Acylowane oligoglikozydy fenyloetanoidowe o działaniu chroniącym wątrobę z rośliny pustynnej Cistanche Tubulosa

więcej informacji:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa i inni

Abstrakcyjny

Ekstrakt metanolowy ze świeżych łodygCistanche tubulosa(Orobanchaceae) wykazują działanie ochronne na wątrobę przeciwko uszkodzeniu wątroby wywołanemu przez D-galaktozaminę (D-GalN)/lipopolisacharyd (LPS) u myszy. Z ekstraktu trzy nowefenyletanoidoligoglikozydy, kankanozydy H1 (1), H2 (2) i I(3) wyizolowano razem z 16glikozydy fenyloetanoidowe(4-19) i dwa acylowane oligocukry (20,21). Struktury 1–3 określono na podstawie właściwości spektroskopowych oraz dowodów chemicznych. Wśród izolatów echinakozyd (4, IC50=10,2 IM), akteozyd (5, 4,6 IM), izoakteozyd (6,5,3 IM), 20-acetyloakteozyd (8, 4,8 IM) i tubulozyd A (10, 8,6 µM) hamował śmierć hepatocytów indukowaną D-GalN. Tych pięć izolatów, 4 (31,1 lm), 5 (17,8 lm), 6 (22,7 lm), 8 (25,7 lm) i 10 (23,2 lm) oraz cistantubulozyd B1 (11, 21,4 IM) również redukowało TNF-α- indukowana cytotoksyczność w komórkach L929. Ponadto główne składniki (4–6) wykazywały in vivo działanie ochronne na wątrobę w dawkach 25–100 mg/kg PO.

Kliknij, aby uzyskać efekty uboczne Cistanche i produkty Cistanche

1. Wstęp

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) jest wieloletnią rośliną pasożytniczą rosnącą na korzeniach gatunków Salvadora lub Calotropis i występującą w Afryce Północnej, Arabii i krajach azjatyckich.Cistanche tubulosajak również salsa pomocowa i Cistanche deserticola były tradycyjnie stosowane w leczeniu impotencji, bezpłodności, lumbago i osłabienia organizmu, a także jako środek pobudzający krążenie krwi.2,3 Wcześniej kilkafenyletanoids, irydoidy, monoterpeny i lignany wyizolowano z Chin i PakistanuCistanche tubulosa.2,4-9 W trakcie naszych badań charakteryzujących składniki bioaktywne w tej medycynie naturalnej pisaliśmy wcześniej, że pięć irydoidów, kankanozydy A–D i kankanol, monoterpenoglikozyd, kankanozyd E, dwafenyletanoidoligoglikozydy, kankanozydy F i G (23) oraz acylowany oligocukier, kankanose(21), wyizolowano z metanolowego ekstraktu suszonych łodygCistanche tubulosa.10,11 Ponadto ekstrakt metanolowy i kilka izolatów, takich jak echinakozyd (4), akteozyd (5), cistanozyd F (20), 21 i kankanozyd F, wykazały działanie rozkurczające naczynia, to znaczy hamujące skurcze wywołane przez noradrenalinę w izolowanej aorcie piersiowej szczura.11 W naszych ciągłych badaniach nad składnikami rośliny, metanolowy ekstrakt ze świeżych łodygKanaliki Cistanche byłystwierdzono, że wykazuje działanie ochronne na uszkodzenie wątroby wywołane przez D-galaktozaminę (D-GalN)/lipopolisacharyd (LPS) u myszy. Z ekstraktu metanolowego wyizolowaliśmy trzy nowefenyletanoidoligoglikozydy nazwane kankanozydami H1 (1), H2 (2) i I (3) wraz z 16 glikozydami fenyloetanoidowymi (4–19) i dwoma acylowanymi oligocukrami (20, 21). Niniejszy artykuł dotyczy wyodrębniania i wyjaśniania strukturalnego tych nowychfenyletanoidoligoglikozydy (1–3). Omówiono również strukturalne wymagania glikozydów fenyloetanoidowych dla działania hepatoprotekcyjnego (ryc. 1)

2. Wyniki i dyskusja

2.1. Ochronne działanie metanolowego ekstraktu z łodygCistanche tubulosana uszkodzenie wątroby wywołane przez D-GalN/LPS u myszy

Świeże łodygiCistanche tubulosa(uprawiane w Urumqi, prowincja Xinjiang, Chiny) wyekstrahowano metanolem w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, uzyskując ekstrakt metanolowy (8,36 procent ze świeżych łodyg). Jak pokazano w Tabeli 1, w dawkach 250-500 mg/kg PO, ekstrakt metanolowy wykazywał hamujący wpływ na wzrost poziomu aminotransaminazy asparaginianowej (sAST) i aminotransaminazy alaninowej (sALT), markerów uszkodzenia wątroby, indukowanych przez D- GalN/LPS u myszy.

2.2. Składniki chemiczne z łodygCistanche tubulosa

Ekstrakt metanolowy ze świeżych łodygCistanche tubulosapoddano chromatografii kolumnowej Diaion HP-20 (H2O?MeOH) uzyskując frakcje eluowane H2O i MeOH (odpowiednio 5,63% i 2,73 procent). Frakcję eluowaną MeOH poddano chromatografiom SiO2 i ODScolumn, a na koniec HPLC, uzyskując trzy nowefenyletanoidoligoglikozydy, kankanozydy H1 (1, 0.0008 procent ), H2 (2, 0,0001 procent ) i I (3, 0,0007 procent ) wraz z 16glikozydy fenyloetanoidowe, echinakozyd2,11 (4, 0,45 procent), akteozyd2,11 (5, 0,28 procent), izoakteozyd2,11 (6, 0.0 41 procent), cis-akteozyd12,13 (7, 0.0007 procent), 20-acetyloakteozyd2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 procent), bezkofeoilakteozyd14 (9, 0.0002 procent ), tubuloboczna A2,11 (10, 00,013 proc.), cistantubulozydy B19 (11, 0,0020 proc.), B29 (12,0,0003 proc.), arenariozyd15 (13, 0,0006 proc.), wiedemanninozyd C16 (14 00008 procent), cistantubulozyd A9 (15, 0,0009 procent), syringalid A 30-OaL ramnopiranozyd4 (16, 0,0017 procent), kamneozydy I17,18 (17,015 procent) i II17,18 (18 0,0005 procent) i salidrozyd11 (19, 0,0027 procent) oraz dwa acylowane oligocukry, cistanozyd F11 (20, 0,0004 procent) i kankanose11 (21, 0,0004 procent).

2.3. Struktury kankanozydów H1 (1), H2 (2) i I (3)

Kankanoside H1 (1) otrzymano w postaci białego proszku o ujemnej skręcalności optycznej (½a-24D-45,3 w MeOH). Jego widmo IR wykazało pasma absorpcji przy 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{1{07}}70 i 1040 cm 1 przypisywane hydroksylom, estrokarbonylom, grupom eterowym, i pierścienie aromatyczne. Widma FABMS jonów dodatnich i ujemnych 1 wykazały piki jonów quasimolekularnych odpowiednio przy m/z 835 (M plus Na) plus i m/z 811 (MH), a wzór cząsteczkowy określono jako C37H48O20 za pomocą pomiar jonów FABMS. Widma 1H i 13C NMR 1 (CD3OD, Tabele 2 i 3), które zostały przypisane w różnych eksperymentach NMR,19 wykazały sygnały, które można przypisać dwóm metylenom [d 2,70 (2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H każdy, oba m, H2-8)], orto- i metasprzężone protony aromatyczne typu ABC [d 6,52 (1H, dd, J=1,8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz,H{{62) }})], dwa ugrupowania bD-glukopiranozylowe [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz,terminal-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }},2 Hz, wewnętrzna grupa Glc-H-1)] i aa-L-ramnopiranozyl [d 1,06 (3H, d, J=6,0 Hz, Rha-H{{89 }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] razem z grupą acetylową [d 1,98(3H, s)] i grupą trans-p-kumaroilową {trans-olefiną [d 6,34,7,67 (1H każdy, oba d, J=16,0 Hz, H-8 i 7)] i orto-sprzężone protony aromatyczne typu A2B2- [d 6,80, 7,46 (2H każdy , zarówno d,J=8,7 Hz, H-3,5 jak i 2,6)]}. Powiązania między ugrupowaniami oligoglikozydowymi i acylowymi w 1 zostały scharakteryzowane przez eksperyment HMBC, który wykazał długozasięgowe korelacje między następującymi parami proton-węgiel: wewnętrzna-Glc-H-1 i C-8 (dC71.9 ); wewnętrzny Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-like)] i acetylokarbonylowęgiel (dC 171,4); wewnętrzny Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9,6,9,6 Hz)] i węgiel p-kumaroilokarbonylowy (dC 168,2); Rha-H-1 i wewnętrzny Glc-C-3 (dC 80,5); i terminal-Glc-H-1 i wewnętrzny-Glc-C-6 (dC69.3) (Fig. 2). Na koniec hydroliza alkaliczna 1 z 5% wodorotlenkiem potasu (KOH) uwolniła kwas trans-p-kumarowy, który zidentyfikowano za pomocą analizy HPLC, razem z produktem deacylowanym. Deacylowany produkt był kolejno traktowany 1,0 M kwasem chlorowodorowym (HCl) w celu uwolnienia L-ramnozy i D-glukozy, które zidentyfikowano za pomocą analizy HPLC przy użyciu optycznego detektora rotacji.10,11 W ten sposób wyjaśniono strukturę kankanozydu H1 jako {{181 }} (3,4-dihydroksyfenylo)etylo OaL-ramnopiranozylo-(1- 3)-[bD-glukopiranozylo-(1-6)]-2-O-acetyl{{196 }}O-trans-p-kumaroilo-bD-glukopiranozyd (1).

Kankanoside H2 (2) wyizolowano jako biały proszek z ujemną skręcalnością optyczną (½a 25 D 52,4 w MeOH). Stwierdzono, że jego wzór cząsteczkowy C37H48O20 jest taki sam jak 1 za pomocą wysokorozdzielczego pomiaru FABMS jonów dodatnich. Właściwości spektroskopowe 2 były bardzo podobne do tych z 1, z wyjątkiem sygnałów związanych z grupą cis-p-kumaroilową [d 5,79, 6,95 (1H każdy, oba d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} i 7), 6,76, 7,73 (po 2H, oba d, J=8,7 Hz, H-3,5 i 2,6)]. Co więcej, eksperyment HMBC na 2 również ujawnił podobne tryby korelacji dalekiego zasięgu, jak te wykryte dla 1, między następującymi parami proton-węgiel: wewnętrzna-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44) }},8 Hz)] i C-8 (dC 72,0); wewnętrzny Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] i węgiel acetylokarbonylowy (dC 171,4); wewnętrzny Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6,9,7 Hz)] i węgiel p-kumaroilokarbonylowy (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H-1)] i wewnętrzny-Glc-C-3 (dC 80,7 ); i terminal-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Hz)] i wewnętrzny Glc-C-6 (dC 69,4) (Rys. 2) . W badaniu degradacji 2 dało kwas cis-p-kumarowy i dwa takie same cukry, jak te otrzymane w przypadku 1. W konsekwencji, struktura kankanozydu H2 została wyjaśniona jako 2-(3,4- dihydroksyfenylo)etylo OaL-ramnopiranozylo-(1-3)-[bD-glukopiranozylo-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-kumaroilo- bD-glukopiranozyd (2).

Kankanoside I (3) wyizolowano również w postaci białego proszku o ujemnej skręcalności optycznej (½a- 25D-62,2 w MeOH). Jego wzór cząsteczkowy, C35H46O18, został określony za pomocą dodatnich i ujemnych pomiarów FABMS i HRFABMS. Właściwości spektroskopowe 3(CD3OD, Tabele 2 i 3) nakładały się na właściwości echinakozydu (4), z wyjątkiem sygnałów związanych z częścią aglikonową {{dwa metyleny {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J=16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monopodstawione aromatyczne protony [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26-7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Zasadowa hydroliza 3 z uwolnionym 5% KOH kwasem trans-kafeinowym i deacylowany produkt był kolejno traktowany 1,0 M HCl w celu uwolnienia L-ramnozy i D-glukozy. Na koniec, połączenia grupy acylowej i ugrupowań cukrowych w 3 zostały wyjaśnione w eksperymencie HMBC, jak pokazano na Figurze 2. Na podstawie wyżej wymienionych dowodów wyjaśniono strukturę kankanozydu I jako 2-fenyloetyl OaL- ramnopiranozylo-(1-3)-[bD-glukopirano-sylo-(1-6)]-4-O-trans-kafeoilo-bD-glukopiranozyd (3)

2.4. Wpływ składników chemicznych z łodyg Cistanche tubulosa na cytotoksyczność indukowaną D-GalN w pierwotnych hodowanych hepatocytach myszy

Uważa się, że uszkodzenie wątroby wywołane D-GalN/LPS rozwija się poprzez reakcje immunologiczne.19 Ten typ uszkodzenia wątroby występuje w dwóch postaciach. Po pierwsze, D-GalN zwiększa wrażliwość na TNF-a poprzez zubożenie trójfosforanu urydyny w hepatocytach. Po drugie, mediatory prozapalne, takie jak NO i TNF-a, są uwalniane z makrofagów aktywowanych przez LPS (komórki Kupffera). Stwierdzono, że apoptoza hepatocytów przez TNF-α odgrywa ważną rolę w uszkodzeniu wątroby wywołanym przez D-GalN/LPS.20

W naszych wcześniejszych badaniach nad związkami hepatoprotekcyjnymi z leków naturalnych pisaliśmy, że kilka składników z Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,32 Anastatica hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 i Piper chaba42,43 wykazały hepatoprotekcyjne działanie na uszkodzenie wątroby wywołane przez DPS-Gal. u myszy i/lub platyphylla var. japonica,29 Hamujący wpływ Pisum na cytotoksyczność indukowaną D-GalN w pierwotnych hodowlach hepatocytów. Ponieważ ekstrakt metanolowy z łodygCistanche tubulosawykazały hepatoprotekcyjne działanie na indukowane D-GalN/LPS uszkodzenie wątroby u myszy (vide ante), hamujący wpływ składników na cytotoksyczność indukowaną przez D-GalN w pierwotnych hodowanych mysich hepatocytach zbadano za pomocą 3-(4,{ Test {6}}dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT). Jak pokazano w Tabeli 4, echinakozyd (4, IC50=10.2 µM), akteozyd (5, 4,6 µM), izoaceteozyd (6, 5,3 µM), 20-acetyloakteozyd (8, 4,8 µM), tubulozydy A (10,8,6 lM) i B11 (22, 14,6 lM) oraz kankanozyd G11 (23, 14,8 lM) wykazały silną aktywność. Ich aktywność była większa niż komercyjnej sylibiny (38,8 lM),33-43 jako kontrola pozytywna.44,45 Wymagania strukturalneglikozydy fenyloetanoidowe for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 mM)]; (2) aglikon mający grupę 3,4-dihydroksylową wykazywał silniejszą aktywność niż aglikon mający grupę 4-hydroksylową (6 > 23); (3) ugrupowanie 60-ObD-glukopiranozylowe zmniejszało aktywność (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" część="" 8-obd-glukopiranozylowa="" mająca="" grupę="" 40-o-kafeoilowa="" wykazała="" silniejszą="" aktywność="" niż="" ta="" mająca="" grupę="" 60-o-kafeoilową="" (5="6," 8=""> 22 ); i (5) wprowadzenie ugrupowania 20-O-acetylowego zmniejszyło aktywność (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 µM, dane nieprzedstawione). Stwierdzono zatem, że związki te nie wpływają na nadprodukcję NO i TNF-α z makrofagów aktywowanych LPS.

2.5. Wpływ składników chemicznych na cytotoksyczność indukowaną TNF-α w komórkach L929

W celu wyjaśnienia wpływu składników na wrażliwość hepatocytów na TNF-α, indukowany TNF-α spadek żywotności komórek L929, zbadano linię komórkową wrażliwą na TNF-α48 przy użyciu testu MTT. Bez próbek testowych żywotność komórek zmniejszyła się do ok. 60 procent po inkubacji komórek z 20 ng/ml TNF-α przez 44 godziny w porównaniu z przypadkiem bez TNF-α. Jak pokazano w Tabeli 5, echinakozyd (4, IC50=31,1 IM), akteozyd (5, 17,8 IM), izoaceteozyd (6, 22,7 IM), 20-acetyloakteozyd (8, 25,7 IM), tubulozyd A (10,23,2 µM) i cistantubulozyd B1 (11, 21,4 µM) hamowały spadek żywotności komórek, a ich aktywność była większa niż piperyny42,43 i sylibiny. Wymagania konstrukcyjneglikozydy fenyloetanoidowe for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 µM)]; i (5) wprowadzenie ugrupowania 20-O-acetylowego zmniejszyło aktywność (8 < 5,="" 22="">< 6).="" stwierdzono,="" że="" wymagania="" te="" są="" podobne="" do="" tych="" obserwowanych="" w="" poprzednim="" rozdziale="" dotyczącym="" hamującego="" wpływu="" na="" cytotoksyczność="" indukowaną="" przez="" d-galn="" w="" pierwotnych="" hodowanych="" mysich="">

Te wyniki badań in vitro sugerują następujące możliwe mechanizmy działania chroniącego wątrobę składników pędów:Cistanche tubulosa: (i) zmniejszenie cytotoksyczności indukowanej D-GalN (4-6, 8, 10, 22 i 23) oraz (ii) zmniejszenie cytotoksyczności indukowanej TNF-α (4-6, 8, 10 i 11) .

2.6. Ochronne działanie echinakozydu (4), akteozydu (5) i izoakteozydu (6) przeciwko uszkodzeniu wątroby indukowanemu przez myszy D-GalN/LPS i sposób ich działania

Na koniec zbadaliśmy wpływ zasadyglikozydy fenyloetanoidowe, echinakozyd (4), akteozyd (5) i izoakteozyd (6) na indukowane D-GalN/LPS uszkodzenie wątroby u myszy. Jak pokazano w tabelach 6 i 4-6, znacząco hamował wzrost sAST i sALT indukowane przez D-GalN/LPS u myszy w dawkach 25-100 mg/kg PO. Z drugiej strony, 4-6 nie wpływało na nadprodukcję TNF-α z makrofagów aktywowanych LPS. Ponadto 4–6 znacząco hamowało śmierć komórek L929 powodowaną przez TNF-α, co wskazuje na zmniejszenie wrażliwości komórek L929 na TNF-α (vide ante). Wyniki te sugerują, że 4–6 zmniejsza wrażliwość tych komórek na cytotoksyczność indukowaną TNF-α. Doniesiono o wielu związkach, które hamują śmierć komórek indukowaną przez D-GalN i wytwarzanie TNF-α,24,26,32, ale doniesiono o kilku związkach, które selektywnie zmniejszają wrażliwość hepatocytów na TNF-α.42,43,49,50

Podsumowując, ze świeżych łodygCistanche tubulosa, trzy noweglikozydy fenyloetanoidowe, kankanozydy H1 (1), H2 (2) i I (3) wraz z 16 znanymiglikozydy fenyloetanoidoweWyizolowano (4-19) i dwuacylowane oligocukry (20, 21). Wymagania strukturalne dla ich ochronnego wpływu na uszkodzenie hepatocytów indukowane przez D-GalN i cytoochronnego wpływu na komórki L929 wywołanego przez TNF-a były następujące; (1) część aglikonowa była niezbędna dla aktywności; (2) aglikon mający grupę 3,4-dihydroksylową wykazywał silniejszą aktywność niż ten mający grupę 4-hydroksylową; (3) ugrupowanie 60-ObD-glukopiranozylowe zmniejszało aktywność; (4) część 8-ObD-glukopiranozylowa mająca grupę 40-O-kafeoilowa wykazała silniejszą aktywność niż ta mająca grupę 60-O-kafeoilową; oraz (5) wprowadzenie {{27 }}Ugrupowanie O-acetylowe zmniejszyło aktywność.Ponadto, zasadniczyglikozydy fenyloetanoidowe, echinakozyd (4), akteozyd (5) i izoakteozyd (6) hamowały wzrost insAST i sALT w dawkach 25-100 mg/kg PO u myszy leczonych D-GalN/LPS i sugerowano, że te efekty hamujące są w zależności od zmniejszonej wrażliwości hepatocytów na TNF-α. Szczegółowe mechanizmy działaniaglikozydy fenyloetanoidowepowinny być dalej badane.

3. Eksperymentalne

3.1. Ogólny

Do uzyskania danych spektralnych i fizycznych wykorzystano następujące przyrządy: obroty właściwe, polarymetr cyfrowy Horiba SEPA-300(l=5 cm); widma UV, spektrometr Shimadzu UV-1600; Widma IR, spektrometr Shimadzu FTIR-8100; Widma 1H i 13C NMR, spektrometry JEOLJNM-ECA600 (600 i 150 MHz) i JEOL JNM-ECS400 (400 i 100 Hz) z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym; FABMS i wysokiej rozdzielczości FABMS, spektrometr mas JEOL JMS-SX 102A; Detektor HPLC, Shimadzu RID-10Wskaźnik załamania światła, Shimadzu SPD-10A UV-vis i Shodex OR-2 optyczne detektory rotacji. Do celów analitycznych i preparatywnych zastosowano kolumny HPLC, kolumny Cosmosil 5C18-MS-II i pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm id) i (250 - 20 mm id).

Do chromatografii zastosowano następujące warunki eksperymentalne: chromatografia kolumnowa na żelu krzemionkowym w normalnej fazie (CC), żel krzemionkowy 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, siatka 63-210, sferyczna, neutralna). ); żel krzemionkowy CC z odwróconą fazą, Diaion HP-20 (NipponRensui) i Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100-200 mesh); TLC w normalnych fazach, wstępnie powlekane płytki TLC z żelem krzemionkowym 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC z odwróconą fazą, wstępnie powlekane płytki TLC żelem krzemionkowym RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC z odwróconą fazą, wstępnie powlekane płytki TLC z żelem krzemionkowym RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm), detekcję osiągnięto przez spryskanie 1% Ce(SO4)2–10% wodnym roztworem H2SO4, a następnie ogrzewanie .

3.2. Materiał roślinny

Świeże łodygiCistanche tubulosauprawiane w Urumqi, prowincja Xinjiang, Chiny zostały zebrane we wrześniu 2007 r. Materiał roślinny został zidentyfikowany przez jednego z autorów (MY). Kupon na materiał roślinny znajduje się w naszym laboratorium.

3.3. Ekstrakcja i izolacja

Świeże łodygiCistanche tubulosa(2,98 kg) drobno pocięto i trzykrotnie ekstrahowano metanolem we wrzeniu przez 3 godziny. Odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem dało ekstrakt metanolowy (249,1 g, 8,36 procent). Ekstrakt metanolowy poddano działaniu Diaion HP 20 CC (5,0 kg, H2O?MeOH) otrzymując frakcje eluowane H2O- i MeOH (167,84 g, 5,63 procent i 81,21 g, 2,73 procent , odpowiednio). Frakcję eluowaną MeOH (61,00 g) poddano normalnej fazie żelu krzemionkowego CC[1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48}) }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH], aby otrzymać siedem frakcji [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) i 7 (4,6 0 g)]. Frakcję 2 (9,56 g) rozdzielono żelem krzemionkowym z odwróconą fazą CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?aceton], otrzymując pięć frakcji [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) i 2–5 (31,9 mg)]. Frakcję 2–3 (1.00 g) poddano HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (7:93, v/ v)] dać siedem ułamków [ks. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20,4 mg), 2–3–3 (26,0 mg), 2–3–4 (136,6 mg), 2-3-5 (38{{300}},6 mg), 2-3-7 (84,9 mg)]. Frakcję 2–3–4 (106,6 mg) oczyszczono dalej metodą HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1% wodny AcOH (5:95, v/v)], otrzymując salidrozyd (19,13,7 mg, {{340}}.0{{409}}27 procent). Frakcję 4 (10,69 g) oddzielono za pomocą żelu krzemionkowego z odwróconą fazą CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?aceton], otrzymując cztery frakcje [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7,06 g), 4–3 (1,57 g) i 4–4 (792,8 mg)]. Frakcję 4–2(1,5{{56{0}} g) poddano HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (2{{57{{586}) }}}:80, v/v)], aby dać pięć ułamków {Fr. 4–2–1 (42,9 mg), 4–2–2 [= kamneozyd I (17, 67,0 mg, 00,014 procent)], 4–2– 3 [= akteozyd (5, 1,21 g, 0,26 procent)], 4–2–4 (41,6 mg) i 4–2–5 (181,3 mg)}. Frakcję 4–2–4 (41,6 mg) oczyszczono dalej metodą HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% wodny roztwór AcOH (18:82, v/v)], uzyskując izoakteozyd (6, 19,1 mg, 0,0040%) i cis-akteozyd (7,3,4 mg, 0,0007 procent). Frakcję 4-3 (1,57 g) oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (20:80, v/v)], otrzymując 11 frakcji [Fr. 4-3-1 (30,4 mg), 4-3-2 (55,2 mg), 4-3-3 (= 17,22,1 mg, 0,0010 procent), 4-3-4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 procent ), 4-3-5 (27,4 mg), 4-3-6 (43,6 mg), 4-3-7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 procent), 4-3 -8 [= syringalid A 30-OaL-ramnopiranozyd (16, 37,6 mg, 0,0017 procent)], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetyloakteozyd (8, 85,4 mg, 0,0038 procent)] oraz 4–3–11 (64,6 mg)]. Frakcję 4–3–6 (43,6 mg) oczyszczono dalej metodą HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% wodny AcOH (18:82, v/v)], otrzymując kankanozydy H1 (1, 17,0 mg, 0,0008%). i H2 (2,3,3 mg, 0,0001 procent). Frakcję 4–3–9 (39,8 mg) oczyszczono dalej metodą HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% wodny roztwór AcOH (18:82, v/v)] otrzymując kankanozyd I (3, 15,4 mg, 0,0007 procent ) i 6 ( 3,1 mg, 0,0001 procent). siedem frakcji [ks. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) i 5 –7 (130,1 mg)]. Frakcję 5-1 (870,2 mg) oczyszczono metodą HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN–1% wodny AcOH (5:95, v/v)], otrzymując lakteozyd decaffeoy (9, 5,1 mg, 0,0002 procent) i cistanozyd F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 procent). Frakcję 5–3 (3,72 g) oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (15:85, v/v)], otrzymując sześć frakcji [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanoza (21, 9,4 mg, 0,0004 procent)], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3 mg), 5–3–5 [= strona echinako (4, 2,54 g, 0,11 procent) i 5–3–6 (318,5 mg)]. Frakcję 5-3-4 (72,3 mg) dalej oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1% wodny AcOH (10:90, v/v)], otrzymując kamneozyd II (18,10,6 mg, 0,0005%). Frakcję 5-4 (979,9 mg) oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (15:85, v/v)] do podanych frakcji [Fr. 5-4-1 (28,6 mg), 5-4-2 (90,5 mg), 5-4-3 (99,7 mg), 5-4-4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 procent), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 procent) i5– 4-9 (134,7 mg)]. Frakcję 5–4–6 (318,5 mg) oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% wodny roztwór AcOH (15:85, v/v)] otrzymując cistantubulozydy B1 (11, 44,9 mg, 0,0020%), B2 (12 7,6 mg 0,0003 procent) oraz A (15 21,1 mg 0,0009 procent) i wiedemanninozyd C (14 17,2 mg 0,0008 procent). Frakcję 5-5 (1,19 g) oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (18:82, v/v)], otrzymując tubulozyd A (10 300,3 mg, 0,013 proc.) i arenariozyd (13,5,8 mg, 0,0006 proc.). Frakcję 6 (12,52 g) rozdzielono na żelu krzemionkowym CC z odwróconą fazą [600 g, MeOH–H2O (20:80 — 30:70, v/v) — MeOH — aceton], otrzymując cztery frakcje [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) i 6–4 (17,8 mg)]. Frakcję 6–2 (500,0 mg) oczyszczono metodą HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% wodny AcOH (25:75, v/v)], otrzymując 4 (353,1 mg, 0,34%). ).

3.3.1. Kankanozyd H1 (1)

Biały proszek, ½a- 24D -45,3 (c 1,06, MeOH). FABMS o wysokiej rozdzielczości z jonami dodatnimi: obliczono dla C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Znaleziono: 835,2633. UV [MeOH, nm (loge)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: podano w Tabeli 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: podano w Tabeli 3. Jon dodatni FABMS:m/z 835 (M plus Na) plus. FABMS z jonami ujemnymi: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) Biały proszek, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS o wysokiej rozdzielczości z jonami dodatnimi: obliczono dla C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Znaleziono: 835,2644. UV [MeOH, nm (loge)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: podano w Tabeli 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: podano w Tabeli 3. FABMS z jonami dodatnimi: m/z 835 (M plus Na) plus FABMS z jonami ujemnymi : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Biały proszek, ½a-25D-62,2 (c 1.00, MeOH). FABMS o wysokiej rozdzielczości z jonami dodatnimi: obliczono dla C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Znaleziono: 777,2585. UV [MeOH, nm (loge)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: podano w Tabeli 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: podano w Tabeli 3. Jon dodatni FABMS:m/z 777 (M plus Na) plus. FABMS z jonami ujemnymi: m/z 753 (MH)-.

3.4. Hydroliza zasadowa i kwasowa 1–3

Roztwory 1, 2 i 3 (każdy 1,5 mg) w 5% wodnym roztworze wodorotlenku potasu (KOH, 00,5 ml) mieszano w 40 stopniu przez 1 godzinę. Każdy roztwór zobojętniono Dowex HCR W2 (postać H plus), a żywice usunięto przez filtrację. Odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem dało odpowiednie produkty deacylowane, które poddano analizie HPLC [kolumna: Cosmosil pNAP,250 - 4,6 mm śr.; faza ruchoma: CH3CN–1% wodny AcOH (15:85, v/v); detekcja: UV (254 nm); szybkość przepływu: 1.0 ml/min] należy zidentyfikować jako kwas trans-kafeinowy (tR 9,9 min od 3), kwas trans-p-kumarowy (tR 17,1 min od 1) i kwas cis-p-kumarowy (tR17,8 min od 2). Następnie każdy z nich rozpuszczono w 1.0MHCl (1.0ml) i ogrzewano w 80°C przez 3 godziny. Po schłodzeniu mieszaninę reakcyjną zobojętniono Amberlite IRA-400 (postać OH), a żywice usunięto przez filtrację. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość oddzielono na kolumnie z wkładami Sep-Pak C18 (H2O·MeOH). Frakcję eluowaną H2O poddano analizie HPLC w następujących warunkach: kolumna HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, średnica wewnętrzna 4,6 mm - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokio, Japonia); wykrywanie, rotacja optyczna [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokio, Japonia); faza ruchoma,CH3CN–H2O (85:15, v/v); szybkość przepływu 0,8 ml/min]. Identyfikację L-ramnozy (i) i D-glukozy (ii) uwolnionych z 1, 2 lub 3 frakcji eluowanej H2O przeprowadzono porównując ich czasy retencji i skręcalność optyczną z rzeczywistymi próbkami [i,tR 9,9 min (ujemny)] oraz [ii, tR 17,9 min (dodatni)].

3.5. Test biologiczny

3.5.1. Odczynniki

LPS (z Salmonella enteritidis), minimalna podstawowa pożywka (MEM) i pożywka William's E zakupiono z Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA); płodowa surowica bydlęca (FBS) pochodziła z firmy Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); a inne chemikalia pochodziły z firmy Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japonia). 96-Mikropłytki dołkowe zakupiono od Sumitomo Bakelite Co.,Ltd (Tokio, Japonia).

3.5.2. Zwierząt

Samce myszy ddY zakupiono od Kiwa Laboratory Animal Co., Ltd, (Wakayama, Japonia). Zwierzęta trzymano w stałej temperaturze 23 ± 2°C i karmiono standardową karmą laboratoryjną (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokio, Japonia). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na przytomnych myszach, o ile nie zaznaczono inaczej. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Doświadczalny Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Kinki.

3.5.3. Ochronne działanie u myszy z uszkodzeniem wątroby wywołanym D-GalN/LPS

Metoda opisana przez Tiegsa i wsp.51 została zmodyfikowana i zastosowana w tym eksperymencie. W skrócie, samce myszy ddY ważące około 25-30 g pościły przez 20 godzin przed eksperymentem. D-GalN (350 mg/kg) i LPS (10 μg/kg) rozpuszczone w soli fizjologicznej wstrzykiwano dootrzewnowo w celu wywołania uszkodzenia wątroby. Każdą badaną próbkę podawano doustnie 1 godzinę przed wstrzyknięciem D-GalN/LPS. Próbki krwi pobrano z podoczodołowego splotu żylnego 10 godzin po wstrzyknięciu D-GalN/LPS. Poziomy sAST i sALT oznaczano metodą Reitmana-Frankela (komercyjny zestaw Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Jako związek odniesienia zastosowano hydrokortyzon. Próbki do badań zawieszono w 5% roztworze gumy arabskiej i roztwór podawano doustnie w ilości 10 ml/kg w każdym eksperymencie, podczas gdy nośnik podawano doustnie w ilości 10 ml/kg w odpowiedniej grupie kontrolnej.

3.5.4. Ochronny wpływ na cytotoksyczność indukowaną przez pierwotne hodowane hepatocyty myszy D-GalN

Działanie hepatoprotekcyjne składników zostało określone przez {{0}}(4,5-dimetylotiazol-2-il)-2,5-difenylotetrazoliowy bromek (MTT ) test kolorymetryczny z użyciem pierwotnych hodowanych mysich hepatocytów.33–43 Hepatocyty wyizolowano z myszy maleddY (30–35 g) metodą perfuzji kolagenazy. Zawiesinę komórek w 4 - 104 komórkach w 100 µl pożywki William's E zawierającej FBS (10 procent), penicylinę G (100 jednostek/ml) i streptomycynę (100 µg/ml) zaszczepiono w 96-dołkowej mikropłytce i hodowano wstępnie przez 4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Do pożywki dodano 100 µl świeżej pożywki zawierającej D-GalN (2 mM) z lub bez próbki testowej i hepatocyty hodowano przez 44 godziny. Pożywkę wymieniono na 100 µl świeżej pożywki i do pożywki dodano 10 µl MTT [5 mg/ml w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)]. Po 4 godzinach inkubacji pożywkę usunięto, a następnie dodano 100 µl izopropanolu zawierającego 0,04 M HCl w celu rozpuszczenia formazanu wytworzonego w komórkach. Gęstość optyczną (OD) roztworu formazanu mierzono czytnikiem mikropłytek przy 570 nm (odniesienie: 655 nm). Hamowanie (w procentach) otrzymano według następującego wzoru.

Hamowanie ( procent )= [(OD(próbka) - OD(kontrola))/(OD(normalna)-OD(kontrola))] x 100

3.5.5. Wpływ na wytwarzanie NO w makrofagach otrzewnowych myszy stymulowanych LPS

Test przesiewowy pod kątem wytwarzania NO z użyciem mysich makrofagów otrzewnowych indukowanych TGC przeprowadzono jak opisano wcześniej.43,46,

3.5.6. Wpływ na wytwarzanie TNF-α w mysich makrofagach otrzewnowych stymulowanych przez LPS

TNF-α uwalniany w pożywce oznaczano jak opisano wcześniej28 z niewielką modyfikacją. W skrócie, mysie makrofagi otrzewnowe indukowane TGC (5 - 105 komórki/studzienkę) pobrano z jam otrzewnowych samców myszy ddY, zawieszono w 100 ul RPMI 1640 uzupełnionej 5% FBS, penicyliną (100 jednostek/ ml) i streptomycynę (100 ?g/ml) i wstępnie hodowano w 96-studzienkowych mikropłytkach w temperaturze 37 stopni w 5% CO2 w powietrzu przez 1 godzinę. Nieprzylegające komórki usunięto przez przemycie PBS i dodano 100 µl świeżej pożywki zawierającej różne stężenia badanego związku. Po 10 minutach dodano 100 µl pożywki zawierającej 10 µg/ml LPS i inkubowano przez 4 godziny. Wytwarzanie TNF-α w każdym dołku określano przy użyciu zestawu ELISA (zestaw Mouse TNF-α ELISA, Invitrogen). Każdy badany związek rozpuszczono w DMSO, a roztwór dodano do pożywki (końcowe stężenie DMSO 0,5%)

3.5.7. Hamujący wpływ na indukowaną przez TNF-a śmierć komórek w komórkach L929

Komórki L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japonia) utrzymywano w podłożu Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma-Aldrich) zawierającym 10 procent FBS, 1 procent aminokwasów nieistotnych MEM (Invitrogen), penicylinę G (100 jednostek) /ml) i streptomycynę (100 μg/ml) w 37°C w atmosferze 5% CO2. Komórki zaszczepiono w 96-studzienkowej płytce do hodowli tkankowej [3 -104komórki/studzienkę w 100 µl/studzienkę w MEM]. Po 44 godzinach inkubacji w pożywce TNF-α (20 ng/ml) z lub bez próbki testowej, żywotność komórek oceniano za pomocą testu kolorymetrycznego MTT (videante).49,50 Każdy testowany związek rozpuszczono w DMSO i roztwór dodano do pożywki (stężenie końcowe w DMSO0,5%).

3.6. Statystyka

Wartości wyrażono jako średnie ± SEM Do analizy statystycznej zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test Dunnetta. Wartości prawdopodobieństwa (p) mniejsze niż 00,05 uznano za znaczące.

Podziękowanie

TM, KN i OM uzyskały wsparcie z Grantu na badania naukowe z projektu „Centrum Badań Zaawansowanych Technologii” dla Uczelni Prywatnych: dotacja do funduszu komplementarnego z Grantu na badania naukowe Ministerstwa Edukacji, Kultury , Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan, 2007–2011, a także wspierany przez Grant-in-Aid na badania naukowe z MEXT. MY i HM były wspierane przez 21st COE Program, Academic Frontier Project oraz Grant-in-Aid na badania naukowe z MEX

Od: „Acylowany”fenyletanoidoligoglikozydy o działaniu hepatoprotekcyjnym z rośliny pustynnejCistanche tubulosa' za pomocąToshio Morikawa i inni

---Chemia bioorganiczna i lecznicza 18 (2010) 1882-1890.