna choroba kości, która prowadzi do zwiększonego ryzyka złamań. Najczęstszą postacią osteoporozy jest niedobór estrogenów u kobiet po menopauzie. Leki, takie jak kortykosteroidy i leki przeciwpadaczkowe, mogą również powodować zaburzenia równowagi między resorpcją i tworzeniem kości, co może skutkować osteoporozą [5]. Do leczenia osteoporozy stosowano wiele inhibitorów antyresorpcyjnych, w tym bisfosfoniany, kalcytoninę, estrogen i selektywne modulatory receptora estrogenowego. Inhibitory te utrzymują masę kostną poprzez hamowanie funkcji osteoklastów [6]. Estrogenowa terapia zastępcza jest najpopularniejszym sposobem zapobiegania i leczenia osteoporozy pomenopauzalnej. Jednak długoterminowa terapia zastępcza estrogenem może zwiększać ryzyko raka endometrium i piersi. Dlatego wielu badaczy skoncentrowało swoje wysiłki na opracowaniu nowego środka antyresorpcyjnego, który nie ma skutków ubocznych [7–10]. Ponieważ osteoklasty działają w resorpcji kości, w wielu badaniach za główny cel uznano swoiste hamowanie osteoklastów. Osteoklasty to wielojądrowe komórki olbrzymie utworzone przez jednojądrzaste komórki progenitorowe z rodziny monocytów/makrofagów poprzez sekwencyjną proliferację, różnicowanie i fuzję krwiotwórczych komórek prekursorowych [11]. Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora czynnika jądrowego (NF)-kB (RANK)ligand (RANKL) są istotnymi czynnikami różnicowania osteoklastów [12]. Ponadto kilka zapalnych cytokin, takich jak czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interleukina (IL)-1b, przyczynia się do osteoklastogenezy poprzez modulację indukcji RANKL, osteoprotegeryny i M-CSF [7,13]. Wiązanie RANKL z receptorem RANK na powierzchni komórki powoduje powstanie kompleksów czynników związanych z RANKL/RANK/TNFR (TRAF), które sekwencyjnie aktywują NF-kB i kinazy białkowe aktywowane mitogenami (MAPK), w tym kinazę N-końcową c-Jun (JNK), p38 kinaza i kinaza związana z sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) [14]. Ta aktywacja odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w różnicowaniu, aktywacji i przeżyciu osteoklastów. RANKL aktywuje również ekspresję czynników transkrypcyjnych, takich jak czynnik jądrowy aktywowanych komórek T, cytoplazmatyczny 1 (NFATc1) i Fos, które są niezbędne dla rozwoju osteoklastów [ 7,9]. Dlatego sygnalizacja RANKL jest uważana za główny cel środków antyresorpcyjnych, które hamują aktywację osteoklastów i utratę masy kostnej.

Akteozydjest głównym aktywnym związkiem Rehmannia glutinosa, szeroko stosowanym w tradycyjnej medycynie Wschodu [15,16]. Akteozyd jest silnym przeciwutleniaczem i ma działanie antyhepatotoksyczne, przeciwzapalne i antynocyceptywne [17–20]. Wcześniej stwierdziliśmy, żeakteozydzmniejsza aktywność tyrozynazy i biosyntezę melaniny poprzez regulację sygnalizacji ERK [21], chroni przed uszkodzeniem dziąseł za pośrednictwem reaktywnych form tlenu (ROS) [22] i hamuje uszkodzenia komórek za pośrednictwem mykotoksyn [23]. Efekty te są ściśle związane zakteozydzdolność do usuwania ROS i regulowania sygnalizacji za pośrednictwem MAPK. W szczególności sugeruje się, że ROS pośredniczą w szlakach sygnałowych indukowanych przez RANKL i zdarzeniach komórkowych w osteoklastach. Wstępne leczenie przeciwutleniaczami hamowało indukowaną przez RANKL aktywację NF-kB, ERK i IkBa, tym samym hamując osteoklastogenezę [24]. Odkrycia te silnie sugerują, że oprócz działania przeciwzapalnego, aktywność antyoksydacyjna ma kluczowe znaczenie dla środka przeciwresorpcyjnego, a zatemakteozydmoże hamować osteoklastogenezę indukowaną RANKL.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy, czyakteozyddziała leczniczo na utratę masy kostnej. Zbadaliśmy efektyakteozydo różnicowaniu osteoklastów i resorpcji kości oraz powiązanych mechanizmach komórkowych przy użyciu systemów doświadczalnych in vitro i in vivo.

Materiały i metody

Oświadczenie etyczne

Praktyki związane z opieką nad zwierzętami i ich użytkowaniem zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki w Opiece i Wykorzystywaniu Zwierząt Laboratoryjnych w ChonbukNational University (Zezwolenie nr CBU 2010-0007). Wszystkie eksperymenty w tym badaniu przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu.

Myszy, chemikalia i wyroby laboratoryjne

Czterotygodniowe samice myszy ICR zakupiono od OrientBio Inc. (Seul, Korea) i trzymano w 2261uC i 5655% wilgotności w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Z liści Rehmannia glutinosa. Akteozyd przed użyciem rozpuszczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 i M-CSF zostały zakupione z systemów R & D (Minneapolis, MN, USA). Przeciwciała specyficzne dla c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa i b-aktyny uzyskano z Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Przeciwciała dla p-p38 i p38 zakupiono z Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Zestawy CalciumAssay i Osteocalcin (OC) EIA zostały zakupione odpowiednio od BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) i Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), w celu określenia parametrów biochemicznych surowicy. Do pomiaru poziomu TRAP5b w surowicy użyto także mysiego zestawu do oznaczania kwaśnej fosfatazy opornej na winian (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). O ile nie określono inaczej, dodatkowe chemikalia otrzymano z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), a wyroby laboratoryjne z SPL Life Sciences (Pochun, Korea Południowa).

Hodowle komórkowe

Komórki szpiku kostnego pobrano z kości piszczelowych i udowych 6-tygodniowych samic myszy ICR zgodnie z metodami opisanymi wcześniej [25]. Zawiesinę szpiku kostnego inkubowano w naczyniu hodowlanym 100-mm w obecności 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dniach komórki przylegające zastosowano jako makrofagi szpiku kostnego (BMM) do indukowania różnicowania osteoklastycznego. Niektóre komórki szpiku kostnego inkubowano również przez 48 godzin bez M-CSF, a komórki przylegające hodowano w pożywce różnicującej osteoblasty, jak opisano w innym miejscu [25]. Komórki makrofagów RAW264.7 hodowano w pożywce Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminą i antybiotykami. Komórki te zostały wykorzystane jako odpowiednik linii komórkowej dla BMM do zbadania wpływu akteozydu na osteoklastogenezę.

Różnicowanie osteoklastów i barwienie TRAP

BMM wstępnie potraktowano różnymi stężeniami (0–50 mM) akteozydu przez 2 godziny przed stymulacją 100 ng/ml RANKL. Pożywkę hodowlaną zastąpiono świeżą pożywką w dniach 2 i 5. Po 7 dniach inkubacji hodowle utrwalono w 4% paraformaldehydzie buforowanym PBS i wybarwiono TRAP przy użyciu zestawu sigma Aldrich zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki TRAP-dodatnie zliczono za pomocą mikroskopii optycznej, a komórki zawierające 3 lub więcej jąder uznano za osteoklasty. Komórki RAW 264,7 poddano również działaniu 100 ng/ml RANKL po wstępnym traktowaniu akteozydem przez 2 godziny i po 7 dniach inkubacji, komórki poddano obróbce do barwienia TRAP.

Pomiar żywotności komórek

Żywotność komórek określono przy użyciu odczynnika rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazoliowej (WST)-8. W skrócie, komórki BMM lub RAW264.7 hodowane w pożywce wzrostowej zawierającej 10% FBS i antybiotyki traktowano 10 mM akteozydem lub związkiem fenolowym, takim jak kwercetyna, luteolina, apigenina lub -3-galusan epigallokatechiny (EGCG). Odczynnik WST-8 dodano do hodowli po 48 godzinach inkubacji. Po inkubacji przez dodatkowe 4 godziny mierzono absorbancję właściwą WST-8- przy 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Test resorpcji kości

BMM (16105 komórek/ml) zawieszono w a-MEM zawierającym 50 ng/ml M-CSF i 100 ng/ml RANKL, a następnie podzielono na płytkę 24-dołkową pokrytą nanokryształami fosforanu wapnia (OAAS{{6} }; Substrate Assay Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Korea Południowa) o gęstości 26104 komórek/cm2 z lub bez akteozydu. Po inkubacji przez 7 dni komórki usunięto z płytek za pomocą 5% podchlorynu sodu, a informacje obserwowano pod mikroskopem optycznym. Resorbowany obszar był również mierzony za pomocą analizatora obrazu i wyrażany jako procent wartości kontrolnej.

Analiza Western Blot

Lizaty pełnego białka przygotowano w buforze do lizy, jak opisano w innym miejscu [26]. Białka cytozolowe i jądrowe przygotowano jak opisano wcześniej [25]. Równe ilości ekstraktu białkowego oddzielono przez 12–15% SDS-PAGE i przeniesiono na membrany z polifluorku winylu. Bloty sondowano pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w 4uC przed inkubacją z drugorzędowym przeciwciałem w buforze blokującym przez 1 godzinę. Bloty wywoływano ze wzmocnioną chemiluminescencją (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Wielka Brytania) i eksponowano na kliszę rentgenowską (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

Test aktywności MAPK

Komórki wstępnie traktowano akteozydem przez 2 godz., a następnie stymulowano RANKL przez dodatkowe -30 min. Aktywności MAPK określano za pomocą zestawów do testów immunometrycznych, takich jak zestaw do testu kinazy p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA), zestaw do testu enzymatycznego p-ERK (Projekt testu) i zestaw do testu ELISA kanapkowego p-SAPK/JNK ( Technologia sygnalizacji komórkowej, MA, USA). Wszystkie procedury były zgodne z instrukcjami producenta, a absorbancję mierzono czytnikiem mikropłytek.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)

Reakcje wiązania DNA-białko prowadzono przez 30 min w temperaturze pokojowej, z 10-15 mg białka w 20 ml buforu zawierającego 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli(dI-dC), 5% glicerol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM [a-32P] znakowanych oligonukleotydów dCTP i fragment Klenowa polimerazy DNA. Próbki rozdzielano na 6% żelach poliakryloamidowych, które suszono i eksponowano na kliszę rentgenowską (Eastman Kodak Co.) przez 12-24 hw 270uC. Sekwencje starterów oligonukleotydowych specyficzne dla NF były 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 i 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

Test lucyferazy NF-kB

Makrofagi RAW264.7 na płytkach 24-studzienkowych transfekowano 0.8 mg wektorem reporterowym kB-lucyferazy przy użyciu 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. W 24 godziny po transfekcji komórki stymulowano RANKL w obecności i nieobecności akteozydu przez 24 godziny. Komórki ponownie zawieszono w 100 ml reporterowego buforu do lizy (Promega, Madison, WI, USA). Równe ilości próbek białka umieszczono w 96-dołkowych mikropłytkach i zmieszano z substratem lucyferazy. Luminescencję mierzono stosując luminometr do mikropłytek (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Niemcy). W tym doświadczeniu jako dodatni inhibitor kB zastosowano przepuszczalny peptyd inhibitora NF-B (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).

Pomiar cytokin

BMM lub komórki RAW264.7 stymulowano RANKL w obecnościakteozydw 24-płytkach hodowlanych dołków. Po 48 godzinach inkubacji supernatanty hodowli zebrano i oceniono za pomocą testu ELISA przy użyciu zestawów OptEIATM specyficznych dla TNF-a-, IL-1b- i IL-6- zgodnie z instrukcjami producenta.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

Ekspresję mRNA markerów osteoklastycznych, takich jak c-Fos, NFATc1 i TNF-a, określono metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. W skrócie, całkowity RNA wyekstrahowano z makrofagów za pomocą Trizolreagent zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). cDNA zsyntetyzowano z 1 mg całkowitego RNA przy użyciu SuperScriptReverse Transcripatase II i starterów (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) został użyty do wykrycia akumulacji produktu PCR podczas cyklu za pomocą systemu wykrywania sekwencji ABI 7500 (stosowano przy użyciu czterdziestu 3-etapowych cykli denaturacji w temperaturze 95uC przez 15 s, hybrydyzacja w 60uC przez 1 s i wydłużanie w 72uC przez 30 s. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono co najmniej w trzech powtórzeniach, a poziomy ekspresji znormalizowano do genu metabolizmu podstawowego HPRT w tej samej reakcji. W tym badaniu zastosowano te same opisane sekwencje starterów gdzie indziej [7].

Pomiar wewnątrzkomórkowego ROS

Roztwór podstawowy 29,79-dioctanu dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Niemcy) przygotowano w DMSO i przechowywano w temperaturze 220uC w ciemności. W skrócie, BMM (106 komórek/ml w płytkach 6-dołkowych) hodowano z 50 ng/MLM-CSF przez 24 godziny, a następnie traktowano różnymi stężeniami (0–10 mM) akteozydu 2 godziny przed stymulacją 100 ng/mlRANKL. Po 1 godzinie wspólnej inkubacji komórki te następnie inkubowano z 25 mM DCFH-DA przez 30 min. Zieloną fluorescencję 29 79-dichlorofluoresceiny (DCF) zarejestrowano przy 515 nm (FL 1) przy użyciu systemu FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) i 10 000 zdarzeń zostały zliczone na próbkę

Indukcja osteoporozy wywołanej wycięciem jajników

W tym badaniu zastosowano samice myszy ICR (w wieku 6 tygodni). Myszy przeszły operację pozorowaną (Sham, n=10) lub chirurgiczne wycięcie jajników (OVX, n=20) w znieczuleniu. Tydzień po zabiegu myszy OVX zostały losowo podzielone na 2 grupy po 10 myszy każda: obustronna OVX i obustronna OVX uzupełniona 200 ml PBS zawierającego 1 mM akteozyd doustnie (grupa AC). Doustnyakteozydpodawano raz na 3 dni przez 8 tygodni po operacji i taką samą ilość PBS podawano grupom Sham i OVX. Po 1 dniu ostatniego podania myszy uśmiercono, a następnie analizowano parametry biochemiczne w surowicy i 3-wymiarową strukturę kości.

Oznaczanie parametrów biochemicznych surowicy

Próbki krwi pobrano przez nakłucie serca, a surowicę zebrano przez odwirowanie. Próbki surowicy przechowywano w temperaturze 280uC do analizy parametrów biochemicznych. Poziomy IL-1b i IL-6 w surowicy oszacowano za pomocą zestawu ELISA, jak opisano powyżej, podczas gdy aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP) określono za pomocą biochemicznego testu kolorymetrycznego, który mierzy ilość p -nitrofenol wytwarzany z substratu fosforanu p-nitrofenolu, jak opisano w innym miejscu [27]. Aby oszacować biomarkery tworzenia i resorpcji kości, określono również poziomy OC, wapnia i TRAP5b w surowicy zgodnie z instrukcjami producenta.

Analizy struktury kości i parametrów morfometrycznych

Udowe myszy (grupy pozorowane, OVX i AC) wycięto i wypełniono solą fizjologiczną do testów mechanicznych. Wytrzymałość mechaniczną kości udowej mierzono w sposób opisany w innym miejscu [28]. Obciążenie złamania rejestrowano jako szczytową siłę w niutonach w punkcie złamania środkowego trzonu prawej kości udowej. Ponadto, jasną kość udową każdego zwierzęcia analizowano histomorfometrycznie przy użyciu systemu tomografii mikrokomputerowej (mikro-CT) (system mikroogniskowy rentgenowski SkyScan 1076, Kontich, Belgia). Krótko mówiąc, kości w 4% formaldehydzie suszono powierzchownie na bibułce papierowej, a następnie owijano w plastikową „folię spożywczą” lub parafilm, aby zapobiec wysychaniu podczas skanowania. Każdą owiniętą plastikiem kość umieszczono w plastikowych/polistyrenowych probówkach, które zamontowano pionowo poziomo w komorze próbki skanera 1076 do obrazowania mikrotomowego. Skanowanie przeprowadzono przy użyciu napięcia źródła 100 kV i prądu źródła 140 mA z rozdzielczością 35 mm. Trójwymiarowe modele kości beleczkowatych kości udowej zrekonstruowano za pomocą SkyScan CT Analyzer wersja 1.11. Parametry strukturalne, takie jak gęstość mineralna kości beleczkowej (BMD, g/cm3), procent objętości kości (objętość kości (BV)/objętość tkanki (TV), procent), grubość (Tb.Th, mm), separacja (Tb.Sp , mm) i następnie zmierzono liczbę (Tb.N, 1/mm).

Test różnicowania i mineralizacji osteogenów

Komórki szpiku kostnego hodowane na 6-płytkach do hodowli studzienek traktowano DAG (10 nM deksametazon, 50 mM kwas askorbinowy i 20 mM b-glicerofosforan) w obecności 10 mMakteozyd. Po 2 tygodniach różnicowania komórki utrwalano lodowatym 70 procentami (obj./obj.) etanolem przez 1 godzinę i barwiono 0,2 procentową wodą destylowaną z czerwienią alizaryny Sin przez 30 minut w temperaturze pokojowej temperatura. Po odbarwieniu komórek i wysuszeniu na powietrzu płytki do hodowli komórkowych oceniano pod mikroskopem świetlnym przy użyciu mikroskopu odwróconego (Nikon TS100, Japonia). Aby określić ilościowo ilość czerwonego barwnika, plamę eluowano 10% chlorkiem acetylopirydyniowym przez wytrząsanie przez 20 minut i mierzono absorbancję przy 560 nm. Ilość wapnia osadzonego w warstwach komórek mierzono również przy użyciu zestawu Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Ponadto ekspresja markerów mRNA specyficznych dla kości, takich jak czynnik transkrypcyjny związany z runt -2(Runx2), osterix, sialoproteina kości (BSP) i OC, została określona przez RT-PCR w czasie rzeczywistym. Startery oligonukleotydowe tych markerów zaprojektowano z produktami o wielkości poniżej 200 pz przy użyciu oprogramowania PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems), jak opisano w innym miejscu [27].

Analiza statystyczna

O ile nie wskazano inaczej, wszystkie dane wyrażono jako średnie6 odchylenie standardowe (SD) z 3 lub więcej niezależnych eksperymentów. Do wielokrotnych porównań zastosowano jednokierunkową analizę ANOVA przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 12.0. Wartość p 0.05 została uznana za statystycznie istotną.

Wyniki

Akteozyd hamuje tworzenie osteoklastów przez makrofagi w sposób zależny od dawki

Aby zweryfikować wpływ akteozydu na różnicowanie BMM do osteoklastów, komórki hodowano z różnymi stężeniami (0–20 mM) akteozydu przez 7 dni w obecności 50 ng/ml M-CSF i 100 ng/ml RANKL. Acteoside zmniejszał liczbę osteoklastów w sposób zależny od dawki. Gdy komórki były wstępnie traktowane 10 mM akteozydem przez 2 godziny, liczba osteoklastów zmniejszyła się o 43 procent w porównaniu z komórkami suplementowanymi M-CSF i RANKL (Fig. 1A). Fig. 1B przedstawia różnicowanie osteoklastów za pośrednictwem RANKL i jego hamowanie przez skojarzone leczenie akteozydem. Zgodnie z tym wynikiem, wstępne traktowanie akteozydem zmniejszyło stymulowane RANKL różnicowanie komórek RAW264.7 i tworzenie osteoklastów (ryc. 1C i D). Kiedy porównano potencjał antyosteoklastyczny akteozydu na BMM z potencjałami antyosteoklastycznymi kilku związków fenolowych w tym samym stężeniu (10 mM), luteolina wykazała najwyższą aktywność (ryc. 2A). Jednak luteolina, kwercetyna lub sama apigenina zmniejszały żywotność komórek (ryc. 2B). Wszystkie związki hamowały różnicowanie osteoklastów przez makrofagi RAW264,7 o następujących względnych aktywnościach: luteolina. kwercetyna=apigenina .EGCG=akteozyd (ryc. 2C). Luteolina, kwercetyna lub sama apigenina również wykazywały zmniejszoną żywotność komórek (ryc. 2D). W przeciwieństwie do tego, traktowanie kwercetyną spowodowało jedynie znaczne zmniejszenie żywotności zarówno w komórkach BMM, jak i RAW264,7, gdy komórki te były eksponowane na 10 mM każdego związku przez 2 dni z 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, lub oba (dane nie pokazane). Gdy stężenie tych związków jest wymagane do zahamowania 50 procent

tworzenie osteoklastów w BMM (IC50) obliczono za pomocą krzywych stężenie-aktywność, IC50akteozyd, kwercetyna, luteolina, apigenina i EGCG wynosiły odpowiednio 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 i 6,6 mM (ryc. 2E). Wynik ten był podobny do przypadku, w którym badano makrofagi RAW264,7. Dane te sugerowały, że luteolina i kwercetyna wykazywały wyższą aktywność przeciwklastogenną niż akteozyd. W przeciwieństwie do tego, kwercetyna przy IC50 miała również łagodny toksyczny wpływ na komórki (dane nie pokazane).

Akteozyd hamuje resorpcję kości przez makrofagi

Akteozyd zapobiegał również resorpcji kości, w której pośredniczy RANKL, w sposób zależny od dawki, co zmierzono za pomocą systemu modelowego in vitro (ryc. 3A). Resorpcja kości została znacząco zahamowana, gdy BMM były inkubowane z 1 mM akteozydem (ryc. 3B). 10 mMakteozydleczenie prawie całkowicie osłabiło informacje indukowane przez RANKL przez BMM. Podobnie, akteozyd zmniejszał resorpcję kości w stymulowanych RANKL komórkach RAW264.7 (ryc. S2A i B). Zdolność akteozydu do hamowania resorpcji kości zależała od czasu leczenia w stosunku do stymulacji RANKL. Akteozyd (10 mM) dodany 4 dni po stymulacji RANKL nie redukował informacji w BMM, natomiast tłumił liczbę utworzonych osteoklastów (ryc. 3C). Ten inny wynik był częściowo spowodowany obszarem wgłębienia już utworzonym po 4 dniach tworzenia stymulacji RANKL (ryc. 3D).

Acteoside Down reguluje wczesne ścieżki sygnalizacji RANKL

RANKL indukuje aktywację 3 dobrze znanych MAPK i NF-kB w prekursorach osteoklastów i ta aktywacja jest wymagana do wczesnego różnicowania osteoklastów. Aby zrozumieć możliwe mechanizmy, dzięki którym akteozyd hamuje osteoklastogenezę, zbadaliśmy wpływakteozydna MAPK i aktywację NF-B w makrofagach. BMM i komórki RAW264.7 wstępnie traktowano 10 mM akteozydem przez 2 godz., a następnie stymulowano 100 ng/ml RANKL przez 30 min. Fosforylację MAPK badano metodą Western blot i analizą immunometryczną. RANKL indukował fosforylację p38, ERK i JNK w komórkach BMM (ryc. 4A) i RAW264.7 (ryc. 4B). Acteoside zapobiegał indukowanemu przez RANKL wzrostom p-p38, p-ERK i p-JNK. Wynik ten został poparty analizą immunometryczną, która wstępnie potraktowała 10 mMakteozydznacząco hamował poziomy fosforylowanych MAPK w tych makrofagach (ryc. 4C). Traktowanie RANKL zwiększało wiązanie DNA NF-kB, podczas gdy akteozyd hamował aktywację wiązania NF-kB-DNA indukowaną przez RANKL (ryc. 5A). To hamowanie było bardziej widoczne w BMM niż w komórkach RAW264,7. Acteoside zmniejszał również stymulowaną przez RANKL fosforylację p65 i IkBa w komórkach BMM i RAW264.7 (ryc. 5B i C). Dodanie 10 mMacteozydu prawie całkowicie zahamowało zarówno degradację, jak i aktywację IkBa w BMM (ryc. 5B). Aby dodatkowo potwierdzić, że aktywacja NF kB jest zaangażowana w działanie akteozydu, konstrukty promotor kB-lucyferaza przejściowo transfekowano do komórek RAW264.7. Komórki inkubowane z 100 ng/ml RANKL miały 3-krotnie wyższą aktywność promotora kB, która była znacznie osłabiona przez 10 mM akteozyd (Fig. 5D).

Acteoside hamuje wytwarzanie zapalnych cytokin i ekspresję TNF-a, c-Fos i NFATc1 w makrofagach stymulowanych RANKL

TNF-a, IL-1b i IL-6 są ważne w tworzeniu i funkcjonowaniu osteoklastów, w czym pośredniczy sygnalizacja NF-kB w makrofagach stymulowanych przez RANKL. RANKL stymulował produkcję tych cytokin, a ta produkcja została znacznie zmniejszona o 10 mMakteozydobróbka wstępna w BMM (ryc. 6A). Podobnie, akteozyd osłabiał indukowaną przez RANKL produkcję cytokin, z wyjątkiem IL-6, w makrofagach RAW264.7 (ryc. S3). Aby zrozumieć molekularne mechanizmy działania akteozydu w osteoklastogenezie, zbadaliśmy dalej wpływ akteozydu na ekspresję TNF-α, c-Fos i NFATc1. RANKL regulował w górę ekspresję mRNA tych czynników w BMM i komórkach RAW264.7 (ryc. 6B i C). Wstępne traktowanie 10 mM akteozydem znacząco zahamowało ekspresję tych czynników indukowaną przez RANKL w obu przypadkach

BMM i komórki RAW264.7. Wstępne traktowanie akteozydem również silnie obniżyło poziomy białka c-Fos i NFATc1 w BMM stymulowanych RANKL (ryc. 6D). Wyniki te sugerują, że akteozyd reguluje w dół indukujące RANKL mediatory tworzenia osteoklastów na poziomie genu i białka.

Akteozyd zmniejsza wewnątrzkomórkowe wytwarzanie ROS w BMM w sposób zależny od dawki Ponieważ wiadomo, że wewnątrzkomórkowe wytwarzanie ROS jest skorelowane z osteoklastogenezą stymulowaną przez RANKL, zbadaliśmy, czy akteozyd hamuje wytwarzanie ROS podczas różnicowania osteoklastów za pośrednictwem RANKL przy użyciu przepuszczalnego dla komórek, wrażliwego na utlenianie barwnika , DCFH-DA. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że ​​średni sygnał fluorescencji swoisty dla DCF w BMM był wyraźnie przesunięty w prawo po stymulacji RANKL w porównaniu z nietraktowanymi komórkami kontrolnymi (Fig. 7A). Przesunięcie to było podobne do przypadku, w którym po stymulacji RANKL zaobserwowano makrofagi RAW264,7 (dane nieprzedstawione). Traktowanie BMM akteozydem zmniejszało intensywność sygnału DCF w sposób zależny od dawki. Wstępne traktowanie 10 mM akteozydem prawie całkowicie zmniejszyło poziomy wewnątrzkomórkowego ROS wytwarzanego podczas różnicowania osteoklastów do nietraktowanych poziomów kontrolnych (ryc. 7B).

Doustne podawanie akteozydów hamuje zmiany osteoporotycznych markerów biochemicznych i utratę kości u myszy z wyciętymi jajnikami

Aby zbadać wpływ akteozydu na utratę masy kostnej, przygotowaliśmy zwierzęcy model osteoporozy przez wycięcie jajników. Wystąpiła znacząca różnica w masie ciała między OVX i Shammice podczas okresu eksperymentalnego (dane nie pokazane). Grupa miała znacząco wyższe poziomy IL-1b i IL-6 w surowicy niż grupa pozorowana (ryc. 8). Wzrost tych cytokin zapalnych wywołany wycięciem jajników został osłabiony przez doustne podawanie akteozydów (grupa AC). Poziomy markerów obrotu kostnego w surowicy, takich jak ALP, wapń, TRAP5b i OC były znacząco podwyższone w grupie OVX. Spośród tych markerów osteoporotycznych, zwiększone poziomy wapnia, TRAP5b i OC u myszy OVX były najwyraźniej hamowane przez leczenie akteozydem, podczas gdy poziom ALP w surowicy nie ulegał zmianie przez leczenie. Średnie maksymalne obciążenie złamania pośrodku trzonu prawej kości udowej było znacznie niższe w grupie OVX niż w grupie Sham (ryc. 9A). Leczenie akteozydem podniosło maksymalne wsparcie złamania do grupy Sham. Gdy kość korowa kości udowej została wycięta i obserwowana za pomocą mikroskopu optycznego, cechy osteoporotyczne pokazane w grupie OVX prawie całkowicie zniknęły u myszy AC (Fig. 9B). Aby zweryfikować wpływ akteozydu na model osteoporozy indukowanej przez OVX, analizowano BMD i parametry morfologiczne kości w beleczce jasnej proksymalnej kości udowej za pomocą mikro-CT. Jak pokazano na Fig. 9C, zmianę architektury beleczkowej kości udowej stwierdzono u myszy OVX, podczas gdy zmiana ta została zmniejszona przez leczenie akteozydem. Wyniki analizy mikro-CT wykazały, że BMD, miara wytrzymałości kości, została dramatycznie zmniejszona u myszy OVX (ryc. 9D). W porównaniu z grupą Sham, myszy OVX również wykazywały znaczące zmiany w BV/TV, Tb. Sp i Tb. N, ale nie w Tb.Th. Leczenie doustne akteozydami myszy OVX znacząco zapobiegało zmianom w BMD, jak również BV/TV i Tb.N.

Akteozyd nie wpływa na osteoblastogenezę w komórkach szpiku kostnego

Rola akteozydu na różnicowanie osteoblastów była dalej badana przy użyciu komórek szpiku kostnego. Jak pokazano na Fig. 10A, traktowanie DAG zwiększyło liczbę komórek wybarwionych na czerwono alizaryną i nie uległo to zmianie po wstępnym traktowaniu 10 mM akteozydem. Ilość obecnego barwnika wskazywała, że ​​połączone traktowanie akteozydem i DAG nie zmieniło mineralizacji (ryc. 10B). Podobnie, indukowane przez DAG wzrosty wewnątrzkomórkowej zawartości wapnia (ryc. 10C) i poziomów mRNA (ryc. 10D) markerów swoistych dla kości, takich jak Runx2, osterix, BSP i OC, nie zostały naruszone przez wstępne leczenieakteozyd.