Aktywne przejście fazy pamięci strachu od ponownej konsolidacji do wyginięcia poprzez zapobieganie ponownej konsolidacji za pośrednictwem ERK

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Odzyskiwaniestrachpamięćindukuje dwa przeciwstawne procesy pamięciowe, tj. rekonsolidację i wygaśnięcie. Krótkie odzyskanie powoduje ponowną konsolidację, aby utrzymać lub wzmocnić strachpamięć, podczas gdy długotrwałe odzyskiwanie wygasza tę pamięć. Chociaż zbadano mechanizmy rekonsolidacji i wygaszania, nie wiadomo, w jaki sposób fazy pamięci strachu są przełączane z rekonsolidacji na wygasanie podczas odzyskiwania pamięci. Tutaj pokazujemy, że proces przejścia pamięci zależnej od kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) po odzyskaniu reguluje przełączanie faz pamięci z ponownej konsolidacji na wygaśnięcie, zapobiegając indukcji ponownej konsolidacji w zadaniu unikania hamowania (IA) u samców myszy. Po pierwsze, faza pamięci przejściowej, która anuluje indukcję rekonsolidacji, ale jest niewystarczająca do uzyskania wygaszania, została zidentyfikowana po rekonsolidacji, ale przed fazami wygaszania. Po drugie, faza rekonsolidacji, przejścia i wymierania poodzyskiwanie pamięciwykazał wyraźne sygnatury molekularne i komórkowe poprzez białko wiążące elementy reagujące na cAMP (CREB) i fosforylację ERK w ciele migdałowatym, hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC). Faza rekonsolidacji wykazała zwiększoną fosforylację CREB, podczas gdy faza ekstynkcji wykazywała kilka populacji neuronalnych z różnymi kombinacjami fosforylacji CREB i/lub ERK w tych obszarach mózgu. Co ciekawe, trzy fazy pamięci, w tym faza przejściowa, wykazały przejściową aktywację ERK natychmiast po odzyskaniu. Co najważniejsze, blokada ERK w ciele migdałowatym, hipokampie lub mPFC w fazie pamięci przejściowej odhamowała indukowane przez konsolidację wzmocnienie pamięci IA. Obserwacje te sugerują, że szlak sygnalizacyjny ERK aktywnie reguluje przejście fazy pamięci od ponownego utrwalenia do wygaśnięcia, a proces ten działa jak przełącznik, który anuluje ponowne utrwalenie strachupamięć.

Słowa kluczowe: ERK; wygaśnięcie; strach przed pamięcią; konsolidacja; przemiana

1 Wydział Nauk Biologicznych, Wydział Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Rolniczy w Tokio 156-8502, Japonia, oraz

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japonia

Oświadczenie o znaczeniu

Odzyskiwanie pamięci strachuindukuje dwa przeciwstawne procesy pamięciowe; ponowna konsolidacja i wymieranie. Rekonsolidacja utrzymuje/wzmacniastrach przed wspomnieniem, a wyginięcie osłabia pamięć strachu. Nie wiadomo, w jaki sposób fazy pamięci są przełączane z rekonsolidacji na wygaśnięcie podczas odzyskiwania. Tutaj zidentyfikowaliśmy aktywny proces przejścia pamięci działający jako przełącznik, który hamuje rekonsolidację. Ta faza przejściowa pamięci wykazała przejściowy wzrost fosforylacji kinazy regulowanej sygnałem pozakomórkowym (ERK) w ciele migdałowatym, hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC). Co ciekawe, hamowanie ERK w tych regionach w fazie przejściowej odhamowało zależne od konsolidacji wzmocnienie pamięci unikania hamowania (IA). Odkrycia te sugerują, że proces pamięci przejściowej aktywnie reguluje przełączanie faz pamięci strachu w pamięci strachu, zapobiegając indukcji ponownej konsolidacji poprzez aktywację szlaku sygnalizacyjnego ERK.

Wstęp

Pamięćodzyskiwanie nie jest procesem pasywnym, ale raczej procesem dynamicznym, który umożliwia zachowanie, wzmocnienie, osłabienie lub zmianę/aktualizację oryginalnej pamięci (Misanin i in., 1968; Schneider i Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus i in., 1968; ., 1979; Gordon, 1981; Nader i in., 2000; Nader i Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima i in., 2014). Co ważne, odzyskana pamięć warunkowego strachu poprzez krótką ponowną ekspozycję na bodziec warunkowy (CS) staje się nietrwała i wymaga zależnej od ekspresji genów ponownej konsolidacji w celu jej utrzymania lub wzmocnienia (Nader i wsp., 2000; Dudai, 2002; Kida i wsp., 2002; Suzuki i wsp. 2004; Tronel i wsp. 2005; Fukushima i wsp. 2014). Odwrotnie, ciągła lub powtarzana ponowna ekspozycja na CS wywołuje wygaśnięcie pamięci, co osłabia pamięć strachu (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers i Davis, 2002). Tak więc odzyskiwanie pamięci strachu indukuje dwa przeciwstawne procesy pamięciowe, tj. rekonsolidację i wygaśnięcie, chociaż oba procesy są indukowane przez ponowną ekspozycję na identyczny CS, ale różnią się w zależności od czasu trwania ponownej ekspozycji na CS.

Wspólną i krytyczną cechą biochemiczną rekonsolidacji i wymierania jest wymóg ekspresji genów, w której pośredniczy białko wiążące element reagujący na cAMP (CREB) (Mamiya et al., 2009). Co ciekawe, wykazaliśmy kontrastujące sygnatury molekularne, anatomiczne i behawioralne między fazami rekonsolidacji i wygasania kontekstowej pamięci strachu (Suzuki i in., 2004; Mamiya i in., 2009). Blokowanie syntezy białek w fazie rekonsolidacji zaburza pierwotny strachpamięć, podczas gdy blokowanie syntezy białek podczas fazy wygaszania nie powoduje tego, chociaż kontekstowa pamięć strachu została reaktywowana. Wymóg regionów mózgu wykazujących aktywację ekspresji genów, w której pośredniczy CREB, różni się między rekonsolidacją a wymieraniem; rekonsolidacja zależy od ciała migdałowatego i hipokampu, podczas gdy wygaszanie zależy od ciała migdałowatego i przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC). Jednak przebieg czasowy aktywacji CREB migdałowatego różni się między fazami rekonsolidacji i wygaszania pamięci. Obserwacje te sugerowały, że fazy rekonsolidacji i wymierania nie są niezależne, ale raczej wzajemnie na siebie oddziałują. Co ciekawe, ostatnie badania zidentyfikowały okno czasowe (faza przejścia), które nie wykazuje aktywacji kinazy regulowanej sygnałem pozakomórkowym (ERK) w ciele migdałowatym po ponownej konsolidacji, ale przed fazami wymierania następującymi po odzyskaniu słuchowej pamięci strachu (Merlo i wsp., 2018 ). Podsumowując, odkrycia te sugerują możliwe mechanizmy, dzięki którym fazy pamięci są przełączane z rekonsolidacji na wygaśnięcie podczas odzyskiwania pamięci strachu. Innymi słowy, możliwe jest, że proces przenoszenia pamięci aktywnie reguluje ten przełącznik.

W zadaniu unikania hamowania (IA) myszy otrzymują elektryczny wstrząs stopy po wejściu do ciemnego przedziału z jasnego przedziału i uformowaniupamięćaby uniknąć ciemnego przedziału. Wcześniej, stosując to zadanie, pokazaliśmy, że fazy rekonsolidacji i wygaszania mogą być rozróżniane w momencie, gdy mysz wchodzi do ciemnego przedziału z jasnego przedziału podczas sesji ponownej ekspozycji (Fukushima et al., 2014). Dlatego to zadanie pozwala nam scharakteryzować perspektywiczne sygnatury molekularne faz rekonsolidacji i wygaszania, w przeciwieństwie do klasycznego paradygmatu kontekstowego warunkowania strachu, w którym reaktywacja pamięci uwarunkowanego strachu przez ponowną ekspozycję na CS inicjuje zarówno ponowną konsolidację, jak i wygaśnięcie; krótka (3 min) ponowna ekspozycja na uwarunkowany kontekst indukuje ponowną konsolidację, podczas gdy długa (30 min) lub powtarzana ponowna ekspozycja na ten kontekst indukuje wygaśnięcie (Eisenberg et al., 2003; Pedreira i Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee i in., 2008; Mamiya i in., 2009). Ponadto stwierdziliśmy, że odzyskana pamięć IA jest wzmacniana poprzez rekonsolidację pamięci w tym zadaniu (Fukushima i in., 2014).

Zrozumienie mechanizmu przejścia od ponownej konsolidacji do wygaśnięcia podczas odzyskiwania strachupamięć, chcieliśmy zidentyfikować i scharakteryzować molekularne, komórkowe i behawioralne sygnatury faz rekonsolidacji, przejścia i wygaszania pamięci IA. Przeanalizowaliśmy aktywację CREB i ERK w ciele migdałowatym, hipokampie i mPFC w fazach rekonsolidacji, przejścia i wygaszania oraz zbadaliśmy role aktywacji ERK w tych procesach pamięci.

Materiały i metody

Myszy Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Japan Neuroscience Society i Tokyo University of Agriculture). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Rolniczym w Tokio (zezwolenie nr 280037). Wszystkie zabiegi chirurgiczne przeprowadzono w znieczuleniu Nembutalem i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Samce myszy C57BL/6N otrzymano z Charles River. Myszy trzymano w klatkach po pięć lub sześć, utrzymywanych w cyklu 12/12 godzin światło/ciemność i umożliwiano im dostęp do pożywienia i wody ad libitum. Podczas badania myszy miały co najmniej osiem tygodni. Testy przeprowadzono w lekkiej fazie cyklu. Wszystkie eksperymenty prowadzono w sposób ślepy na warunki leczenia myszy.

Test IA Aparat do IA typu step-through (OHARA Pharmaceutical) składał się z pudełka z oddzielnymi przedziałami jasnymi i ciemnymi (oba 15,5 12,5 11,5 cm). Przedział świetlny oświetlano światłem fluorescencyjnym (2500 luksów; Fukushima i wsp., 2008, 2014; Zhang i wsp., 2011; Ishikawa i wsp., 2016). Przed rozpoczęciem treningu IA myszy traktowano indywidualnie przez 2 minuty każdego dnia przez jeden tydzień. Podczas sesji treningowych każdej myszy pozwolono przyzwyczaić się do jasnego przedziału przez 30 s, a drzwi gilotynowe podniesiono, aby umożliwić dostęp do ciemnego przedziału. Opóźnienie wejścia do ciemnego przedziału było uważane za miarę przyswajania. Gdy tylko mysz weszła do ciemnego pomieszczenia, gilotynowe drzwi zostały zamknięte. Po 5 s wykonano wstrząs stopy (0,2 mA) przez łączny okres 2 s (trening). Po 24 godzinach od sesji treningowej mysz ponownie umieszczano w jasnym przedziale, aż weszła do ciemnego przedziału (średnia 459 6 15,49 s). Natychmiast po tym, jak mysz weszła do ciemnego przedziału, drzwi gilotynowe zostały zamknięte i mysz pozostawała w ciemnym przedziale przez różny czas (0, 1 lub 10 minut) bez wstrząsu stopy (reaktywacji). Pamięć oceniano 48 godzin później [test poreaktywacyjnej pamięci długoterminowej (PR-LTM)] jako opóźnienie przejścia myszy do ciemnego przedziału po umieszczeniu w przedziale jasnym, jak w przypadku reaktywacji.

W pierwszym eksperymencie zbadaliśmy wpływ hamowania syntezy białek po reaktywacji (ponowna ekspozycja na ciemny przedział przez 0, 1 lub 10 min; ryc. 1). Inhibitor syntezy białek, anizomycyna (ANI; Wako) rozpuszczono w soli fizjologicznej (pH doprowadzono do 7.0-7,4 za pomocą NaOH). Myszy trenowano w sposób opisany powyżej, a 24 godziny później otrzymywały nośnik (VEH) lub ANI (150 mg/kg, ip) natychmiast po ponownej ekspozycji w ciemnym przedziale przez 0, 1 lub 10 minut bez wstrząsu stopy (reaktywacja). Przy tej dawce ANI hamuje 90 procent syntezy białek w mózgu w ciągu pierwszych 2 godzin (Flood i wsp., 1973). W 48 h po sesji reaktywacyjnej poszczególne myszy ponownie umieszczono w przedziale światła i oceniono latencję krzyżową.

W drugim eksperymencie [ immunohistochemia ufosforylowanego CREB (pCREB) i ufosforylowanego ERK (pERK); Figi. 2-5] zbadaliśmy regiony mózgu, które zostały aktywowane po ponownej ekspozycji na światło (do momentu wejścia myszy do ciemnego przedziału, ponowna ekspozycja na ciemny przedział przez 0 min) lub ciemnego przedziału (ponowna ekspozycja ekspozycja na ciemny przedział przez 1 lub 1 0 min). Myszy podzielono na cztery Fukushima et al. · Przejście faz pamięci strachu po odzyskaniu J. Neurosci., 10 lutego 2021 r., • 41(6):1288–1300 • 1289 grup. W 24 h po treningu, poszczególne myszy ponownie wystawiono na działanie jasnego przedziału, a następnie po ich wejściu z ciemnego przedziału pozostały w ciemnym przedziale [reaktywacja: 0 min w przedziale ciemnym, grupa rekonsolidacja (Recon); 1 min, grupa przejściowa (Tran); 10 min, grupa ekstynkcji (Ext)]. Inna grupa myszy nie została przywrócona do przedziału jasnego/ciemnego [grupa niereaktywowana (NR)]. Myszy następnie znieczulono Nembutalem (750 mg/kg, ip) w 5, 15 lub 30 minut po reaktywacji.

W trzecim eksperymencie (mikroinfuzja U0126; ryc. 6,7) zbadaliśmy wpływ hamowania ERK w ciele migdałowatym, hipokampie lub mPFC napamięćponowna konsolidacja/ulepszenie, przejście i wymieranie. Inhibitor MEK U0126 (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym zawierającym trzy krople Tween 80 (Sigma) w 2,5 ml 7,5% dimetylosulfotlenku (Wako) i dostosowano do pH 7.4 z NaOH. Myszy trenowano jak opisano powyżej, a 24 godziny później umieszczono je z powrotem w przedziale światła (reaktywacja). Myszom podano mikroinfuzję U0126 (1 mg) lub VEH do różnych obszarów mózgu bezpośrednio po (ryc. 6A, C, E-H, 7A-C) lub 30 min po (Rys. 6B, D) reaktywacja. W 48 h po reaktywacji poszczególne myszy ponownie umieszczono w przedziale światła i oceniono latencję krzyżową (PR LTM). Mikroinfuzje do hipokampa i mPFC (0,5 ml) wykonywano z szybkością 0,25 ml/min. Mikroinfuzje do ciała migdałowatego (0,2 ml) wykonywano z szybkością 0,1 ml/min. Kaniulę iniekcyjną pozostawiono na miejscu przez 2 minuty po mikroinfuzji, a następnie myszy ponownie umieszczono w ich klatkach domowych. Inhibitor MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku i rozcieńczono solą fizjologiczną. Myszy trenowano jak opisano powyżej, a 24 godziny później poszczególne myszy umieszczono z powrotem w przedziale światła (reaktywacja). Myszom wstrzykiwano ogólnoustrojowo SL327 (10 lub 20 mg/kg) lub VEH natychmiast po reaktywacji (ryc. 7D-F). W 48 h po reaktywacji poszczególne myszy ponownie umieszczono w przedziale światła i oceniono latencję krzyżową (PR-LTM).

Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (Mamiya i wsp., 2009; Suzuki i wsp., 2011; Zhang i wsp., 2011; Fukushima i wsp., 2014; Ishikawa i wsp., 2016; Hasegawa i wsp., 2019). Po znieczuleniu wszystkie myszy poddano perfuzji 4% paraformaldehydem. Mózgi usunięto, utrwalono przez noc, przeniesiono do 30% sacharozy i przechowywano w 4 stopniach. Skrawki koronalne (30 mm) pocięto w kriostacie.

Do barwienia pCREB i pERK, swobodnie pływające skrawki traktowano 1% H2O2 i inkubowano przez noc z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-fosfo-CREB (seryna 133; S133) (1:1000; #{{10 }}, Millipore) i/lub królicze monoklonalne przeciwciało anty-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) w roztworze blokującym (sól fizjologiczna buforowana fosforanami plus 1% albuminy surowicy koziej, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i 0,05% Triton X-100). Skrawki przemyto solanką buforowaną fosforanem i inkubowano z ośle anty-króliczym IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:500; Jackson ImmunoResearch) dla pCREB lub kozim anty-króliczym IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową dla pERK przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały pCREB wzmocniono przez biotynę tyramid i wizualizowano przy użyciu streptawidyny sprzężonej z Alexa Fluor (Invitrogen). Sygnały pERK wzmocniono za pomocą TSA-FCM (Invitrogen). Skrawki zamocowano na szkiełkach i przykryto szkiełkami nakrywkowymi za pomocą środka do zamykania (Millipore).

Oznaczenie ilościowe przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (Frankland i in., 2006; Fukushima i in., 2014; Mamiya i in., 2009; Zhang i in., 2011; Suzuki i in., 2008). Struktury zdefiniowano anatomicznie zgodnie z atlasem Franklina i Paxinos (1997). Wszystkie immunoreaktywne neurony zostały zliczone przez eksperymentatora nie znającego warunków leczenia

Wyniki

Charakterystyka faz pamięci po odzyskaniu w zadaniu IA

Zadanie IA pozwala nam odróżnić fazy rekonsolidacji i ekstynkcji w momencie wejścia myszy do ciemnego przedziału z przedziału jasnego (Fukushima et al., 2014). Aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw zamiany faz pamięci z rekonsolidacji na wygaśnięcie, scharakteryzowaliśmy fazy pamięci IA następujące po odzyskaniu pamięci, badając skutki hamowania syntezy białek, które są wymagane do ponownej konsolidacji i wygaśnięcia pamięci IA (Fukushima et al., 2014). Myszy najpierw umieszczono w przedziale światła. Po 5 sekundach od wejścia do ciemnego przedziału został dostarczony krótki wstrząs elektryczny (trening). Myszy ponownie wystawiono na działanie jasnego przedziału 24 godziny po treningu (sesja reaktywacyjna; Ryc. 1A) i oceniono ich krzyżową latencję wejścia do ciemnego przedziału (Ryc. 1B). Myszy wracały do ​​swoich klatek domowych natychmiast po wejściu do ciemnego przedziału z jasnego przedziału (0-min ponownej ekspozycji na ciemny przedział; faza rekonsolidacji) lub pozostawały w ciemnym przedziale przez 1, 3 lub 10 min bez wstrząsu stopy (faza wygaszania; Ryc. 1C–E). Natychmiast po sesji reaktywacyjnej myszy otrzymały ogólnoustrojową iniekcję VEH lub inhibitora syntezy białek ANI. 48 h później oceniono latencję krzyżową PR-LTM.

Zgodnie z naszym poprzednim badaniem (Fukushima i wsp., 2014), ponowna ekspozycja na przedział światła (grupa 0 min) wywołała ponowną konsolidację i wzmocnienie pamięci IA. Dwuczynnikowa ANOVA ujawniła znaczący wpływ czasu (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}036), lek (F(1 ,24)=230,197, p, 0,0001 i czas interakcji leku (F(1,24)=250,022, p, 0,0001; Ryc. 1B). Test post hoc Bonferroniego i sparowany test t wykazały, że grupy VEH i ANI wykazywały, odpowiednio, znacząco zwiększone lub zmniejszone opóźnienie krzyżowania przy PR-LTM w porównaniu z sesją reaktywacyjną (ps < 0,05;="" veh,="" t(6)="" {{28)="" }}="" 5,134,="" p="00,021," ani,="" t(6)="40,804," p="00,003;" rys.="" 1b).="" obserwacje="" te="" wskazują,="" że="" odzyskiwanie="" pamięci="" ia="" w="" jasnym="" przedziale="" wzmocniło="" pamięć,="" podczas="" gdy="" hamowanie="" syntezy="" białek="" zakłóciło="" odzyskaną="" pamięć,="" potwierdzając="" poprzednią="" obserwację,="" że="" odzyskiwanie="" pamięci="" ia="" wzmacnia="" pamięć="" poprzez="" rekonsolidację="" w="" sposób="" zależny="" od="" syntezy="">

W przeciwieństwie do tego, ponowna ekspozycja na ciemny przedział indukowała długotrwałe wygaszanie [dwukierunkowa ANOVA, czas (ryc. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}04; Ryc. 1D, F(1,36)=11,699, p=0.0016), lek (Rys. 1C, F(1,28)=4,674, p=00,039; Rys. 1D, F(1,36)=12,285, p {{29 }}.0012), czas interakcji leku (ryc. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; ryc. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], jak zaobserwowano wcześniej (Fukushima et al., 2014). Grupy VEH, które pozostawały w ciemnym przedziale przez 3 lub 10 minut, wykazały znacząco zmniejszoną latencję krzyżową przy PR-LTM w porównaniu z sesją reaktywacyjną, podczas gdy grupy ANI wykazywały porównywalne opóźnienie krzyżowe przy PR-LTM w porównaniu z sesją reaktywacyjną i Grupy VEH (test post hoc Bonferroniego, ps , 0,05; sparowany test t, ryc. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}0.796, p. 0,05; Rys. 1D, VEH, t(9)=10.211, p. 0,0001, ANI, t(9)=1.02, p. 0,05 ). Te obserwacje wskazują, że ponowna ekspozycja na ciemny przedział przez 3 lub 10 minut wygaszała pamięć IA, a hamowanie syntezy białek blokowało długotrwałe wygaszanie. Tak więc odzyskiwanie pamięci IA w ciemnym przedziale wygasza pamięć IA w sposób zależny od ekspresji genów.

Co ważne, grupa VEH wykazała porównywalne opóźnienie krzyżowe przy PR-LTM w porównaniu z sesją reaktywacyjną i grupą ANI, gdy przebywali w ciemnym przedziale przez 1 minutę [dwukierunkowa ANOVA, czas (F(1,36) {{ 5}}.03, s. 0.05), lek (F(1,36)=0.019, s . 0.05), czas interakcji leku (F(1,36)=00,011, p. 0,05); post hoc test Bonferroniego, ps. 0,05; sparowany test t, VEH, t(9)=00,091, s . 0,05, ANI, t(9)=0,328, s. . 0,05; Rys. 1E]. Obserwacje te wskazują, że grupa VEH nie wykazała ani wzmocnienia, ani wygaszenia pamięci IA, a grupa ANI nie wykazała zaburzeń pamięci IA. Dlatego ponowna ekspozycja na ciemny przedział przez 1 minutę zablokowała zarówno wzmocnienie, jak i wywołane przez ANI zakłócenie reaktywowanej pamięci IA, ale nie wygaszała pamięci IA, co sugeruje, że ta 1-min ponowna ekspozycja anuluje indukcję ponownej konsolidacji , ale nie wystarcza do wygaszenia pamięci IA.

Podsumowując, wyniki te wskazują, że ponowna ekspozycja na jasny kompartment indukuje fazę rekonsolidacji, podczas gdy dłuższa ponowna ekspozycja na ciemny kompartment (3 lub 10 min) indukuje fazę ekstynkcji. Co ważniejsze, przebywanie przez 1 minutę w ciemnym przedziale indukuje fazę przejściową od ponownej konsolidacji do wygaśnięcia, co hamuje rekonsolidację pamięci strachu bez wywoływania wygaszania.

Molekularne sygnatury faz rekonsolidacji, przejścia i wygaszania w ciele migdałowatym, hipokampie i mPFC po odzyskaniu pamięci IA

Ponowna konsolidacja i wygaśnięcie kontekstowej pamięci strachu wykazują wzrost fosforylacji CREB w S133, markerze aktywacji ekspresji genów wymaganej do ponownej konsolidacji i długotrwałego wygaszania, ale wykazują wyraźną dynamikę fosforylacji CREB (Mamiya et al., 2009 ). Co ciekawe, ostatnie badania wykazały, że nie ma wzrostu fosforylacji ERK, regulatora CREB w górę strumienia (Impey i wsp., 1998; Wu i wsp., 2001) w obszarze podstawno-bocznym ciała migdałowatego na przejściu z rekonsolidacji do wygaśnięcia wskazywanej pamięci strachu, chociaż ta fosforylacja jest zwiększona w obszarze podstawno-bocznym, gdy wskazywana pamięć strachu jest ponownie konsolidowana i wygaszana (Merlo et al., 2014, 2018). Inne badanie wykazało, że hipokampowa ERK jest aktywowana tylko wtedy, gdy kontekstowa pamięć strachu jest wygaszana, ale nie jest ponownie konsolidowana (Tronson et al., 2009). Odkrycia te sugerują, że fazy rekonsolidacji, przejścia i wymierania wykazują odrębne sygnatury molekularne i komórkowe. Dlatego zmierzyliśmy i porównaliśmy poziomy pCREB i pERK w fazach rekonsolidacji, przejścia i ekstynkcji za pomocą immunohistochemii. Przeprowadziliśmy podobne harmonogramy eksperymentalne, jak na Ryc. 1B, D, E, używając czterech grup eksperymentalnych. Myszy ponownie eksponowano na jasny przedział 24 godziny po treningu, a następnie przebywały w ciemnym przedziale [reaktywacja: 0 min w ciemnym przedziale, grupa rekonsolidacja (Recon); 1 min, grupa przejściowa (Tran); 10 min, grupa ekstynkcji (Ext)]. Inna grupa myszy nie została przywrócona do przedziału jasnego/ciemnego (niereaktywowana, grupa NR). Policzyliśmy neurony pCREB-dodatnie (pCREB1), neurony pERK-dodatnie (pERK1) i neurony podwójnie dodatnie (pCREB1/pERK1) w ciele migdałowatym, hipokampie i mPFC po 30 minutach od sesji reaktywacyjnej.

Ciało migdałowate (obszar boczny) CREB był aktywowany w fazie wygaszania i rekonsolidacji, podczas gdy ERK był aktywowany tylko w fazie wygaszania (ryc. 2A-C). Jednoczynnikowa ANOVA wykazała istotny wpływ grupy (ryc. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Podobnie jak w przypadku wcześniejszych ustaleń (Mamiya i in., 2009), test post hoc Newmana–Keulsa wykazał, że grupy Recon i Ext wykazały znacznie więcej neuronów pCREB1 niż inne grupy (p, 0,05). Obserwacje te wskazywały, że podobnie jak obserwacje na poziomach behawioralnych (ryc. 1), ekspozycja na ciemny przedział przez 1 minutę (faza przejściowa) anuluje „włączenie” fosforylacji CREB, która byłaby zwiększona w fazie rekonsolidacji. Natomiast w grupie Ext zaobserwowano znacznie więcej neuronów pERK1 niż w innych grupach, chociaż w grupie Ext było znacznie mniej neuronów pERK1 niż neuronów pCREB1 (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; Ryc. 2C).

Konsekwentnie, znacznie więcej podwójnie pozytywnych neuronów (pCREB1/pERK1) zaobserwowano w grupie Ext (F(3,29)=6,698, p=0.00 14; Ryc. 2D), podczas gdy znacznie więcej neuronów pCREB1/pERK– (pCREB pojedynczy pozytywny) zaobserwowano w grupach Recon i Ext (F(3,29)=13.689, p , 0 0001; rys. 2E). Tak więc faza rekonsolidacji wykazała tylko pojedynczą populację neuronów pCREB1/pERK–. Natomiast faza wygaszania wykazała dwie populacje neuronów pCREB1/pERK– i pCREB1/pERK1, co wskazuje, że ERK jest aktywowany tylko w podzbiorze neuronów pCREB1. Co ważne, podobne wyniki zaobserwowano w obszarze podstawno-bocznym ciała migdałowatego (ryc. 2G, F(3,29)=130,042, p , 0,0001; ryc. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Rys. 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; Rys. 2J, F(3,29)=12 0,505, s, 0,0001).

Dwufazowa aktywacja ERK w fazie wygaszania ERK jest wstępnym aktywatorem CREB i tym samym aktywacja ERK jest wymagana do konsolidacji i rekonsolidacji pamięci strachu (Schafe i in., 200{{31 }}; Duvarci i in., 2005). Jednakże, niekonsekwentnie, nie zaobserwowano aktywacji ERK w ciele migdałowatym, hipokampie lub mPFC w fazie rekonsolidacji, gdy pERK mierzono 30 min po sesji reaktywacyjnej (ryc. 2-4). Dlatego zbadaliśmy przebiegi czasowe fosforylacji ERK i CREB. Przeprowadziliśmy podobny eksperyment jak na rycinach 2-4, z wyjątkiem tego, że poziomy pCREB i pERK zmierzono po 5, 15 i 30 min po sesji reaktywacyjnej (ponowna ekspozycja na ciemny przedział dla {{ 66}}, 1 lub 10 min; Fig. 5A). Zgodnie z danymi przedstawionymi na rycinach 2-4, znaczny wzrost liczby neuronów pCREB1 zaobserwowano po 30 min, ale nie po 5 min, po sesji reaktywacyjnej w Recon (ciało migdałowate, mPFC i hipokamp) i Ext (ciało migdałowate i mPFC). ), ale nie grupy Tran (ryc. 5E, jednoczynnikowa ANOVA, ciało migdałowate, 5 min, F(3,23)=0.346, s. 0,05, 30 min, F(3,23)=15,272, p, 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1,169, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001; hipokamp, ​​5 min, F(3,23)=0,154, p, 0,05, 30 min, F(3,23)=16,197, p, 0,0001; niesparowany test t, ciało migdałowate, rekonsolidacja, 5 vs 30 min, t(12)=7 0,807, p , 0,0001, ekstynkcja, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, rekonsolidacja, 5 vs 30 min, t(12)=5,727, p , 0,0001, ekstynkcja, 5 vs 30 min, t(12)=4,188 , p=0.0013; region hipokampa CA1, rekonsolidacja, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Co ciekawe, znaczny wzrost liczby neuronów pERK1 zaobserwowano w ciele migdałowatym, mPFC i hipokampie grup Recon, Tran i Ext po 5 minutach od sesji reaktywacyjnej w porównaniu z grupą NR (ryc. 5F, ciało migdałowate, F(3,23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}0,011; hipokamp, ​​F(3,23)=60,924, p=00,017). Obserwacje te wskazywały, że ERK jest aktywowany natychmiast po sesji reaktywacji we wszystkich fazach pamięci. Jednak te wzrosty liczby neuronów pERK1 powróciły do ​​poziomów podstawowych (porównywalnych z grupą NR) w 15 min po sesji reaktywacyjnej (ryc. 5F, ciało migdałowate, F(3,20)=2.676, p 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, p. 0,05; hipokamp, ​​F(3,20)=0,74, p. 0,05). Ponadto, zgodnie z ustaleniami przedstawionymi na Figurach 2-4, znacznie więcej neuronów pERK1 zaobserwowano w ciele migdałowatym, mPFC i hipokampie po 30 minutach od sesji reaktywacyjnej tylko w grupie Ext (ryc. 5F, ciało migdałowate, F( 3,23)=6,616, p=00,022; mPFC, F(3,23)=80,012, p=00,0008; hipokamp, ​​F( 3,23)=6,206, p=0,003). Tak więc, fazy rekonsolidacji i przejścia pokazują przejściową aktywację ERK tylko we wczesnym punkcie czasowym (5 min), podczas gdy faza ekstynkcji pokazuje dwufazową aktywację ERK we wczesnym (5 min) i późnym (30 min) punktach czasowych po reaktywacji sesja. Obserwacje te wskazywały, że mechanizmy regulacji aktywacji ERK różnią się w fazach rekonsolidacji/przejścia i wygaszania. Łącznie nasze obserwacje wykazały, że fazy rekonsolidacji, przejścia i ekstynkcji wykazują wyraźne sygnatury molekularne.

Role aktywacji ERK w fazach rekonsolidacji i wygaszania pamięci IA

Fazy ​​rekonsolidacji/przejścia i ekstynkcji wykazały odpowiednio jednofazową i dwufazową aktywację ERK. Następnie zbadaliśmy i porównaliśmy role wczesnej (5 min) i późnej (30 min) aktywacji ERK w mPFC w fazach rekonsolidacji i ekstynkcji, badając efekty hamowania ERK (ryc. 6).

Dyskusja

W tym badaniu zbadaliśmy mechanizmy przejścia pamięci z fazy rekonsolidacji do fazy wygaszania po odzyskaniu pamięci IA. Najpierw scharakteryzowaliśmy behawioralne sygnatury faz pamięci IA po odzyskaniu. Zgodnie z naszym poprzednim badaniem (Fukushima i wsp., 2014), rekonsolidacja i wygaśnięcie wywołane przez IA przywrócenie pamięci przez ponowną ekspozycję na światło (0 min w ciemnym przedziale) i ciemność ( 3 lub 10 min) przedziałów, odpowiednio. Co ciekawe, pamięć IA nie była ani wzmocniona, ani wygaszona i wykazywała odporność na hamowanie syntezy białek, gdy myszy ponownie wystawiono na ciemny przedział tylko przez 1 minutę. Dlatego obserwacje te sugerują, że 1-min ponowna ekspozycja na ciemny przedział anuluje indukcję ponownej konsolidacji, ale jest niewystarczająca do wygaszenia pamięci IA. Ponadto stwierdziliśmy, że ERK była aktywowana w ciele migdałowatym, hipokampie i mPFC we wczesnym punkcie czasowym (5 min) po ponownej ekspozycji na ciemny przedział przez 0, 1 lub 10 min. Konsekwentnie, hamowanie ERK w tych obszarach mózgu blokowało rekonsolidację/wzmocnienie i wygaśnięcie pamięci IA. Co najważniejsze, hamowanie ERK w ciele migdałowatym, hipokampie i mPFC po 1-min ponownej ekspozycji na ciemny przedział odhamowało zależne od konsolidacji wzmocnienie pamięci IA, co sugeruje, że aktywacja ERK po krótkiej (1 min) ponownej ekspozycji do ciemnego przedziału jest wymagane w celu zahamowania rekonsolidacji pamięci IA. Odwrotnie, 1-min ponowna ekspozycja w ciemnym przedziale była niewystarczająca do wygaszenia pamięci IA, chociaż przedłużona ponowna ekspozycja w ciemnym przedziale (3 lub 10 minut) wygasiła tę pamięć. Dlatego nasze wyniki sugerują, że 1-min ponowna ekspozycja na ciemny przedział indukuje proces przejścia pamięci, który anuluje rekonsolidację/wzmocnienie, ale nie inicjuje uczenia się wygaszania. Łącznie sugerujemy, że proces przejścia pamięci przyczynia się do przełączania faz pamięci z rekonsolidacji na wygaśnięcie poprzez zapobieganie rekonsolidacji za pośrednictwem ERK.

Podobnie jak w naszych obecnych obserwacjach, ostatnie badanie wykorzystujące słuchowe warunkowanie strachu wykazało, że pojedyncze (1) lub przedłużone (10) prezentacje CS wywołują odpowiednio ponowną konsolidację pamięci i wygaszenie poprzez wzrost poziomów pERK w obszarze podstawno-bocznym ciała migdałowatego. Natomiast pośrednie (4–7) prezentacje CS nie zmieniają poziomów pERK w okolicy podstawno-bocznej ciała migdałowatego. Co ważne, hamowanie ERK przy pośrednich prezentacjach CS nie wpływało na pamięć strachu. Badanie to sugerowało, że po odzyskaniu pamięci strachu następuje przejście fazy pamięci z rekonsolidacji do wygaśnięcia (Merlo et al., 2018). W niniejszym badaniu rozszerzyliśmy to odkrycie i zasugerowaliśmy, że faza przejściowa aktywnie przełącza fazy pamięci z rekonsolidacji do wygaśnięcia poprzez aktywację szlaku transdukcji sygnału ERK. W przeciwieństwie do poprzednich ustaleń (Merlo i wsp., 2018), odkryliśmy, że faza przejściowa obejmuje fosforylację ERK w ciele migdałowatym, hipokampie i mPFC. Te rozbieżności mogą wynikać z różnicy punktów czasowych badających fosforylację ERK; poprzednie badanie mierzyło poziomy pERK po 12 minutach po prezentacji CS (Merlo i wsp., 2018), podczas gdy nasze badanie wykazało, że podwyższone poziomy pERK powróciły do ​​poziomu podstawowego mniej więcej w tym punkcie czasowym (15 minut po ponownej ekspozycji). Dodatkowo należy zauważyć, że zadanie IA umożliwia obserwację wzmocnienia pamięci IA poprzez rekonsolidację, prowadząc w ten sposób do naszego odkrycia, że ​​hamowanie ERK w fazie przejściowej odhamowuje wzmocnienie pamięci IA.

Wcześniejsze badania wykazały, że fosforylacja ERK jest zwiększona w obszarze podstawno-bocznym ciała migdałowatego po 20–60 minutach po nauce wygaszania przywoływanej pamięci strachu (Herry i in., 2006; Merlo i in., 2014, 2018), podczas gdy hipokamp pokazuje ta aktywacja w ciągu 1 godziny po uczeniu się wygaszania kontekstowej pamięci strachu (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). W niniejszym badaniu uzyskaliśmy podobne obserwacje, że pERK wzrasta po 30 minutach od sesji reaktywacyjnej w fazie wygaszania. Odkrycia te sugerują, że fosforylacja ERK jest powszechną sygnaturą molekularną późnej fazy ekstynkcji (20-60 min).

Ponadto zaobserwowaliśmy, że aktywacja ERK następuje dwufazowo we wczesnych i późnych punktach czasowych (5 i 30 min) po sesji reaktywacji w fazie wygaszania, podczas gdy aktywacja ta zachodzi jednofazowo we wczesnym punkcie czasowym w fazie rekonsolidacji (ryc. 5). . Konsekwentnie, hamowanie ERK w obszarach mózgu w tych punktach czasowych faz rekonsolidacji i wygaszania blokowało odpowiednio rekonsolidację/wzmocnienie i długotrwałe wygaszanie (ryc. 6A, C-H). Obserwacje te sugerują, że jednofazowa i dwufazowa aktywacja ERK jest wymagana odpowiednio dla wzmocnienia i wygaszenia pamięci IA za pośrednictwem rekonsolidacji. Należy zauważyć, że ERK działa jako regulator w górę fosforylacji CREB. Dlatego przejściowa aktywacja ERK we wczesnej fazie pamięci może, przynajmniej częściowo, przyczynić się do tej fosforylacji CREB, która aktywuje ekspresję genów wymaganych do rekonsolidacji i długotrwałego wyginięcia.

Podobnie do naszych wcześniejszych odkryć wykorzystujących kontekstowe warunkowanie strachu (Mamiya i in., 2009), CREB był aktywowany w fazach pamięci rekonsolidacji (ciało migdałowate/hipokamp/mPFC) i wygaszania (ciało migdałowate/mPFC), podczas gdy ERK był aktywowany tylko w fazie wygaszania 30 min po sesji reaktywacyjnej. Konsekwentnie, w fazie rekonsolidacji zaobserwowano tylko jedną populację neuronów pCREB1/pERK–, natomiast w fazie wygaszania odrębne populacje neuronów: pCREB1/pERK– i pCREB1/pERK1 w ciele migdałowatym (ryc. 2); neurony pCREB– /pERK1 w hipokampie (ryc. 3); oraz pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 i pCREB1/pERK1 w mPFC (ryc. 4). Te obserwacje, zwłaszcza kontrastująca obserwacja neuronów pCREB–/pERK1 i pCREB1/pERK–, sugerują, że aktywacja CREB i ERK jest regulowana inaczej w każdym obszarze mózgu, gdy pamięć jest wygaszana, a aktywacja ERK w późnej fazie odgrywa specyficzną i wyraźną role wygaszania pamięci strachu w porównaniu z innymi procesami pamięciowymi, takimi jak konsolidacja i rekonsolidacja, jak omówiono poniżej. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że neurony pERK1 były bardziej obfite w mPFC w porównaniu z hipokampem i ciałem migdałowatym, ponieważ mPFC wykazywał wyższy stosunek neuronów pERK1 (faza ekstynkcji) i neuronów pCREB1 (faza rekonsolidacji) w porównaniu z hipokampem i ciałem migdałowatym, co sugeruje, że aktywacja ERK w mPFC odgrywa bardziej specyficzną rolę w wygasaniu pamięci.

Pozostaje niejasne, czy ta sama, czy różne populacje neuronów są aktywowane w fazach pamięci rekonsolidacji, przejścia i wygaszania. Wcześniejsze badania zidentyfikowały aktywację „neuronów strachu” i „neuronów wygaszania” w ciele migdałowatym, gdy przywołana pamięć strachu jest odpowiednio reaktywowana lub wygaszona (Herry i in., 2008). Dlatego możliwe jest, że ERK i CREB są aktywowane w różnych populacjach neuronów o różnych profilach czasowych (tj. „neuronach rekonsolidacji” i neuronach ekstynkcji). Jak omówiono powyżej, neurony pCREB1, w tym neurony pCREB1/pERK1, mogą regulować rekonsolidację i długotrwałe wygaszanie pamięci IA poprzez aktywację ekspresji genów odpowiednio jako neuronów rekonsolidacji i wygaszania. Odwrotnie, aktywacja ERK w neuronach pCREB-/pERK1 może przyczyniać się do anulowania aktywacji transkrypcyjnej, w której pośredniczy CREB, która byłaby wymagana do rekonsolidacji, ponieważ ta aktywacja ERK jest specyficznie obserwowana w późnej fazie wygaszania; ERK aktywował się w neuronach rekonsolidacji, aby anulować aktywację ekspresji genów w fazie wygaszania. Co ciekawe, poprzednie badanie wykazało, że aktywacja hipokampa ERK blokuje indukcję c-fos, gdy wygaszona jest kontekstowa pamięć strachu (Guedea i in., 2011), co podnosi prawdopodobieństwo, że ta aktywacja ERK antagonizuje szlak sygnalizacji CREB. Ważne jest, aby zidentyfikować populacje neuronów, które regulują rekonsolidację, przejście i wygaszanie oraz zbadać sygnatury molekularne i funkcjonalne znaczenie tych neuronów. Ponadto interakcje między populacjami neuronów zidentyfikowanymi w tym badaniu pozostają nieznane. Możliwe, że „neurony ekstynkcji (przejścia)” modulują funkcję neuronów rekonsolidacji, aby anulować zapobieganie ponownej konsolidacji poprzez interakcje między nimi (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Dlatego ważne jest również zbadanie tych interakcji w ciele migdałowatym, mPFC i hipokampie i między nimi.

Wcześniej wykazaliśmy, że hipokamp nie wykazuje zmian w fosforylacji CREB i ekspresji Arc po uczeniu się wygaszania strachu kontekstowego i konsekwentnie hamowanie syntezy białek w hipokampie w fazie wygaszania nie blokuje wygaszania długoterminowego (Mamiya et al. , 2009). Obserwacje te podniosły możliwość, że hipokamp nie jest wymagany do długotrwałego wyginięcia. Wykazaliśmy jednak, że ERK jest aktywowana w hipokampie po nauce wygaszania pamięci IA i konsekwentnie blokowanie aktywacji ERK w hipokampie zaburza długotrwałe wygaszanie. Dlatego nasze obecne obserwacje wskazują na istotną rolę hipokampu w wygasaniu pamięci. W połączeniu z naszymi wcześniejszymi odkryciami, sugerujemy, że hipokamp jest wymagany do wygaszania pamięci, ale nie do procesu podobnego do konsolidacji w celu stabilizacji „pamięci wygaszania” poprzez aktywację ekspresji genów.