Aktywacja receptora węglowodorów arylowych przez 6-formylindolo[3,2-b]karbazol łagodzi ostry uraz nerek poprzez hamowanie stanu zapalnego i apoptozy
Mar 20, 2022
Abstrakcyjny:Ostryuszkodzenie nerek(AKI) to wieloczynnikowa choroba o różnej etiologii. Receptor węglowodorów arylowych (AhR) jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym przez ligand, który reaguje na ligandy w celu wywołania lub zahamowania ekspresji genów, regulując w ten sposób różnorodne spektrum efektów biologicznych lub patofizjologicznych. Jednak wpływ AhR na AKI pozostaje nieznany. Przeprowadzono pojedyncze wstrzyknięcie dootrzewnowe 50% glicerolu w celu wywołania rabdomiolizy u myszy C57BL/6J. Dwustronnynerkowyszypułki były zamykane na 30 minut, a następnie usuwane w celu stymulacjinerkowyUraz I/R. Zastosowano 6-formylindolo[3,2-b]karbazol (FICZ), produkt fotooksydacji tryptofanu o wysokim powinowactwie do AhR. Badanie in vitro przeprowadzono na komórkach HK-2. Mioglobina żelaza i FICZ rozpuszczono w pożywce w różnych grupach komórkowych. Leczenie agonistą AhR FICZ istotnie złagodziło podwyższenie poziomu kreatyniny i mocznika w surowicy w AKI. Wywołane modelowaniem AKIuszkodzenie nerekzostał osłabiony przez FICZ. AhR jest wyrażany głównie w komórkach kanalików proksymalnych i może być aktywowany przez podanie FICZ. Tymczasem AKI uruchomiło produkcję cytokin prozapalnych u rannychnerki, podczas gdy FICZ powstrzymywał ich wypowiedzi. Ponadto FICZ skutecznie odwrócił apoptozę komórek w modelach AKI. Mechanicznie AKI stymulowała aktywację szlaków NF-κB i JNK wnerki, podczas gdy FICZ znacząco tłumił te odpowiadające ekspresje białek. W badaniu in vitro FICZ hamował również stan zapalny i apoptozę w komórkach HK-2 stymulowanych przez mioglobinę lub H/R. Podsumowując, agonizm AhR przez FICZ złagodził rabdomiolizę i AKI wywołane I/R. FICZ hamował stan zapalny i apoptozę poprzez tłumienie szlaków NF-κB i JNK w proksymalnych komórkach kanalików.
Słowa kluczowe:ostre uszkodzenie nerek, apoptoza, receptor węglowodorów arylowych, stan zapalny, komórki nabłonka kanalików nerkowych
CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK
WPROWADZANIEOstryuszkodzenie nerek(AKI) odnosi się do szybkiego spadkuczynność nerekw ciągu kilku godzin do kilku dni z powodunerkowyniewydolność perfuzji, leki lub trucizny nefrotoksyczne, niedrożność dróg moczowych i inne przyczyny.1 Kliniczne przyczyny AKI obejmują głównie uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne, substancje nefrotoksyczne (takie jak leki, środki kontraktowe i zawartość komórek mięśniowych uwolniona przez rabdomiolizę) i posocznicę. Każdego roku na świecie na AKI cierpi około 13,3 miliona ludzi.2 AKI, ze względu na wysoką śmiertelność i wysokie koszty, stanowi duże obciążenie.3 Główne mechanizmy patofizjologiczne obejmują urazynerkowyukład naczyniowy,4,5 stres retikulum endoplazmatycznego,6,7 uszkodzenie mitochondriów,8 apoptoza,9 stres oksydacyjny i stan zapalny.10 Rabdomioliza (RM) to zespół charakteryzujący się martwicą mięśni i uwolnieniem zawartości komórek mięśniowych do krążenia, podczas którego AKI jest najczęstszą komplikacją11; Niedokrwienie-reperfuzja (I/R) jest jedną z głównych patofizjologii AKI, stanowiącą 60% wszystkich przyczyn AKI.12 Obecnie nie ma skutecznego leczenia AKI spowodowanego obydwoma wyżej wymienionymi przyczynami, z wyjątkiem usunięcia etiologii, wspomagającej leczenie inerkowyTerapia zastępcza.
Receptor węglowodorów arylowych (AhR) podlega transkrypcji i translacji z genu AHR. U ludzi AhR ulega ekspresji w różnych narządach, w tym w płucach, grasicy,nerka,wątroba, jelito itp.13 AhR bez ligandów znajduje się w cytozolu w kompleksie białkowym zawierającym również dimer białka szoku cieplnego 90 (HSP90) i współopiekuńcze AIP i p23.14 Po związaniu z ligandem AhR jest aktywowany i wchodzi jądro, gdzie wiąże się z translokatorem jądrowym AhR (ARNT) i promuje transkrypcję wielu różnych genów w dół.15 Ligandy dla AhR są niezwykle zróżnicowane i można je sklasyfikować jako egzogenne lub endogenne. Ligandy o różnych źródłach i strukturach wiążą się z AhR z różnym powinowactwem i mogą wywoływać różne efekty fizjologiczne lub patologiczne.16 Wcześniejsze badania wykazały, że AhR z jego dalszymi szlakami ma funkcje przeciwzapalne,17 przeciwapoptotyczne,18 regulujące cykle komórkowe19 i regulujące odporność,20 które są ważnymi składnikami patogenezy AKI. Endogenne ligandy dla AhR pochodzą głównie z metabolizmu tryptofanu. 6-formyloindolo[3,2-b]karbazol (FICZ), produkt fotooksydacji tryptofanu, ma wysokie powinowactwo do AhR.21 Wcześniej FICZ wykazywał działanie ochronne w różnych modelach choroby.{{ 19}} Chociaż badacze stwierdzili, że aktywowane AhR przez toksyny mocznicowe miały niepożądane skutki u pacjentów z przewlekłymchoroby nerek(CKD),25 żadne badanie nie mierzyło zmian ekspresji w AKI. Nie jest również jasne, czy FICZ manerkowyefekt ochronny w rabdomiolizie i wywołanej przez I/R AKI, ponieważ AhR może aktywować zupełnie inne dalsze efekty.
Eksperymenty na zwierzętachWszystkie protokoły eksperymentalne i procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Zasadami Etyki Eksperymentów na Zwierzętach przyjętymi przez Sichuan University of Experimentation i zatwierdzonymi przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Sichuan University. Samce myszy C57BL/6 (10-12 tygodnie, waga między 25 a 27 g) zakupiono z Animal Laboratory Center of Sichuan University (Chengdu, Chiny). Myszy utrzymywano w stałej temperaturze (23 ± 2 stopnie) iw warunkach światła/ciemności (12/12 godzin), ze swobodnym dostępem do wody i pożywienia. Myszy przystosowano do tego środowiska przez 1 tydzień przed dalszymi badaniami. W modelu rabdomiolizy myszy losowo podzielono na cztery grupy: kontrolę (n {{10}}), FICZ (n=3), glicerol (n=6) i glicerol plus FICZ (n=6). Myszom w grupie z glicerolem wstrzyknięto obustronnie w tylne kończyny 50% glicerolu rozpuszczonego w 0,9% normalnej soli fizjologicznej (9 μl/g masy ciała), aby wywołać rabdomiolizę w obniżonym AKI. Tymczasem myszy w grupie kontrolnej otrzymały taką samą objętość soli fizjologicznej przez wstrzyknięcie domięśniowe. Jeśli chodzi o grupę glicerol plus FICZ, FICZ rozpuszczono w 2,5% PEG400 i rozcieńczono w 0,9% normalnej soli fizjologicznej do podawania dootrzewnowego w dawce 100 ug/kg/dzień przez cztery kolejne dni przed wstrzyknięciem glicerolu. Myszom w grupie FICZ podawano dootrzewnowo te same dawki FICZ przez cztery kolejne dni, bez wstrzykiwania glicerolu.
CISTANCHE POPRAWI NIEWYDOLNOŚĆ NEREK/NEREK
W modelu niedokrwienia nerek i reperfuzji myszy losowo podzielono na cztery grupy: kontrolną (n=6), FICZ (n=3), I/R (n=6) i I /R plus FICZ (n=10). Uraz w grupie I/R został wywołany przez zaciśnięcie nasady nerkowej za pomocą nieurazowych zacisków mikronaczyniowych przez 30 minut, a następnie 24-godzinną reperfuzję po usunięciu zacisku. Okluzję i reperfuzję potwierdzono zmianami kolorunerki. Myszy w grupie kontrolnej poddano tym samym zabiegom chirurgicznym z wyjątkiem zaciskania szypułek. Jeśli chodzi o grupę I/R plus FICZ, FICZ był podawany, jak wspomniano powyżej, przez cztery kolejne dni przed modelowaniem I/R. Podobnie myszy w grupie FICZ otrzymywały te same dawki FICZ przez cztery kolejne dni i przeszły wszystkie zabiegi chirurgiczne jako grupa kontrolna. Dwie grupy myszy zostały odpowiednio uśmiercone przez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (50 mg/kg, ip) i uśmiercone w 24 godziny po modelowaniu. Serum inerkapróbki zostały zebrane i przechowywane -80 stopni do dalszej analizy.
Testy biochemiczne surowicyPróbki krwi natychmiast wirowano przy 1509,3 g przez 20 minut w celu wyizolowania surowicy do testów. Poziomy kreatyniny (sCr), mocznika i kinazy kreatynowej (CK) w surowicy oznaczano automatycznym analizatorem biochemicznym (Mindray BS-240). Poziomy sCr grup modelujących wzrastające do dwukrotności ich wartości kontrolnych wskazywały na udane modelowanie AKI.
Ocena histologicznaTkanki nerki utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie, zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 4 μm. Skrawki barwiono kwasem nadjodowym-Schiffa (PAS) po deparafinizacji i rehydratacji. Skrawki barwione PAS badano pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniach ×200 lub ×400. Dziesięć pól zostało losowo wybranych w powiększeniu × 200 z każdej sekcji, a dwa sekcje zostały losowo wybrane z każdej próbki co najmniej trzech w każdej grupie do analizy półilościowej. Zmiany histopatologiczne oceniano na podstawie odsetka rannych/uszkodzonychnerkowykanaliki, na co wskazuje rozszerzenie kanalików, liza, przerwanie i formowanie odlewów. Uszkodzenie tkanki zostało ocenione w skali {{0}}, gdzie 0, 1, 2, 3 i 4 odpowiadają 0 procentom,<25%, 26%-50%,="" 51%-75%="" and="">76 procent rannych/uszkodzonychnerkowyodpowiednio kanaliki.26
Barwienie immunofluorescencyjneMysz zamarłanerkatkanki, zatopione w OCT, pocięto na skrawki o grubości 4-μm na kriostacie i przechowywano w temperaturze -80 stopni do barwienia. Sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) zawierającą 5% surowicę końską podawano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania. Następnie skrawki inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami w nawilżanej komorze w 4 stopniach przez noc. Po przemyciu PBS przez 1 godzinę stosowano odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, unikając światła. Próbki następnie przemyto PBS, wybarwiono DAPI (D8200, Solarbio) i na koniec założono szkiełkami nakrywkowymi. Pierwotne przeciwciała zastąpiono PBS w kontrolach negatywnych. Przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenie 1:500; Jackson ImmunoResearch) dopasowane do przeciwciał pierwszorzędowych zastosowano do eksportu sygnałów fluorescencyjnych. Obrazy rejestrowano i analizowano za pomocą oprogramowania do mikroskopii ZEN 2012 (wersja niebieska).
ImmunohistochemiaTkanki nerki utrwalono w formalinie, odwodniono, zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki o grubości 5 μm, a następnie zamontowano na szkiełkach. Szkiełka zablokowano następnie 2,5% normalną surowicą kozią i inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 4 stopniach. Szkiełka przepłukano trzykrotnie w PBS, a do barwienia użyliśmy zestawu VECTASTAIN ABC Kit (Vector). Obrazy zostały wykonane przy użyciu oprogramowania do mikroskopii ZEN 2012 (wersja niebieska).
Barwienie TUNELTkanki nerki utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 4 μm. Barwienie końcowe dUTP nick end labeling (TUNEL) za pośrednictwem terminalnej transferazy dezoksynukleotydylowej przeprowadzono przy użyciu systemu DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (G3250, Promega). W celu barwienia jądra skrawki inkubowano z DAPI (D8200, Solarbio) w rozcieńczeniu 1:500. Obrazy zostały zaprezentowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniach ×400. Zliczyliśmy komórki dodatnie i zbadaliśmy co najmniej 10 pól na sekcję w każdej próbce.
CISTANCHE POPRAWI FUNKCJĘ NEREK/NEREK
Analiza Western blotThetkanka nerkowaKomórki s lub HK{{0}} homogenizowano za pomocą buforu do lizy wytrącania radioimmunologicznego (RIPA) (P0013B, Beyotime Biotechnology) zawierającego 1‰ inhibitory proteinazy (Keygen Biotech). Po odwirowaniu (18 894,2 g, w 4 stopniach) przez 15 minut, zebrano supernatant i oznaczono stężenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicynchoninowego (Beyotime Institute of Biotechnology) zgodnie z instrukcjami producenta. Lizat białkowy w równych ilościach rozdzielono przez 10% - 12% SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membranę z difluorku winylidenu (Bio-Rad). Błony zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (wag./obj.) w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% Tween-20 (TBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami podstawowymi noc w 4 stopniach . Po trzykrotnym przepłukaniu TBS-T w 5-minutowych odstępach, błony inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z HRP w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Bloty białkowe na błonach wizualizowano za pomocą substratu Immobilon Western Chemiluminescent HRP (Millipore Corporation) z Bio-Rad Chemi Doc MP. Analizę densytometryczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ 6.0 (National Institutes of Health), a jako kontrolę obciążenia zastosowano -aktynę.
Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistymCałkowite RNA z zamrożonychnerkapróbki izolowano za pomocą zestawu do izolacji Animal total RNA (Foregene). Stężenie wyizolowanego mRNA określono przy użyciu determinatora ScanDrop 100 (Analytik Jena), a cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript™ RT (Takara Bio). Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu iTaq™ Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) w systemie PCR (CFX Connect; Bio-Rad) po odwrotnej transkrypcji. Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli S1. Względne ilości genów obliczono metodą 2-∆∆Ct w porównaniu z poziomami ekspresji -aktyny.
Hodowla komórkowa i leczenieLudzka linia komórek kanalików proksymalnych nerki (komórka HK-2) była uprzejmym darem od prof. płodowa surowica bydlęca (SH30084.03, Hyclone), w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza W modelu mioglobiny komórki w stanie wzrostu wykładniczego podzielono na cztery grupy: grupa FICZ, inkubowana ze 100 nmol/L FICZ przez 24 godziny; grupa mioglobiny, inkubowana z 200 μmol/L mioglobiny żelaza przez 24 godziny; grupa Mb plus FICZ, inkubowana z FICZ przy 100 nmol/l z podaniem leczenia mioglobiną; i grupie kontrolnej, komórki inkubowano z samą pożywką pełną w grupie kontrolnej. Mioglobina żelaza została przygotowana zgodnie z wcześniejszym opisem.26,27 W modelu hipoksji/reoksygenacji (H/R) podzieliliśmy komórki HK-2 na trzy grupy. Komórki w grupie H/R hodowano w warunkach hipoksji (1 procent O2, 94 procent N2 i 5 procent CO2) w pożywce bez surowicy przez 12 godzin w celu wywołania hipoksji. Następnie komórki przeniesiono z powrotem do zwykłej pożywki hodowlanej z tlenem na 6 godzin w celu ponownego natlenienia. Komórki kontrolne inkubowano w pełnej pożywce hodowlanej w zwykłym inkubatorze. Podawanie FICZ (100 nmol/l) w grupie H/R plus FICZ podano tuż przed operacją H/R.
Test aneksyny V-FITC/jodku propidynyZastosowaliśmy zestaw do analizy apoptozy Annexin V-FITC (AO2001- 02PH, SUNGENE). Komórki HK-2 wysiano na sześciostudzienkowych płytkach. Po wystawieniu na działanie różnych pożywek przez 24 godziny, przylegające komórki oddzielono za pomocą trypsyny. Następnie komórki ponownie zawieszono w buforze wiążącym i wybarwiono 5 µl aneksyny V-FITC i 5 µl jodku propidyny (temperatura pokojowa, 15 minut, unikając ciemności). Komórki apoptotyczne identyfikowano za pomocą cytometru przepływowego.
Analiza statystycznaDane podano jako średnią ± SD. Wartości statystyczne dla porównań wielokrotnych grup analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a porównanie w parach przeprowadzono za pomocą testu SNK. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono w SPSS 21.0. P < 0,05="" uznano="" za="" statystycznie="">
WYNIKI
Agonista AhR FICZ osłabiony AKIAby zweryfikować, czy FICZ zapewnia efekt renoprotekcyjny, ustaliliśmy modele AKI wywołane rabdomiolizą i niedokrwieniem/reperfuzją (I/R). Następnie oceniliśmy czynność nerek i zmiany patologiczne w tkankach nerek. Brak istotnych zaburzeń poziomu kreatyniny, mocznika, CK, aktywności metabolicznej enzymów wątrobowych w surowicy
w grupie FICZ zaobserwowano (ryc. 1A-C; tabela S3). Jak pokazano na Figurze 1A-B, podawanie FICZ znacząco zmniejszyło znaczny wzrost poziomu kreatyniny i mocznika w surowicy po 24 godzinach po wstrzyknięciu glicerolu lub operacji I/R, bez wpływu na poziom CK w surowicy myszy z rabdomiolizą (Figura 1C). Tymczasem barwienia PAS wykazały, że FICZ skutecznie łagodził patologiczne uszkodzenia charakteryzujące się rozszerzeniem kanalików, obrzękiem, tworzeniem odlewu i utratą rąbka szczoteczkowego w porównaniu z modelami AKI w obu modelach (ryc. 1D-E). Barwienie immunofluorescencyjne i wyniki PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że zastosowanie FICZ znacznie zmniejszyło ekspresję i transkrypcję lipokaliny neutrofilowej związanej z żelatynazą (NGAL), biomarkera uszkodzenia nerek, u rannychnerki(Rysunek 2A-D). Podobnie, FICZ hamował również indukowany glicerolem poziom mRNAuszkodzenie nerekcząsteczka 1 (KIM1) po wstrzyknięciu glicerolu (Rysunek 2A).
Zbadaliśmy dalej transkrypcję i ekspresję AhR wnerkatkanki. Na Figurze 3 wyniki rt-PCR, western blotting, immunohistochemii i barwienia immunofluorescencyjnego hamowały, że poziomy mRNA i białka AhR były znacząco obniżone w obu grupach modelowania AKI. Dootrzewnowa iniekcja FICZ znacząco stymulowała jego transkrypcję i ekspresję w grupach glicerolu plus FICZ i I/R plus FICZ. Ponieważ komórki nabłonka kanalików nerkowych odgrywają istotną rolę w AKI,28 zbadaliśmy, czy AhR może ulegać ekspresji w komórkach nabłonka kanalików. Wyniki immunochemii wykazały, że AhR ulegał ekspresji głównie w kanalikach nerkowych (Figura 3C-D). Poza tym skrawki tkanki nerki barwiono lektyną, markerem dla komórek nabłonka proksymalnego kanalika, AhR i DAPI dla jąder. Jak pokazano na rycinie 3E-F, AhR połączyło się z lektyną, co wskazuje, że AhR ulega ekspresji głównie w komórkach nabłonka kanalików proksymalnych. Podsumowując, FICZ chronił przed rabdomiolizą i AKI wywołanym przez I/R poprzez aktywację AhR u rannychnerki.
FICZ zmniejszył produkcję cytokin prozapalnych w nerkach myszy AKIAby ocenić, czy FICZ był w stanie wywołać zapalenie wywołane przez AKI, zastosowano q-PCR do wykrywania poziomów transkrypcji czynników prozapalnych w nerkach. Poziomy mRNA IL-1, IL-6 i TNF- w tkankach nerek znacznie wzrosły po wstrzyknięciu glicerolu lub uszkodzeniu I/R, podczas gdy podawanie FICZ znacząco zmniejszyło transkrypcje tych genów (Figura 4A). Konsekwentnie, wywołane modelowaniem AKI podwyższenie poziomu IL-1, IL-6 i TNF- zostało skutecznie osłabione przez traktowanie FICZ (Figura 4B-C). Wyniki te sugerują, że FICZ może złagodzić zapalenie nerek w modelowaniu AKI.
FICZ zmniejszył apoptozę komórek w nerkach myszy AKIOprócz zapalenia, apoptoza komórek jest kolejną ważną cechą w patogenezie AKI. Zastosowaliśmy barwienie TUNEL, aby zbadać wpływ FICZ na apoptozę nerek u myszy indukowanych I/R. Jak pokazano na rysunku 5B, FICZ znacznie zmniejszył liczbę komórek TUNEL-dodatnich wnerkimyszy I/R. Poza tym
Wyniki barwienia immunohistochemicznego wykazały, że ekspresja rozszczepionej kaspazy -3, istotnego czynnika kata modyfikującego białka związane z apoptozą, została znacznie zmniejszona po podaniu FICZ w modelu rabdomiolizy (Figura 5A). Tymczasem projekt FICZ może obniżyć poziom mRNA kaspazy-3 zarówno w modelach rabdomiolizy, jak i AKI indukowanej przez I/R. Ponadto wyniki analizy Western blot wykazały, że FICZ może zmniejszać ekspresję rozszczepionej kaspazy-3 i Bax oraz zwiększać poziom Bcl-2 wnerkimyszy AKI (Figura 5C). Podsumowując, odkrycia te wskazują, że FICZ wykazał działanie antyapoptotyczne wnerkimyszy AKI.
FICZ tłumił sygnalizację NF-κB i JNK w nerkach myszy AKI
Aktywacja szlaków sygnałowych została dalej zbadana za pomocą analizy Western blotting, aby poznać mechanizm przeciwzapalny i przeciwapoptotyczny FICZ wnerkimyszy AKI. Jak pokazano na Figurze 6, poziomy fosforylacji IκB i P65 w nerkach myszy AKI były oczywiście wyższe niż w grupach leczonych FICZ. Ponadto, wcześniejsze badania wyjaśniły, że sygnalizacja JNK może modulować apoptozę i oddziaływać z sygnalizacją NF-κB.29 Stwierdziliśmy, że fosforylacja JNK była znacznie wyższa w porównaniu z odpowiednimi grupami kontrolnymi, podczas gdy leczenie FICZ skutecznie je odwracało. Powyższe wyniki sugerowały, że szlaki NF-κB i JNK przyczyniły się do przeciwzapalnej i przeciwapoptotycznej aktywności FICZ w nerkach myszy AKI.
FICZ chronił komórki HK-2 przed stymulacją mioglobiny i uszkodzeniem H/R poprzez hamowanie stanu zapalnego i apoptozyZeznaliśmy, czy aktywacja AhR przez FICZ może hamować stan zapalny i apoptozę w stymulowanych mioglobiną ludzkich komórkach nabłonka kanalika proksymalnego (HK-2). Po pierwsze, potwierdziliśmy, że ekspresja AhR in vitro w komórkach stymulowanych przez mioglobinę lub uszkodzonych przez H/R była znacząco obniżona, podczas gdy została odwrócona przez FICZ (Figura 7B-D). Szybkość apoptozy komórek każdej grupy w modelu mioglobiny wykryto za pomocą cytometrii przepływowej (Figura 7A). W porównaniu z grupą kontrolną nie było wzrostu apoptozy i martwicy komórek HK-2 w grupie FICZ. W przeciwieństwie do tego, po stymulacji mioglobiny, komórki HK-2 wykazywały dużą liczbę komórek apoptotycznych, stanowiących 12,3%. Podczas gdy grupa Mb plus FICZ wykazała znacznie mniej komórek apoptotycznych. Ponadto FICZ obniżył ekspresję rozszczepionej kaspazy-3 i Bax w stymulowanych przez mioglobinę lub uszkodzonych przez H/R komórkach HK-2 (Figura 7BD). Ponadto, wzrost czynników prozapalnych wywołany przez mioglobinę lub H/R został znacząco odwrócony przez FICZ (Figura 7B-D). Konsekwentnie, poziomy fosforylacji P65 i JNK były znacznie wyższe po stymulacji mioglobiną lub uszkodzeniu H/R, podczas gdy leczenie FICZ skutecznie je osłabiło (Figura 7B-D). W związku z tym wyniki te wskazują, że agonista AhR FICZ chronił komórki HK-2 przed mioglobiną i H/R poprzez hamowanie stanu zapalnego i apoptozy.
DYSKUSJA
W bieżącym badaniu stwierdziliśmy, że agonizm AhR przez FICZ może łagodzićuszkodzenie nerekw rabdomiolizie i AKI wywołanej niedokrwieniem/reperfuzją. AhR był obecny głównie w komórkach nabłonka kanalików proksymalnych, podczas gdy agonista AhR FICZ mógł chronić komórki nabłonka kanalików proksymalnych przed AKI poprzez regulację stanu zapalnego i apoptozy komórek poprzez szlaki sygnałowe NF-κB i JNK. Wcześniejsze badania wykazały, że toksyny mocznicowe, takie jak siarczan indoksylu, były agonistami AhR.30 Pacjenci z PChN byli narażeni na działanie tych toksyn mocznicowych, dlatego AhR aktywował zarówno pacjentów szpitalnych, jak i myszy z CKD.25,31 Ostatnie badania wykazały, że endogenne metabolity z mikrobioty jelitowej32 lub metabolizm mocznicy może aktywować AhR33,34 w nerkach myszy i szczurów z CKD, które wykazywały inne tendencje niż nasze odkrycia u myszy AKI. Jednak odrębne ligandy dla AhR mogą wpływać na różne dalsze szlaki sygnałowe.35 Ponadto, wcześniejsze badania nad AKI wykazały, że leflunomid może aktywować AhR w AKI wywołanym I/R i poprawiać patologiczne uszkodzenia nerek poprzez regulację odporności i hamowanie stanu zapalnego.36 MiR{{ 11}}b aktywował AhR poprzez hamowanie represora AhR i chronił nerkę przed uszkodzeniem wywołanym cisplatyną.37 Bajkalina łagodziła działanie kwasu arystolochowego Iuszkodzenie nerekpoprzez zależną od AhR indukcję CYP1A1/2 w wątrobie.38 Nasze wyniki były zgodne z wcześniejszymi ustaleniami dotyczącymi AKI. Ponadto, agonista AhR, FICZ, wywierał działanie ochronne w różnych modelach chorób, takich jak zespół metaboliczny39, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka,22 zapalenie okrężnicy,23 łuszczyca,24 itd.
Zgodnie z ostatnimi wynikami Huanga i wsp.22 eksperymentalne modelowanie autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka aktywowało szlaki NF-κB i STAT1/3 i zwiększało ekspresję dalszych czynników prozapalnych IL-1, IL-6 i TNF - . Tymczasem wzrosła apoptoza komórek. W przypadku leczenia agonistą AhR stwierdzono zmniejszoną ekspresję cytokin prozapalnych i zahamowanie szlaku NF-κB. Aktywacja AhR doprowadziła również do zahamowania apoptozy komórek. Wyniki te były zgodne z naszym eksperymentem. Odkryli również, że aktywacja AhR przesunęła polaryzację makrofagów z M1 na M2. Sugerowało to, że AhR może uczestniczyć w regulacji immunologicznej, co było kolejnym możliwym wyjaśnieniem regulacji dalszych cytokin prozapalnych. Było kilka doniesień o ujemnej korelacji między AhR a podjednostką RelA (P65) ekspresji NF-κB w różnych komórkach. Koimmunoprecypitację przeprowadzono z całkowitymi ekstraktami komórkowymi komórek Hepa1c1c7. Ponieważ zarówno AhR, jak i NF-κB mogą podlegać zależnej od sygnału translokacji jądrowej, a ARNT nie zostało powiązane z P65, założono zatem, że połączenie AhR i P65 zachodziło głównie w kompartmencie cytoplazmatycznym.40 Aktywność transkrypcyjna AhR i NF-κB są modulowane przez koaktywatory transkrypcji. Jak wcześniej informowaliśmy, ich koaktywatory częściowo się pokrywały. W konsekwencji można sobie wyobrazić, że może istnieć współzawodnictwo o wiązanie koaktywatora, tak że gdy jeden ze szlaków zostanie aktywowany, drugi będzie tłumiony przez współzawodnictwo o dostępność koaktywatora.41 Ujemna korelacja została ponownie zweryfikowana przez badania epigenetyczne.42 W międzyczasie NF -κB wpływa na JNK, prawdopodobnie poprzez reaktywne formy tlenu (ROS).29 Mitochondrialne ROS mogą promować aktywację NF-κB, a JNK przyczynia się do wytwarzania ROS, co z kolei stymuluje aktywację JNK. Chociaż szczegółowy mechanizm wymaga dalszych badań, można założyć, że istnieje dodatnia korelacja między szlakami NF-κB i JNK.
CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK/NEREK
Wcześniejsze badania43,44 wykazały, że w przypadku rabdomiolizy i AKI wywołanych przez I/R, stan zapalny i apoptoza komórek uległy znacznemu zwiększeniu w grupach modelowania, podczas gdy szlaki NF-κB i JNK zostały aktywowane. Wyniki te były zgodne z naszymi wynikami. Główne mechanizmy AKI obejmowały niedotlenienie, reakcję na stres oksydacyjny i stan zapalny. Mogą promować śmierć komórek (apoptozę, autofagię, nekrozę) lub przebudowę tkanek. Uszkodzenie lub śmierć komórki uwolniły substancje z wzorcami molekularnymi powiązanymi z uszkodzeniem (DAMP) i wzorcami molekularnymi powiązanymi z patogenami (PAMP), które dalej nasilały stan zapalny.45 Interakcje DAMP i PAMP z czujnikami wrodzonego układu odpornościowego również wzmacniały odpowiedź zapalną.46 w międzyczasie śmierć komórki, w tym apoptoza, była również zaangażowana w patogenezę AKI. Ekspresja rodziny kaspaz jest zwiększona, a wiele powiązanych z mitochondriami regulatorów antyapoptotycznych i proapoptotycznych zmienia się podczas AKI.26,47,48 Podsumowując, zapalenie i apoptoza komórek wzajemnie się promują i oba odgrywają istotną rolę w AKI. Odkryliśmy, że aktywacja AhR przez FICZ łagodziła stan zapalny i apoptozę poprzez hamowanie szlaków NF-κB i JNK.
Pozostaje jednak kilka problemów do zbadania. Nasze badanie dotyczyło głównie renoprotekcyjnego wpływu aktywacji AhR przez FICZ i jej możliwego mechanizmu w rabdomiolizie i AKI wywołanej I/R. Dodatkowo zastosowaliśmy prewencyjne podawanie FICZ myszom przed modelowaniem AKI. Chociaż tryb podawania był szeroko stosowany w poprzednich badaniach, 49-51 istniały rozbieżności między doświadczeniami na zwierzętach a praktyką kliniczną. W przyszłości, w jaki sposób ekspresja AhR zmienia się pod wpływem rozwoju AKI, a dokładniej wewnątrzkomórkowej lokalizacji AhR, wymaga dalszych badań. Chociaż spadek fosforylacji NF-κB i JNK pod wpływem działania FICZ jest wyraźny, potrzebne są dalsze eksperymenty z odpowiednimi środkami blokującymi. Ponadto, aby lepiej wyjaśnić mechanizm, do badań in vivo potrzebne są myszy z nokautem AhR i nadekspresją, podczas gdy do badań in vitro potrzebne są myszy z nadekspresją i wyciszeniem AhR. Ponadto znacznie więcej badań wymaga sposób, w jaki różne ligandy wpływają na różne szlaki sygnałowe AhR.
