Ostra ekspozycja skóry na światło ultrafioletowe wyzwala zapalenie nerek zależne od neutrofili

My i inni wykazaliśmy, że światło UV powoduje szybką infiltrację neutrofili do skóry (6, 7). Chociaż granulocyty obojętnochłonne są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do powstawania stanów zapalnych w miejscowych miejscach urazu, niedawno odkryto, że neutrofile mogą również zamieszkiwać narządy odległe od pierwotnego miejsca zapalenia (8–10), gdzie przyczyniają się do uszkodzenia tkanki płucnej poprzez wytwarzanie reaktywnego tlenu gatunek (ROS) (11) lub aktywują adaptacyjny układ odpornościowy w węzłach chłonnych i szpiku kostnym (9, 12). Uważa się, że w SLE neutrofile odgrywają ważną rolę zarówno w chorobach miejscowych, jak i ogólnoustrojowych. Neutrofile są obecne w zmianach skórnych pacjentów z SLE (13, 14) oraz wnerkatkanki pacjentów z LN (15, 16). Wysoka ekspresja sygnatury genu neutrofili jest silnym predyktorem aktywnej choroby, w tym LN i skórnych zaostrzeń (17, 18). Prozapalne granulocyty o niskiej gęstości (LDGs) są zwiększone szczególnie u pacjentów z chorobami skóry (19). Podczas gdy te odkrycia implikują neutrofile w miejscowym uszkodzeniu tkanki w SLE, to czy neutrofile zapewniają patogenny związek między zapaleniem skóry auszkodzenie nereknie jest zrozumiałe.

Aby wyjaśnić, w jaki sposób ekspozycja skóry na światło UV wpływa nanerkai rolę, jaką odgrywają neutrofile w tych procesach, oceniliśmy zmiany wnerkowyekspresja genów w połączeniu z migracją neutrofili. Odkryliśmy, że ostra ekspozycja skóry na światło UV stymuluje procesy zapalne wnerka,w tym ekspresja śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych, mediatorów stanu zapalnego, markerów urazu i przejściowego białkomoczu. W szczególności odkryliśmy, że neutrofile migrowały donerkapo ekspozycji na promieniowanie UV w sposób zależny od IL-17A, lokalizując się w obszarach cewkowo-śródmiąższowych (TI), gdzie wykazywały fenotypy prozapalne. Zniesiono blokowanie handlu neutrofilami przez leczenie immunoglobuliną anty-G-CSF (IgG)nerkowystan zapalny i zapobiegły podwyższeniu poziomu markerów uszkodzenia kanalików. Łącznie odkrycia te pokazują, że ekspozycja skóry na światło UV wyzwala subklinicznenerkowyprocesy zapalne i urazowe, w których pośredniczą neutrofile.

Wyniki

Ekspozycja skóry na światło UV powoduje subkliniczny uraz nerek.Ekspozycja na światło słoneczne wiąże się z nasileniem objawów ogólnoustrojowych i występowaniem zaostrzeń choroby u pacjentów z SLE, w tym zapaleniem nerek (2-4). Dlatego najpierw zapytaliśmy, czy ostre jałowe zapalenie skóry wywołane pojedynczą ekspozycją na światło ultrafioletowe B (UVB) (500 mJ/cm2 ) u czarnych myszy 6 (B6) prowadzi do zmian wnerka, w tym zapalenie, uraz i białkomocz (ryc. 1A). Jako narząd kontrolny wybrano płuco, ponieważ w SLE nie doniesiono o związku między nadwrażliwością na światło a kliniczną chorobą płuc. Łącznie 500 mJ/cm2 światła UVB u myszy B6 zostało zdefiniowane jako dwie minimalne dawki rumieniowe (20), dawka referencyjna stosowana do protestów ludzi (21). Analizy ekspresji genów perfundowanychnerka tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-zwińnerkowyindukcja w s100A9, mediator neutrofilowy związany zuszkodzenie nerek(22), a także zwiększona ekspresja s100A6, białka wiążącego wapń związanego z uszkodzeniem kanalików (23) (ryc. 1 D i E). Podczas gdy indukcję s100A9 wykryto w płucu, ekspresja genu s100A6 pozostała niezmieniona w płucu (dodatek SI, ryc. S1). Odpowiedź zapalna wnerkabyło również związane z wczesnym wzrostem ekspresji il-1 (dni 1 i 2 po UV), podczas gdy zmiany w tnf lub il-6 były minimalne lub nie było ich wcale (ryc. 1F). Ekspresję Il-1 nie wykryto w płucach do 6 dni po ekspozycji skóry na światło UVB (dodatku SI, ryc. S1). Szybka indukcja ekspresji cxcl12, chemokiny wydzielanej przez kłębuszki i kanaliki i zaangażowanej wuszkodzenie nerek(24) znaleziono również wnerkaale nie płuca (Ryc. 1G i SI Dodatek, Ryc. S1). W związku z tym uszkodzenie skóry wywołane przez światło UVB powoduje szybkie rozpoczęcienerkowyprocesy prozapalne, podczas gdy w płucach obserwuje się mniej zmian.

Oprócz odpowiedzi prozapalnej obserwowanej wnerka,zarówno białkomocz, jak i stosunek albumina/kreatynina w moczu wzrosły w ciągu pierwszych kilku dni po ekspozycji skóry na promieniowanie UVB (ryc. 1 H i I). Ten szybki efekt nafunkcja nerkitowarzyszyło zwiększenie ekspresji lipokaliny-2 iuszkodzenie nerekcząsteczka 1 (kim-1) (ryc. 1 J i K), markery rurkowateuszkodzenie nerekktóre są również obserwowane w LN (25, 26). Pomimo przejściowego charakteru białkomoczu, ich ekspresjauszkodzenie nerekmarkery utrzymywały się do 6 dnia (ryc. 1 J i K), prawdopodobnie odzwierciedlając naprawę tkanek.

Zapalenie skóry wywołane światłem UV powoduje migrację neutrofili do nerek.Aby zbadać, czy granulocyty obojętnochłonne uczestniczą w ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej na światło UVB, zbadaliśmy kinetykę akumulacji granulocytów obojętnochłonnych w skórze napromieniowanej promieniowaniem UV oraz w śledzionie.nerka,i płuca myszy C57BL/6 J (B6), szczep, który najlepiej naśladuje zmiany skórne na światło UVB w ludzkiej skórze (Fig. 2A) (27). Po ostrej ekspozycji skóry na światło UVB liczba neutrofili w skórze wzrosła siedmiokrotnie w ciągu 24 godzin i pozostała podwyższona przez 6 dni w porównaniu z wyjściowymi poziomami przed promieniowaniem UV (D-1) ​​(ryc. 2B). Towarzyszyło temu zmniejszenie liczby granulocytów obojętnochłonnych w szpiku kostnym i pięciokrotny wzrost liczby granulocytów obojętnochłonnych we krwi w dniach od 1 do 6 (ryc. 2 C i D). Co ciekawe, w tym samym czasie wzrosła liczba neutrofili w śledzionie, płucach inerka(Rys. 2 E–G i SI Dodatek, Rys. S2A). Dokładna kinetyka różniła się w zależności od narządu, osiągając szczyt w 1. dniu w płucach i 2. do 6. dniu w płucachnerkai śledziony (ryc. 2 E–G). wnerki, granulocyty obojętnochłonne są zlokalizowane głównie w obszarze cewkowo-śródmiąższowym, w tym w układzie naczyniowym, na co wskazuje barwienie elastazą neutrofilową (NE) w pobliżu cząsteczki adhezyjnej płytek krwi/komórek śródbłonka lub kolokalizacja z nimi-1 (PECAM-1/CD31 ) (rys. 2H). Reprezentatywne obrazy na ryc. 2H pokazują neutrofile w lub wokół śródmiąższowego układu naczyniowego (pełne białe strzałki) oraz w śródmiąższu (białe strzałki przerywane), ze sporadycznymi neutrofilami, również znajdowanymi w kłębuszkach (żółte strzałki). Podobną lokalizację wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF) anty-Ly6G (SI Dodatek, Fig. S2B).

Aby ustalić, czy inne wrodzone komórki odpornościowe wykazywały lokalne i ogólnoustrojowe odpowiedzi podobne do neutrofili, zbadaliśmy dystrybucję monocytów (CD11b plus Ly6C plus Ly6G−) w tych samych punktach czasowych po ekspozycji na światło UVB. Chociaż monocyty były również rekrutowane do skóry, tylko niewielka liczba naciekających monocytów została wykryta wnerkaw dniu 6 po ekspozycji na promieniowanie UVB (∼2-krotny w porównaniu z ∼10.5-krotnym wzrostemnerkaneutrofile) (ryc. 2F i SI dodatek ryc., S3). Nie wykryto wzrostu liczby monocytów w płucach lub śledzionie (dodatku SI, ryc. S3), co sugeruje, że ogólnoustrojowa odpowiedź na uszkodzenie UV była stosunkowo selektywna dla neutrofili.

Infiltracji neutrofili do skóry towarzyszyły zmiany histologiczne, w tym wczesne zapalenie skóry właściwej i śmierć komórek naskórka (dzień 1. i 2.), a następnie rozwój akantozy i hiperkeratozy z wytworzeniem się strupów surowiczokomórkowych w niektórych przypadkach (dzień 6) (SI Załącznik, Rys. S4). Warto zauważyć, że po ekspozycji na światło UVB nie pojawiły się żadne otwarte zmiany skórne, co sugeruje, że obserwowany naciek komórek odpornościowych wystąpił w sterylnych warunkach, chociaż nie można wykluczyć udziału zmienionego mikrobiomu skóry (20).

Razem odkrycia te pokazują, że ekspozycja skóry na pojedynczą dawkę światła UVB mobilizuje neutrofile zarówno do miejscowego miejsca zapalenia, jak i narządów wewnętrznych, w tymnerka,towarzyszy neutrofilia krwi. Podczas gdy ogólne wzorce migracji były podobne u samców i samic myszy, infiltracja neutrofili do skóry była szybsza u samic w porównaniu z samcami (ryc. 2B). W przeciwieństwie do tego, uszkodzenie naskórka przez zdzieranie taśmy nie doprowadziło do migracji neutrofili donerkapomimo podobnych poziomów naciekania neutrofili i odpowiedzi zapalnej oraz uszkodzenia tkanek, jak obserwowane przy ekspozycji na światło UV (SI Dodatek, Ryc. S5), co wskazuje, że ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się neutrofili nie jest wspólne dla wszystkich form jałowego uszkodzenia skóry.

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

IL-17A promuje rekrutację neutrofili po ekspozycji skóry na światło UV.Badanie mediatorów chemotaktycznych i zapalnych w skórze ujawniło znaczną regulację w górę ekspresji genów chemokin neutrofili i cytokin zapalnych cxcl1, cxcl5/6, g-csf i il-1 1 do 2 dni po ekspozycji na promieniowanie UV (Ryc. 3 A–D). Szybki i trwały wzrost ekspresji s100A9 odpowiadał kinetyce przenikania neutrofili do skóry (ryc. 2B i dodatek SI, ryc. S6), podczas gdy cytokiny il-6, tnf i il-33 były przejściowo zwiększone i powróciły do ​​ekspresji wyjściowej do dnia 6 (dodatku SI, ryc. S6). W przeciwieństwie do tego, il-36a był podwyższony dopiero w 6 dniu (dodatku SI, ryc. S6), być może odzwierciedlając funkcję naprawczą. Przejściowa (1 do 2 d) obecność monocytów w skórze (załącznik SI, ryc. S3) odpowiadała równolegle do regulacji w górę specyficznych dla monocytów chemokin ccl4 i ccl2 (załącznik SI, ryc. S6). Podobnie do akumulacji neutrofili w skórze samic myszy (ryc. 2B), akumulacja monocytów w skórze również występowała wcześniej u samic niż u samców (dodatku SI, ryc. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1, 000--krotność skórnej indukcji ekspresji g-csf w dniach 1 i 2 po UV (Fig. 3C). Aby określić, czy indukcja tych cytokin była istotna dla mobilizacji neutrofili, najpierw oznaczyliśmy ilościowo stężenia białek cytokin we krwi, które ujawniły silny i trwały (10- do 100-krotny) wzrost stężenia w osoczu IL-176 do 24 godzin po ekspozycji na światło UV (ryc. 3F), wraz z przejściowym (szczyt po 6 godzinach) wzrostem IL-6 i IL-12, cytokin, które może znajdować się za IL-17A (28) (Fig. 3 G i H). Nie zaobserwowano wzrostu stężeń IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 ani IL1 w osoczu. Aby określić, czy IL-17A jest niezbędna do wywołanej przez UVB rekrutacji neutrofili, zablokowaliśmy działanie IL-17A neutralizującym przeciwciałem przed ekspozycją na UV (Fig. 3I). Przeciw-IL-17IgG znacząco tłumił neutrofilię we krwi (ryc. 3J) i osłabiał napływ neutrofili zarówno do odsłoniętej tkanki skóry (ryc. 3K i SI dodatek, ryc. S7A), jak inerka(Rys. 3L i SI Dodatek, Rys. S7B). Te odkrycia pokazują, że rekrutacja neutrofili w odpowiedzi na światło UV jest pośredniczona, przynajmniej częściowo, przez IL-17A.

Neutrofile pośredniczą w zapaleniu nerek po ekspozycji skóry na promieniowanie UVŚwiatło.Aby ustalić, czy neutrofile były odpowiedzialne za zmiany zapalne wnerka following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-razy po ekspozycji na promieniowanie UV, co sugeruje chemotaktyczną rolę G-CSF w rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na światło UV, zahamowaliśmy mobilizację neutrofili ze szpiku kostnego przez blokowanie G-CSF, jak przedstawiono na ryc. 4A. Neutralizacja G-CSF zapobiegała neutrofilii krwi, a także rekrutacji neutrofili donerkapo ekspozycji skóry na promieniowanie UVB (ryc. 4 B i C). Warto zauważyć, jak wcześniej zgłoszono w różnych modelach (29, 30), blokowanie G-CSF nie zmieniało liczby monocytów wnerka(Rys. 4D). Zmniejszona migracja neutrofili donerkatowarzyszyło znaczne zmniejszenienerkowyekspresja cząsteczek adhezyjnych vcam-1 i e-selektyny (ryc. 4 E i F) oraz mediatorów stanu zapalnego s100A9 i il-1 1 d po ekspozycji na promieniowanie UVB (ryc. 4 G i H). Ponadto markery uszkodzenia tkanki lipokalina-2 i kim-1 wnerkauległy znacznemu zmniejszeniu u myszy eksponowanych na światło UV leczonych przeciwciałem blokującym G-CSF w stosunku do zwierząt poddanych działaniu izotypu poddanych działaniu promieniowania UV (Fig. 4 I i J). Jak pisaliśmy wcześniej (6), ostra ekspozycja skóry na światło UVB wywołała reakcję interferonu typu I wnerka(rys. 4K). Blokowanie G-CSF znacząco zmniejszyło, ale nie zniosło całkowicie wyniku IFN (ryc. 4K). Podczas gdy obecność neutrofili wnerkabyło wymagane dla ostrych reakcji zapalnych i urazowych obserwowanych 1 dzień po ekspozycji skóry na promieniowanie UV (ryc. 4), w tym momencie nie zaobserwowano różnic w białkomoczu, ponieważ szczytowa białkomocz wystąpiła około 4 dnia po ekspozycji na promieniowanie UV (ryc. 1 H i I). Łącznie dane te wskazują, że neutrofile są odpowiedzialne za odpowiedź zapalną i, bezpośrednio lub pośrednio, przyczyniają się do indukcji interferonu typu I wnerkapo ekspozycji skóry na promieniowanie UV. Podobnie do wyników uzyskanych dla IgG anty-G-CSF, podanie neutralizującego przeciwciała anty-IL-17 częściowo hamowało migrację neutrofili donerkai spowodowało zmniejszoną ekspresję genównerkazapalne (vcam-1 i s100A9) oraz markery urazowe (lipocalin-2 i kim-1), chociaż jedynie zmniejszenie ekspresji kim-1 było statystycznie istotne (dodatku SI, ryc. S7 C–F)

Subpopulacja neutrofili nerkowych ulega odwrotnej transmigracji, fenotyp wykryty również we krwi pacjentów z SLE.Chociaż od dawna zakładano, że neutrofile dostające się do miejsc infekcji lub sterylnego zapalenia ulegają następnie apoptozie i są szybko usuwane przez makrofagi, wiele badań wykazało, że niektóre neutrofile przemieszczają się w sposób dwukierunkowy, to znaczy po dostaniu się do tkanki migrują z powrotem do krwioobiegu i infiltracji innej lokalizacji, proces ten określany jest jako odwrócona transmigracja (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). Aby zbadać, czy neutrofile, które skupiają się nanerkapo ekspozycji skóry na światło UVB przechodzące przez odsłoniętą skórę, zbadaliśmy migrację neutrofili w fotoaktywowanym mysim modelu B6 (ludzkie ubikwityna C [UBC]-fotoaktywowane [PA]-zielone białko fluorescencyjne [GFP]).

Schemat eksperymentalny zilustrowano na rys. 5A; 1 dzień po ekspozycji skóry na pojedynczą dawkę światła UVB, skóra została wystawiona na światło fioletowe (405 nm), tak że naciekające komórki odpornościowe uległy fotokonwersji do komórek GFP-dodatnich. Fotokonwertowane neutrofile (GFP plus Ly6G plus ) były następnie oznaczane ilościowo w perfundowanejnerkiNastępnego dnia. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że ​​około 20% neutrofili naciekających nerki było GFP dodatnich po odjęciu sygnału tła (około 10%) (ryc. 5B). W przeciwieństwie do modeli jałowego zapalenia w wątrobie lub mięśniu cremaster (8, 10), nie wykryliśmy fotokonwersji neutrofili w płucach, prawdopodobnie dlatego, że w płucach 2 dnia znaleziono niewiele neutrofili (ryc. 2F). Aby sprawdzić, czy GFP plus neutrofile wnerkawynaczynionych z tkanki skóry eksponowanej na promieniowanie UV lub PA wewnątrznaczyniowo, porównaliśmy zmiany liczby GFP plus neutrofili uzyskanych znerkimyszy, u których ta sama skóra, która została wystawiona na światło UV, była PA ze światłem fioletowym dzień później (Grupa I) w porównaniu z myszami, u których skóra sąsiadująca z tą ekspozycją na światło UV była PA ze światłem fioletowym dzień później (Grupa II, schemat w dodatku SI, rys. S8A). Chociaż nie było różnic w odsetku krążących neutrofili między grupami (SI Dodatek, Ryc. S8B), większy wzrost GFP plus neutrofili zaobserwowano wnerkimyszy, u których skóra wystawiona na promieniowanie UV była również PA (Grupa I) w porównaniu z brakiem wzrostu GFP plus neutrofili u myszy, u których skóra nienarażona na promieniowanie UV była PA (Grupa II) (SI Dodatek, ryc. S7B). W grupie II liczby neutrofili były podobne do tła dodatniego GFP widocznego na ryc. 5B (dodatku SI, ryc. S8B).

Niski poziom GFP plusnerkaneutrofile w grupie II sugerowały, że światło fioletowe nie wpływa na PA krążących komórek w skórze nienarażonej na promieniowanie UV.nerkadostęp. Aby określić względne proporcje neutrofili TEM, określiliśmy ilościowo ekspresję markerów powierzchniowych użytych do scharakteryzowania neutrofili poddanych rTEM: CXCR4hi (8) i ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Rzeczywiście, GFP plusnerkaneutrofile wyrażały wyższy poziom CXCR4 w porównaniu do GFP plus neutrofile w skórze lub GFP− neutrofili w skórzenerka(Rys. 5C). Z

odsetki,nerkowyekspresja ligandu CXCR4, cxcl12, od 1 do 2 dni po ekspozycji skóry na światło UVB była jednoczesna z obecnością neutrofili CXCR4hi wnerka(Ryc. 1G), prawdopodobnie dostarczając bodźca chemotaktycznego do rekrutacji tych neutrofili do nerki. Co ciekawe, wykryliśmy neutrofile CXCR4hi i ICAM1- hiCXCR1lo w szpiku kostnym późno po ekspozycji na promieniowanie UV (dzień 6, dodatek SI, ryc. S9 B i C), co sugeruje, że niektóre z tych neutrofili również powracają do szpik kostny podobny do tego, który odnotowano dla rTEM po uszkodzeniu wątroby lub infekcji wirusowej skóry (12, 36). Zgodnie z tymi obserwacjami, wykryliśmy wyższą ekspresję CXCR4 na neutrofilach we krwi drugiego dnia po ekspozycji na promieniowanie UV, prawdopodobnie wychwytując komórki w drodze donerkai szpiku kostnego (dodatku SI, ryc. S9D). Podobnie, znacznie większy odsetek komórek ICAM1hiCXCR1lo wykryto wśród GFP plus neutrofile wnerkaw porównaniu z GFP plus neutrofile w skórze i GFP− neutrofile wnerka(rys. 5D). Fenotyp ICAM1hiCXCR1lo wykryto na ~20 do 35 procent GFP plus neutrofile wnerka(ryc. 5D), co sugeruje, że podzbiór neutrofili migrujących donerkaprzez skórę narażoną na promieniowanie UV zrobić to poprzez transmigrację odwrotną, podczas gdy pozostała częśćnerkaneutrofile są prawdopodobnie aktywowane podczas krążenia przez stan zapalny skóry wystawionej na działanie promieni UV. Subpopulację neutrofili ICAM1- hiCXCR1lo wykryto również wnerkinormalnych myszy B6 wystawionych na działanie światła UV, które nie otrzymały PA (dodatek SI, ryc. S9A).

Chociaż zarówno fenotypy neutrofili CXCR4hi, jak i ICAM1hiCXCR1lo wiązano z funkcjami zapalnymi i uszkodzeniem tkanek w różnych modelach mysich (11, 31, 37), przeprowadzono niewiele badań na tych populacjach komórek w chorobach ludzi. Biorąc pod uwagę pojawiającą się rolę neutrofili w SLE (13, 17, 18) i ich widoczną heterogeniczność (19), zbadaliśmy, czy komórki polimorfonuklearne o normalnej gęstości (PMN) czy LDG od pacjentów z SLE

wykazali fenotypy wstecznie migrujące: CXCR4hi (37, 38) i ICAM1hiCXCR1lo. Profilowanie cytometrii przepływowej PMN i LDG ujawniło wyższą ekspresję CXCR4 na powierzchni tych komórek u pacjentów z SLE w porównaniu ze zdrowymi kontrolami (Fig. 6 A i C). Co więcej, znaleźliśmy mały, ale znacząco wyższy odsetek PMN ICAM1hiCXCR1lo we krwi SLE (średnia 3,5 procent) w porównaniu ze zdrowymi kontrolami (średnia 1,4 procent) (Ryc. 6B). Co ciekawe, populacja neutrofili LDG (CD15 plus CD14loCD10 plus w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej [PBMC]) zawierała większy odsetek komórek ICAM1hiCXCR1lo niż PMN zarówno we krwi zdrowej (średnia 7,1 procent), jak i krwi z SLE (średnia 29,4 procent) (Ryc. 6 B i D). Populacja podobna do rTEM była znacząco bardziej reprezentowana w LDG od pacjentów SLE względem zdrowych kontroli (Fig. 6D). Dane te identyfikują obecność fenotypów neutrofili podobnych do rTEM w PMN, a szczególnie LDG u pacjentów z SLE.

Dyskusja

Ogólnoustrojowe skutki ekspozycji skóry na promieniowanie UV są słabo poznane. Identyfikacja tych ścieżek w normalnych warunkach wyjściowych może informować o mechanizmach ogólnoustrojowego zaangażowania tkanek po ekspozycji na słońce, która występuje w chorobach takich jak SLE (2-4). Tutaj przedstawiamy kilka ustaleń dotyczących wpływu ekspozycji na światło słoneczne na nerki. Po pierwsze, wykazaliśmy, że ostra ekspozycja skóry na światło UVB wywołuje reakcje zapalne i urazowe wnerka,w tym subkliniczny białkomocz. Co ciekawe, tenerkowyzmianom towarzyszyła infiltracja neutrofili do nerek po zapaleniu skóry wywołanym przez światło UVB. Odpowiedź neutrofili była zależna od IL-17A i G-CSF. Neutrofile w nerkach miały fenotypy prozapalne, o czym świadczy zewnątrzkomórkowa lokalizacja NE, wyższego odsetka rTEM (CXCR4hi) znanego również jako komórki „starzone” i ICAM1hiCXCR1lo. Neutrofile były bezpośrednio zaangażowane w subkliniczneuszkodzenie nerek,ponieważ zubożenie neutrofili skutkowało znacznym zmniejszeniem ekspresji cząsteczek adhezyjnych, cytokin zapalnych, sygnatury IFN-I i markerów uszkodzenia nerek po ekspozycji skóry na promieniowanie UV.

Stwierdzono, że inne rodzaje uszkodzeń skóry, takie jak odklejanie taśmy i miejscowe stosowanie agonisty TLR7, nasilają sięuszkodzenie nerekw niektórych modelach tocznia, chociaż uważano, że w nasileniu choroby pośredniczą raczej makrofagi i komórki dendrytyczne niż neutrofile (39, 40). Po wykazaniu, że stripping taśmy nie prowadzi do rekrutacji neutrofili donerkaproponujemy, aby ekspozycja na promieniowanie UV różniła się od innych typów sterylnego zapalenia skóry. Można to wytłumaczyć wytwarzaniem fotoproduktów lub unikalnych mediatorów zapalnych po uszkodzeniu UV, które przygotowują nerkę do zapalenia, różnicami w usuwaniu neutrofili po UV w porównaniu z strippingiem taśmą lub innymi czynnikami. Zaobserwowaliśmy, że światło UV wyzwalało szybką i silną indukcję il-17a informacyjnego RNA (mRNA) w skórze wraz z wysokim poziomem krążącego białka IL-17A (∼100-krotny wzrost) , który był wymagany do rekrutacji neutrofili po ekspozycji na światło UV. Jednoczesna 100- do 1,000-krotna indukcja ekspresji g-csf w skórze sugeruje, że oś IL-17A/G-CSF jest prawdopodobnym mechanizmem odpowiedzialnym za neutrofilię i zasiedlanie tkanek neutrofili w odpowiedzi na światło UV. Rola IL-17A w regulacji granulopoezy i rekrutacji neutrofili poprzez indukcję G-CSF jest dobrze znana w warunkach homeostatycznych, a kilka badań wykazało, że IL-17A jest ważna dla rekrutacji neutrofili do miejsc jałowe zapalenie (41, 42). W toczniu podwyższona ekspresja IL-17A występuje w zmianach skórnych (43), a podwyższone poziomy krążącej IL-17A są związane z gorszymi objawami choroby (44), chociaż specyficzny związek z neutrofilami, populacja patogenna w tej chorobie (13, 17, 18) pozostaje niezbadana. Oprócz bezpośredniego wpływu na mobilizację neutrofili ze szpiku kostnego za pośrednictwem G-CSF, IL- 17A może również przyczyniać się do zasiedlania neutrofili wnerkapoprzez stymulowanie ekspresji cząsteczek adhezyjnych (np. VCAM-1 i E-Selectin) nanerkowyśródbłonek (45, 46).

Stosując ten sam model ostrej ekspozycji na promieniowanie UV, pisaliśmy niedawno, że pojedyncza dawka światła UV wywołała lokalną i ogólnoustrojową odpowiedź IFN-I, która była wymagana do skutecznej rekrutacji neutrofili do skóry (6). Ponieważ wykazano, że IFN-I indukuje wytwarzanie IL-17A (47), prawdopodobne jest, że szlaki te albo niezależnie, albo wspólnie prowadzą do rekrutacji i migracji neutrofili, w której pośredniczy światło UV, którą tu przedstawiamy. Podczas gdy nasze odkrycia sugerują zapalną rolę IL- 17A, hamujący wpływ światła UVB na sygnalizację IL-17A był wcześniej zgłaszany w przypadku łuszczycy, gdzie ekspozycja skóry łuszczycowej na światło UVB wyeliminowała patogenne limfocyty T i szpikowe zapalne komórki dendrytyczne (48, 49). Ponieważ skóra łuszczycowa, w przeciwieństwie do zdrowej, jest bogata w limfocyty T wytwarzające IL-17 i reagujące na nie, różnica w składzie komórkowym prawdopodobnie determinuje reakcję na światło UVB, w tym stopień supresji IL za pośrednictwem światła UVB -17Ekspresja receptora (50). Dawkowanie UV może również decydować o wystąpieniu efektu zapalnego czy terapeutycznego: niskie dawki wiążą się z konsekwencjami przeciwzapalnymi i immunosupresyjnymi (51), prawdopodobnie poprzez hamowanie odpowiedzi komórek T CD8 (52).

Neutrofile odgrywają wiele ról podczas zapalenia tkanek. Po aktywacji przez wzorce molekularne związane z patogenem i wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMPS) lub przez zaangażowanie receptora, neutrofile bezpośrednio przyczyniają się do uszkodzenia tkanki poprzez uwalnianie proteaz, ROS i wypychanie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) (53, 54). Neutrofile mogą również promować naprawę tkanek poprzez fagocytozę resztek komórkowych i umożliwiając rewaskularyzację tkanek (8). W SLE sygnatura genu neutrofili jest silnym predyktorem aktywnej choroby, w tym LN i tocznia skórnego (17, 18). Neutrofile znajdują się w zmianach skórnych (13, 14) oraznerkapróbki biopsji (15, 16) pacjentów z SLE, a ich właściwości zapalne przypisuje się częściowo tworzeniu NET (16). Proces ten obejmuje zwiększoną produkcję ROS (55), uwalnianie mitochondrialnego DNA (55) oraz uwalnianie i indukcję białek zapalnych, takich jak s100A9 (56), IL-1b (57) i interferony typu I (55). , 58). Nasze odkrycia, że ​​hamowanie migracji neutrofili do nerek znosiło s100A9 i znacznie zmniejszało ekspresję IL-1b oraznerkaWynik IFN sugeruje, że w grę mogą wchodzić podobne funkcje zapalne. Istotne dla choroby nerek w SLE, granulocyty obojętnochłonne zlokalizowane głównie w śródbłonku TI, miejscu zwiększonej ekspresjiuszkodzenie nerekmarkery kim-1 i lipokalina-2 w tkankach nerki LN (59,60). Proteinuria może powstać z powodu nadmiernej przepuszczalności bariery kłębuszkowej dla białek z powodu upośledzonej reabsorpcji białka przez kanaliki lub połączenia tych mechanizmów (61). Uszkodzenie TI u pacjentów z SLE jest częstym objawem patologicznym w nerkach LN, w tym w przypadku łagodnego uszkodzenia kłębuszków (61, 62). Wykazano, że uraz TI jest czynnikiem prognostycznym ciężkości LN (63, 64), jednak mechanizmy go wywołujące nie są znane. Ponieważ podwyższone kim-1 i lipokalina-2 są rozpoznawanymi markerami uszkodzenia TI w SLE (26, 65) i blokują migrację neutrofili donerkahamując ich ekspresję, proponujemy, że przemijający białkomocz obserwowany po ekspozycji na promieniowanie UV jest konsekwencją subklinicznego zapalenia TI, w którym pośredniczą neutrofile (65). Zwiększona ekspresja vcam nerki-1, kolejny marker uszkodzenia TI w SLE (66), dodatkowo wspiera ten model.

Wykazano, że oprócz rozprzestrzeniania stanu zapalnego w lokalnych miejscach jałowego lub zakaźnego uszkodzenia, neutrofile zasiedlają odległe narządy (8–10), gdzie, w zależności od kontekstu, przyczyniają się do uszkodzenia tkanek poprzez produkcję ROS (11) lub aktywują adaptacyjny układ odpornościowy w węzłach chłonnych i szpiku kostnym (9, 12). Zapalny charakter tych neutrofili przypisuje się ich zdolności do opuszczenia pierwotnego miejsca uszkodzenia i migracji do miejsc wtórnych, czyli poddania się rTEM (9–11, 31–34). Nasze odkrycia, że ​​PA komórek zawierających GFP w skórze po ekspozycji na promieniowanie UV doprowadziło do wykrycia GFP plus neutrofili wnerkaz fenotypem rTEM sugerują, że subpopulacjanerkowyneutrofile cofają migrację ze skóry wystawionej na promieniowanie UV (GFP plus neutrofile stanowią około 20 procentnerkaneutrofile, z których 20 do 35 procent to rTEM; dlatego rTEM stanowią od 4 do 7 procent całościnerkaneutrofile). Ten odsetek rTEM jest porównywalny do odsetka zgłaszanego po jałowym uszkodzeniu wątroby (~9 procent) (36) i uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym (~8 procent) (11). Wykazano, że rTEM w innych okolicznościach są prozapalne (10, 11) i mają zaburzoną apoptozę (35), co prowadzi do możliwości, że odgrywają rolę w indukowanych przez UVuszkodzenie nerek.Podwyższona ekspresja CXCR4 na tych neutrofilach jest szczególnie istotna, jako przypadeknerkowyZaobserwowano ekspresję cxcl12, ligandu CXCR4 wyrażanego przez podocyty i kanaliki (24), prawdopodobnie dostarczając sygnału chemotaktycznego dla tej populacji neutrofili. Zwiększona ekspresja CXCR4 na komórkach odpornościowych w połączeniu z wysokim poziomemnerkowyCXCL12 zostały zidentyfikowane u pacjentów z SLE z LN (67), a szlak ten był powiązany z toczniem, jak również z niedokrwieniem-reperfuzjąuszkodzenie nereku myszy (24, 68). Oprócz bycia markerem rTEM, zwiększona ekspresja CXCR4 jest również wskaźnikiem „starszych” neutrofili, które mogą pośredniczyć w odpowiedziach zapalnych uszkadzających tkanki (38). Dokładna rola CXCR4 w rekrutacji neutrofili donerkamożna badać pod kątem antagonizmu wobec CXCR4, jak wcześniej przeprowadzono w innych modelach urazu jałowego (38).

Specyficzna tkankowo migracja neutrofili i mechanizmy odpowiedzialne za zróżnicowaną ekspresję cząsteczek adhezyjnych w różnych narządach nie są dobrze poznane (69). Wyższe poziomy ekspresji chemokiny cxcl12 wnerkaale płuco nie mogło wyjaśnić preferencyjnej obecności neutrofili CXCR4hi w nerkach. Ponadto indukcja ekspresji vcam-1 i e-selektyny w nerkach, w porównaniu z brakiem zmiany ekspresji w płucach, prawdopodobnie przyczynia się do preferencyjnej rekrutacji i zatrzymywania neutrofili w nerkach. 5- do 6-krotny wzrost ekspresji s100A9 w płucach w porównaniu z 30- do 60-krotnym wzrostem w nerkach, jak również 6-krotny wzrost w ekspresji il-1b w płucach w porównaniu z 16-krotnym wzrostem w nerkach dodatkowo wskazują na różnice tkankowe w odpowiedzi zapalnej. Zmniejszenie naciekania neutrofili w nerkach po neutralizacji G-CSF można przypisać zarówno zmniejszeniu liczby krążących, jak i aktywacji neutrofili, jak również zmniejszeniu lokalnej ekspresji vcam-1 i e-selektyny. Jednak nie możemy być pewni, czy początkowa regulacja w górę tych cząsteczek adhezyjnych po ekspozycji skóry na promieniowanie UV jest przypisywana cytokinom/DAMPS pochodzącym ze skóry, czy też neutrofile, poprzez uwalnianie proteaz serynowych, przyczyniają się bezpośrednio do ich ekspresji, jak wykazano w innych konteksty (70). Niezależnie od mechanizmów i zauważając, że nie przeprowadziliśmy kompleksowej analizy wszystkich tkanek, nasze badania dostarczają dowodów na pewną selektywność narządową w działaniach ogólnoustrojowych za pośrednictwem światła UV. Przyszłe badania zajmą się specyficznymi tkankowo funkcjonalnymi konsekwencjami ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się neutrofili, na przykład przez wyciek albuminy z naczyń krwionośnych i powstawanie obrzęków w płucach (11, 36).

U pacjentów z SLE trudno jest jednoznacznie powiązać ekspozycję skóry na promieniowanie UV z zaostrzeniami choroby ogólnoustrojowej, ponieważ istnieje znaczna zmienność (1 do 3 tygodni) w widocznych odpowiedziach nadwrażliwości na światło u różnych osób (21). Ponadto subkliniczneuszkodzenie nerekmożna łatwo przeoczyć, dopóki kolejne ekspozycje na światło UV nie spotęgują efektów. Chociaż stwierdziliśmy, że za pośrednictwem neutrofilizapalenie nerekw odpowiedzi na światło UV nie powoduje choroby klinicznej u zdrowych myszy, taki mechanizm może przyczyniać się do rozbłysków LN u pacjentów z toczniem światłoczułym na wiele sposobów. Zaangażowanie receptora Fc przez kompleksy immunologiczne może zwiększyć rekrutację neutrofili, powodując uwalnianie ROS i proteazy (71); zwiększona zdolność neutrofili toczniowych i LDG do wytwarzania NET, które u pacjentów z SLE nie są skutecznie usuwane (72), może prowadzić do uwalniania uszkadzających tkanki proteaz (73), propagacji odpowiedzi IFN-I (58) lub bezpośrednie uszkodzenienerkaśródbłonek poprzez tworzenie uszkodzeń naczyń i nieszczelności (16). Co więcej, leżące u podstaw różnice w skórze tocznia, takie jak zwiększona sygnalizacja IFN-I (5, 74) i defekty w ochronnej populacji komórek Langerhansa (75), mogą informować o zakresie i charakterze ogólnoustrojowych odpowiedzi, w których pośredniczą neutrofile. Śledzenie migracji neutrofili w połączeniu z badaniem autoprzeciwciał, akumulacją komórek apoptotycznych i niskimi poziomami dopełniacza można rozwiązać przy użyciu nowych modeli tocznia, takich jak genetycznie zdefiniowane potrójne mutanty (Sle1.Mfge8-/- C1q-/- i Sle1.Mfge8- /-C3-/-) (76) albo inne szczepy tocznia następujące po ekspozycji na światło UV.

Dokładne mechanizmy łączące granulocyty obojętnochłonne ze stanem zapalnym w SLE mogą dodatkowo zależeć od fenotypu granulocytów obojętnochłonnych/LDG, ponieważ niejednorodność w tych populacjach stała się bardziej widoczna (77). Nasze odkrycia dotyczące podniesionych populacji krążących CXCR4 i ICAM1hiCXCR1lo (rTEM), szczególnie w przypadku SLE LDG, dodatkowo zwiększają tę niejednorodność i sugerują, że niektóre z bardziej prozapalnych granulocytów we krwi mogły mieć wcześniejsze „doświadczenie tkankowe”, to znaczy przebywanie w dotknięte tkanki narządów, takie jak skóra, przed ogólnoustrojowym rozsiewem. Fenotypy rTEM były wcześniej zgłaszane w płynie maziowym i krążących neutrofilach pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (35, 78) oraz w ostrym uszkodzeniu płuc związanym z zapaleniem trzustki (79). Ich rola w SLE gwarantuje dalsze dochodzenie.

CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK/NEREK

Materiały i metody

Myszy.Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Washington, Seattle. Wstępne eksperymenty przeprowadzono z użyciem samców i samic myszy C57BL/6J (Jackson Laboratory, 3 do 4 miesięcy, Ryc. 1 i 2). We wszystkich kolejnych eksperymentach stosowano samice myszy. Badania PA przeprowadzono na B6. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J samice myszy (Jackson Laboratory, 3 do 4 miesięcy). Myszy te zostały wygenerowane przez wstrzyknięcie transgenicznego wektora niosącego PAGFP (wariant T203H) pod transkrypcyjną kontrolą promotora ludzkiej ubikwityny C do zarodków C57BL/6. Zwierzęta utrzymywano w warunkach wolnych od patogenów i utrzymywano w cyklach światło-ciemność przez 12 godzin z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Doświadczenia na wszystkich zwierzętach przeprowadzono o tej samej porze dnia, aby uniknąć wpływu rytmu okołodobowego na migrację neutrofili (38).

Ekspozycja na światło UVB i zdejmowanie taśmy.Grzbietowy aspekt samców i samic myszy C57BL/6 ogolono co najmniej 24 godziny przed napromieniowaniem światłem UVB, a w doświadczeniach użyto tylko myszy o skórze niepigmentowanej. Myszy znieczulano izofluranem i eksponowano na jedną dawkę światła UVB (500 mJ/cm2) przy użyciu żarówek FS40T12/UVB (National Biological Corporation), z emisją szczytową między 300 a 315 nm. Energię światła UVB na powierzchni grzbietowej mierzono za pomocą radiometru Photo light IL1400A wyposażonego w detektor SEL240/UVB (International Light Technologies). Myszy uśmiercono 1, 2 lub 6 dni po ekspozycji na światło UVB, a nienapromieniowane myszy użyto jako kontroli (D-1) (Fig. 2A). Zdzieranie naskórka wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (7), a skórę inerkazostały ocenione 24 h po kontuzji

Hamowanie IL-17A i G-CSF.Myszy traktowano dożylnie 100 ug oczyszczonej szczurzej anty-mysiej IL-17IgG (BioLegend) lub kontrolą izotypową 3 godziny przed ekspozycją na światło UV (1 x 500 mJ/cm2) (Fig. 3I). Obecność neutrofili we krwi, skórze i perfuzji soli fizjologicznejnerkatkankę oceniano metodą cytometrii przepływowej 24 godziny po ekspozycji na promieniowanie UV, jak opisano poniżej. Migracja neutrofili w odpowiedzi na światło UV była hamowana przez podawanie myszom dootrzewnowo 50 ug przeciwciała monoklonalnego przeciwko mysiemu G-CSF lub kontroli izotypu mysiego IgG (R&D Systems) 24 godziny i 3 godziny przed ekspozycją skóry na światło UVB (1 × 500 mJ /cm2) (rys. 4A). Po perfuzji serca liczba neutrofili i monocytów wnerkaoceniano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji genów za pomocą qPCR, jak opisano poniżej. Myszy nienaświetlone światłem UVB zastosowano jako dodatkową grupę kontrolną.

Izolacja komórek z różnych narządów.Po eutanazji z inhalacją CO2 usunięto kawałek skóry grzbietowej i trzymano w roztworze RPMI (Roswell Park Memorial Institute) na lodzie do czasu przetworzenia. Krew pobierano przez nakłucie serca do strzykawek pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym. Perfuzję serca następnie przeprowadzono przy użyciu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (~60 ml) przez lewą komorę po przecięciu prawego przedsionka. Udana perfuzja została określona na podstawie obserwacji pełnejnerkai bladość płuc. Płuca, nerki, śledzionę i obie kości udowe usunięto ostrożnie i umieszczono w roztworze RPMI na lodzie do czasu przetworzenia próbki. Komórki izolowano z równoważnych obszarów tkanki skórnej (∼30 mm2) przez mielenie i trawienie tkanki 0.28 jednostek/ml Liberase TM (Roche) i 0,1 mg/ml dezoksyrybonukleazy I ( Worthington) w PBS z Ca plus 2 i Mg plus 2 przez 60 min w 37 stopniach z wytrząsaniem. Komórki zostały wyizolowane z jednegonerkana zwierzę;nerkaTkanki rozdrabniano i trawiono w 2 mg/ml kolagenazy typu I (Worthington) przez 30 min w 37 stopniach zgodnie z opublikowanym protokołem. Komórki płuc zebrano trawiąc tkankę w PBS (Ca plus 2 i Mg plus 2) z 1 mg/ml kolagenazy typu 1 i 60 U dezoksyrybonukleazy I. Całe śledziony zmiażdżono na 40 μm sitku do komórek i przemyto roztworem RPMI. Krew pełną i komórki ze śledziony, szpiku kostnego, nerek i płuc potraktowano 1X buforem do lizy czerwonych krwinek (RBC) (BD Biosciences). Po izolacji/trawieniu komórki ze wszystkich tkanek przefiltrowano (40 μm), przemyto PBS i ponownie zawieszono w roztworze RPMI przed zliczaniem.

Barwienie i analiza cytometrii przepływowej.Komórki traktowano Fc Block TruStain FcX (Biolegend) i barwiono barwnikiem Zombie Aqua Viability (Biolegend) zgodnie z zaleceniami sprzedawcy. Komórki przepłukano i przeprowadzono barwienie powierzchni przy użyciu specyficznych dla myszy przeciwciał fluorescencyjnych zakupionych od Biolegend. Różne populacje komórek szpiku analizowano w bramce żywych komórek odpornościowych (Zombie Aqua-CD45 plus). Oznaczono ilościowo procent i liczbę neutrofili (Ly6CintLy6Ghi) i monocytów (Ly6C plus Ly6G−). Reprezentatywne bramkowanie cytometrii przepływowej przedstawiono w załączniku SI, ryc. S10. Procentową ekspresję i średnie intensywności fluorescencji markerów powierzchniowych w modelu PA (CXCR4, ICAM1 i CXCR1) określono stosując kontrole barwienia fluorescencji minus jeden (FMO) w bramce neutrofili (Ly6Ghi). Wszystkie próbki poddano obróbce przy użyciu cytometru przepływowego CytoFLEX (Beckman Coulter), a dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo w wersji 10 (Tree Star).

Badania fotoaktywacji (PA).Myszy UBC-PA-GFP ogolono i część grzbietu napromieniowano jedną dawką światła UVB (500 mJ/cm2) jak powyżej. Tylko obszar skóry, który będzie poddany fotokonwersji, został wystawiony na działanie światła UVB, podczas gdy pozostała część skóry została pokryta folią aluminiową. Po 24 godzinach od sterylnego uszkodzenia wywołanego przez UVB, cały obszar skóry napromieniowany UVB poddano działaniu światła fioletowego (405 nm) przy użyciu 50 W lampy z diodą elektroluminescencyjną z włóknem 0,37 apertury numerycznej (NA) (Mightex) o mocy 100 mW (15 min ekspozycji na obszar). Metodę tę zoptymalizowano w oparciu o opublikowany protokół fotokonwersji specyficznej dla skóry (80).Nerkia płuca zebrano i poddano obróbce do analizy metodą cytometrii przepływowej 24 godziny po PA, jak opisano powyżej. Podejście i harmonogram przedstawiono na schemacie na ryc. 5A. Procent GFP plus neutrofile wnerkaporównano z tymi stwierdzonymi u myszy w trzech warunkach kontrolnych: 1) brak UV i brak PA, 2) UV, ale bez PA i 3) brak UV, ale PA. Poziomy ekspresji CXCR4 i fenotyp ICAM1hiCXCR1lo w obrębie GFP plus i GFP− neutrofili w skórze inerkazostały ocenione za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu specyficznych dla myszy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał zakupionych od Biolegend. Aby określić, czy GFP plus neutrofile wnerkapochodziła ze skóry, a nie z krwi, skóra w jednej grupie myszy była wystawiona na działanie światła UV i PA, jak opisano powyżej (grupa I), podczas gdy w innej grupie skóra była eksponowana na światło UV, ale PA przeprowadzono na sąsiednim obszarze skóry nienarażona na promieniowanie UV (Grupa II) (schemat w SI Załącznik, Rys. S7A).Nerkizostały zebrane i przetworzone do analizy metodą cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej.

Ekspresja genów i analizy proteomiczne.Skóra,nerka,a próbki płuc przechowywano w roztworze RNAlater (QIAGEN). RNA wyekstrahowano za pomocą zestawu RNeasy Kit firmy QIAGEN, a komplementarny DNA (cDNA) zsyntetyzowano za pomocą zestawu do syntezy cDNA o dużej pojemności (Applied Biosystems). Transkrypty zapalnych chemokin, cytokin i cząsteczek adhezyjnych oznaczono ilościowo za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów wymienionych w SI Dodatek, Tabela S1 i znormalizowano do średnich poziomów transkryptów 18S. Zastosowana dawka światła UVB nie wpływała na ekspresję 18S w żadnym z narządów. Względną ekspresję docelowych mRNA określono przy użyciu standardowego wzoru 2^(−Ct) × współczynnik. Wyniki IFN uzyskano z ekspresji 10 reprezentatywnych genów stymulowanych interferonem (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 i ifi2712a), jak opisano wcześniej (6). Średnia i SD względnej ekspresji każdego ISG zostały określone wnerkimyszy nie wystawionych na działanie światła UV (meannoUV i SDnoUV). Zastosowano je następnie do standaryzacji poziomów ekspresji każdego ISG w nerkach leczonych myszy (izotyp IgG plus UVB lub a-GCSF plus UVB). Standaryzowane poziomy ekspresji zostały następnie zsumowane dla każdej myszy w celu uzyskania wyniku ekspresji IFN; i=wyrażenie każdego ISG; Leczenie genowe=względny poziom ekspresji genów po leczeniu; oraz względny poziom ekspresji genu genu inoUV=u myszy nieeksponowanych na światło UVB. ∑ 10 i=1=Obróbka genetyczna−meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Poziomy białka w ekstraktach białkowych z osocza i tkanek skóry mierzono za pomocą określonych paneli analitów LEGENDplex Mouse Inflammation Panel i Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

IF Barwienie zamrożonych tkanek nerek.Perfumowany solą fizjologicznąnerkiutrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 1 hw temperaturze pokojowej i po zanurzeniu w 30% sacharozie zamrożono w optymalnym podłożu do cięcia (Sakura Finetek). Skrawki tkanek 5-μm uwodniono w PBS przed barwieniem IF. Tkanki permeabilizowano za pomocą 0,1% Triton X-100 w PBS, a następnie zablokowano w PBS plus 0,1% Triton X-100/5 procent BSA (albumina surowicy bydlęcej)/5 procent surowicy królika . Komórki NE i śródbłonka wykrywano przez barwienie odpowiednio anty-mysim NE Cy5 (1:100, Bioss) i anty-mysim PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), w 4 stopniach przez noc. Obecność neutrofili wnerkazostało potwierdzone przez barwienie anty-mysim Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Tkanki mocowano za pomocą ProLong Gold z pożywką montażową 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) (Invitrogen) i obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, University of Washington).

Ocena histologiczna skóry.Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie skrawki tkanek skóry (4 do 5 μm) wybarwiono hematoksyliną i eozyną w University of Washington Histology and Imaging Core przed promieniowaniem UV, w dniu 1, dniu 2 i dniu 6 po napromieniowaniu UVB (n {{ 7}} samice). Skórę oceniano w sposób zaślepiony pod kątem następujących parametrów: zapalenie skóry właściwej/warstwy podskórnej, śmierć komórek naskórka, akantoza, nadmierne rogowacenie, tworzenie się strupów surowiczokomórkowych i erozja/owrzodzenie. Parametry te zostały ocenione w skali od 0 do 4 w zależności od ciężkości i rozległości, z wyjątkiem nadżerek/owrzodzeń, które oceniono jako obecne (1) lub nieobecne (0). Reprezentatywne obrazy zostały zrobione przy użyciu NIS-Elements BR 3.2 64bit i pokryte w Adobe Photoshop z korektami oświetlenia zastosowanymi do całego obrazu. Podano oryginalne powiększenie.

Pomiary moczu.Poziomy białka w moczu oceniano za pomocą testu białkowego Bradforda (Thermo Fisher Scientific). Próbki moczu badano w rozcieńczeniu 1:40 w PBS, a stężenie białka w moczu określano na podstawie seryjnych rozcieńczeń znanych stężeń BSA. Stosunek albumina/kreatynina w moczu oceniano stosując test albumin Albuwell i zestaw Creatinine Companion Kit (Exocell) zgodnie z instrukcjami producenta.

Pobieranie próbek ludzkich i analiza cytometrii przepływowej.Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną Instytucji Uniwersytetu Waszyngtońskiego (STUDY00001145). Krew pełną pobrano do heparynizowanych probówek od zdrowych ochotników i pacjentów z SLE po uzyskaniu świadomej zgody. Neutrofile (PMN) i PBMC izolowano przez nieciągły rozdział gradientowy Ficoll-Paque (GE Healthcare). PMN oczyszczono z osadu erytrocytów przez sedymentację 5% dekstranu. Po lizie RBC, komórki barwiono znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami zakupionymi od Biolegend, a ekspresję CXCR4 i procent komórek ICAM1hiCXCR1lo oceniano w PMN (CD66bplus) i LDG (CD15plus, CD14lo i CD10plus w PBMC (19)). Strategię bramkowania dla barwienia LDGs i ICAM1hiCXCR1lo w oparciu o FMO przedstawiono w SI Dodatek, ryc. S11. Próbki przetwarzano przy użyciu cytometru przepływowego CytoFLEX (Beckman Coulter), a dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo w wersji 10 (Tree Star).

Analizy statystyczne.Dane analizowano przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) i przedstawiono jako średnią ± SEM. Różnicę statystyczną między dwiema grupami danych określono względem nienapromieniowanych kontroli (D-1) stosując test Studenta. Do określenia istotności statystycznej między trzema grupami zastosowano jednokierunkową analizę ANOVA z wielokrotnymi porównaniami i post hoc Tukeya.