Szczepionka adenowirusowa zawierająca skróconą podjednostkę S1 białka SARS-CoV-2 wywołującą specyficzną odpowiedź immunologiczną u myszy

StreszczenieCT:Opracowanie skutecznej i bezpiecznej szczepionki przeciwko koronawirusowi 2019 (COVID-19) stanowi kluczowe podejście do zarządzania pandemią ostrej choroby układu oddechowego 2 (SARS-CoV-2) w świetle obecnych warunków. W tym badaniu wytworzyliśmy skrócony segment zoptymalizowanego genu szczytowego SARS-CoV-2 (2043 bp, określanego jako S1), który był w stanie kodować skrócone białko S1. Białko przetestowano, aby określić, czy może wywołać skuteczną immunizację myszy przeciwko SARS-CoV-2. Obecność białka S1 potwierdzono metodą immunofluorescencji i Western blot. Szczepionkę adenowirusową zawierającą fragment genu S1 (Ad-S1) podawano myszom domięśniowo cztery razy w ciągu 4 tygodni. U wszystkich immunizowanych myszy wykazano odporność humoralną na SARS-CoV-2 na białko S1. Surowica immunizowanych myszy wykazała doskonałe działanie przeciwinfekcyjne in vitro. U myszy po szczepieniu Ad-S1 zaobserwowano silną humoralną odpowiedź immunologiczną przeciwko SARS-CoV-2, co sugeruje, że szczepionka adenowirusowa może pomóc w opracowaniu szczepionek przeciwko SARS-CoV-2 i innym genetycznie odrębnym wirusy.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Słowa kluczowe: SARS-CoV-2; szczepionki; wektor adenowirusowy; gen S1; odporność

1. Wstęp

Choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19) często wiąże się z niewydolnością wielonarządową i wysoką śmiertelnością [1] i stanowi poważne zagrożenie dla bezpieczeństwa publicznego na całym świecie. Według stanu na 15 lipca 2022 r. pandemia COVID-19 utrzymuje się na całym świecie, a Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) zgłoszono 557 917 904 potwierdzonych przypadków, w tym 6 358 899 zgonów. Co więcej, do dnia 11 lipca 2022 r. podano łącznie 12 130 881 147 dawek szczepionki. Dlatego projektowanie i opracowywanie nowych szczepionek przeciwko koronawirusowi (nCoV) ma ogromne znaczenie i jeden z głównych priorytetów zdrowotnych na świecie. Białko S jest kluczowym czynnikiem przedostawania się wirusa SARS-CoV-2 ostrej choroby układu oddechowego 2 (SARS-CoV-2) do komórek gospodarza [2,3]. Białko wiąże się z receptorem gospodarza i umożliwia wirusowi sprawne przedostanie się do komórki gospodarza [4]. N-glikany wystają z powierzchni trimeru i intensywnie ozdabiają białko S, wpływając na fałdowanie białka S, odporność humoralną i przetwarzanie proteazy komórki gospodarza [5]. Białko S SARS-CoV-2 ma niższą gęstość glikanu z wiązaniem N niż inne białka S indukowane ludzkim patogennym koronawirusem [6]. Dlatego białko S może być wysoce immunogenne i jest głównym celem przeciwciał neutralizujących. Białko S ma trzy domeny strukturalne, spośród których domena S1 jest najważniejszym antygenem powierzchniowym białka S [4]. Ze względu na trudność w produkcji dużych białek rekombinowanych (domena zewnątrzkomórkowa białka S składa się z około 1300 aminokwasów) i ryzyko wzmocnienia zakażenia zależnego od przeciwciał (ADE), S1 (około 700 aminokwasów) i jego domena wiążąca receptor (RBD, około 200 aminokwasów) są powszechnie uważane za najbardziej atrakcyjne potencjalne cele szczepionki przeciwko koronawirusowi [7,8]. Ludzki adenowirus serotyp 5 (HAdV-C5) jest szeroko stosowany w podstawowej wirusologii jako wektor do terapii genowej i dostarczania szczepionek [9]. HAdV-C5 charakteryzuje się naturalną różnorodnością i może pasożytować na większości żywicieli, co stanowi podstawę do rozwoju eksperymentów na zwierzętach. Rekombinowane wektory adenowirusowe z defektami replikacji i replikacji, skonstruowane z HAdV-C5, są szeroko stosowane w dostarczaniu szczepionek i terapii genowej [9,10]. Obecnie adenowirusy zostały zatwierdzone jako szczepionki przeciwko ostrym infekcjom dróg oddechowych i przeprowadzono wiele prób takich szczepionek, np. przeciwko malarii i HIV-1 [9]. W tym artykule opisujemy szczepionkę wektorową adenowirusa ludzkiego SARS-CoV-2 z niedoborem replikacji oraz jej przygotowanie i zastosowanie. W tym badaniu szczepionkę adenowirusową skonstruowano w następujący sposób: wektorem był ludzki adenowirus HAdV-C5 z defektem replikacji z delecją E1 i E3, plazmid szkieletowy był rekombinowanym adenowirusem z pBHGlox∆E1,3Cre, pakującą linią komórkową były komórki HEK293, a genem docelowym był skrócony gen białka S1 wirusa SARS-CoV-2. Ekspresję białka S1 w szczepionce zidentyfikowano za pomocą testów Western blot i immunofluorescencyjnych. Aby określić jakość odpowiedzi immunologicznych wywołanych przez kandydatów na szczepionki zawierające kolce, szczegółowo zbadano odpowiedź przeciwciał po szczepieniu. Korzyści immunologiczne szczepionki oceniano za pomocą testu przeciwciał wiążących (test immunoenzymatyczny [ELISA]) i testu przeciwciał neutralizujących. Nasze odkrycia stanowią podstawę do opracowania i oceny-19 szczepionek i metod leczenia Covid-19 opartych na białku S1.

2. Materiały i metoda

2.1. Komórki i zwierzęta

W tym badaniu wykorzystano linie komórkowe nerki małpy HEK293 i Vero E6. Obie linie komórkowe hodowano w pożywce Eagle'a modyfikowanej Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną i streptomycyną w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2 i nasyconej wilgotności. Dwadzieścia samic myszy C57BL/6 (6–8 tygodni) zakupiono w Zhejiang Animal Experimental Center w prowincji Zhejiang. Myszy losowo podzielono na dwie grupy po 10 myszy w każdej grupie. Jedną grupę immunizowano (100 µl wstrzyknięcie dootrzewnowe) wektorem Ad5 wyrażającym białko szczytowe SARS-CoV-2 (Ad5-S), a drugą PBS (100 µl wstrzyknięcie dootrzewnowe) jako kontrolę. Całkowita ilość wirusa wynosiła 5 × 109 VP. Wszystkie myszy immunizowano domięśniowym zastrzykiem D0/D14 [11,12]. W dniu 14 pobrano krew obwodową w ilości 100 µl, oddzielono surowicę i podano drugi zastrzyk dwie godziny po pobraniu krwi. W dniu 28 pobrano krew poprzez nakłucie pozaoczodołowe i oddzielono surowicę. Przeciwciała wiążące wykrywano 3 dni po każdym pobraniu krwi, przeciwciała neutralizujące wykrywano 7 dni po każdym pobraniu krwi, a cytokiny wykrywano 7 dni po drugim pobraniu krwi. Wszystkie myszy uśmiercono; wszystkie testy przeprowadzono ściśle według „Wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami doświadczalnymi i ich wykorzystywania w Chińskiej Republice Ludowej” i zatwierdzono przez Radę Etyczną Uniwersytetu Zhejiang Shuren.

2.2. Szczepionki

Wszystkie szczepy SARS-CoV-2 użyte w tym badaniu pobrano od pacjentów z COVID-19 za ich zgodą. Państwowe Kluczowe Laboratorium Diagnostyki i Leczenia Chorób Zakaźnych opracowało szczepionkę adenowirusową (komórka Vero, szczep WuHan, numer GISAID: EPI_ISL_415711) przeciwko SARS-CoV-2, a następnie szczepionka została wyprodukowana w warunkach zgodnych z poziomem bezpieczeństwa biologicznego (BSL). Specyfikacja szczepionki wynosi 0,5 ml/dawkę i zawiera Tris, NaCl, cukier trzcinowy, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, etanol absolutny i białko SARS-CoV-2 S1.

2.3. Konstrukcja rekombinowanego adenowirusa

Sekwencję białka S1 SARS-CoV-2 (nr QRU91950.1) uzyskano z PubMed. Zgodnie z degeneracją genu, zoptymalizowaną sekwencję nukleotydową kodonu odpowiednią do ekspresji w komórkach ssaków zaprojektowano w oparciu o założenie, że sekwencja aminokwasów białka produktu kodowanego przez białko SARS-CoV-2 S1 pozostała niezmieniona. Całkowita długość wynosiła 2043 pz. Sekwencję prekursorową 50 zsyntetyzowano za pomocą tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA), a sekwencję kodującą aminokwas 2–688 SARS-CoV-2 S1 i sekwencję prekursorową tPA zligowano. Sekwencję Kozaka i miejsce restrykcyjne SpeI dodano przed kodonem start, a miejsce restrykcyjne XbaI dodano za kodonem terminacyjnym. Sekwencje nukleotydowe powyższych genów zsyntetyzowano i wklonowano do pUC18 przez Sangon Biotech w celu otrzymania sklonowanego plazmidu syntetycznego genu. Zsyntetyzowaną sekwencję genu S1 i wektor pDC316 trawiono endonukleazami restrykcyjnymi SpeI i XbaI. Docelowy fragment i wektor odzyskano z żelu i połączono, tworząc plazmid wahadłowy. Plazmid wahadłowy SARS-CoV-2 upakowano z plazmidem szkieletowym układu adenowirusa AdMax pBHGloxd∆E1 i 3Cre poprzez kotransfekcję komórek HEK293. Pierwotny roztwór wirusa otrzymano po wielokrotnym zamrażaniu, rozmrażaniu i wirowaniu, a wirus amplifikowano i hodowano po oczyszczeniu łysinek.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Oznaczanie miana adenowirusa

Wybrano zdrowe komórki HEK293 i ponownie zawieszono, aby przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 5,0 × 105 komórek/ml, którą wysiano na płytkę 24-studzienkową (1 ml/studzienkę ) i hodowano w temperaturze 37 ◦C w środowisku 5% CO2. Próbkę seryjnie rozcieńczono dziesięciokrotnie, a rozcieńczoną próbkę (0,1 ml) złożoną z 10-5 do 10-8 komórek zaszczepiono na płytce z 24-studzienkami . Następnie płytki poddano infekcji w temperaturze 37°C w 5% CO2 przez 48 godzin. Następnie usunięto podłoże hodowlane, dodano wstępnie schłodzony metanol (0,5 ml) i próbki utrwalano w temperaturze -20°C przez 20 minut. Po utrwaleniu próbki przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i blokowano 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, 0,2 ml) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie dodano przeciwciała pierwotne (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) i wtórne (Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) przeciwciała i inkubowano przez 1 godzinę, podczas czego PBS służył do prania. Po inkubacji dodano nowo przygotowany roztwór roboczy (0,2 ml) i inkubowano przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór roboczy odrzucono, próbki przemyto PBS i ponownie dodano PBS (1 ml). Obliczono średnią liczbę komórek dodatnich w polu mikroskopowym (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), gdzie wybrano gradient z 5–50 dodatnimi komórkami w polu widzenia i losowo wybrano co najmniej pięć obszarów do zliczenia . Obliczono liczbę pól widzenia w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Następnie obliczono miano wirusa według następującego wzoru (1):

2.5. PCR w czasie rzeczywistym

Aby wykryć ekspresję mRNA komórki HEK293 po infekcji wirusowej, wyekstrahowaliśmy pośredni RNA zgodnie z instrukcją obsługi TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu TRIzolu i poddano obróbce DNazą I wolną od RNazy RQ1 (Promega, Madison, WI, USA) w celu wyeliminowania pozostałości DNA. Komplementarny DNA (cDNA) uzyskano poprzez odwrotną transkrypcję wyekstrahowanego RNA przy użyciu zestawu odczynników PrimerScript™ RT z zestawem gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Japonia). Fragmenty DNA wygenerowano ze specyficznymi starterami P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30 ) i P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGTCAAGTG-30) ​​genu docelowego (S1). Gen amplifikowano ze starterami P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) i P4 ({{14}TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) jako kontrolą wewnętrzną (GAPHD).

2.6. Western Blot

Lizat komórkowy i supernatant rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF). Bloty wizualizowano za pomocą sprzętu do obrazowania Western blot (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA). W skrócie, membrany przeniesiono do TBST (50 ml Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 ml], 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween -20) z 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku i wytrząsany na wytrząsarce odbarwiającej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Błony grupy doświadczalnej i kontrolnej usunięto z roztworu uszczelniającego i inkubowano z przeciwciałem pierwszorzędowym: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kat. #40591- T62, Sino Biological, Pekin, Chiny)] w temperaturze pokojowej. Pierwotne przeciwciała wytrząsano i inkubowano przez noc na wytrząsarce odbarwiającej w temperaturze 4°C. Blot przepłukano roztworem TBST i inkubowano przez 2 godziny z przeciwciałem wtórnym [kozia antykrólicza immunoglobulina G (IgG) H&L (HRP) (1:10 000, nr kat. ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Po płukaniu bloty inkubowano przez 1 minutę z zestawem roztworu LumiBest ECL Substrate (nr kat. 4AW011-100, 4A Biotech), a następnie obserwowano w kamerze obrazowej.

2.7. Test immunofluorescencyjny

Komórki HEK293 (3 × 106/studzienkę) wysiano na płytki z 12-studzienkami. Po 48 godzinach komórki zakażono adenowirusem zawierającym gen S1 (Ad-S1). Po 48 godzinach pożywkę odessano, komórki przemyto jednokrotnie PBS zawierającym 2% BSA i utrwalono przez 15 minut metanolem wstępnie schłodzonym przez 15 minut w temperaturze -20°C. Po trzech przemyciach 2% BSA w PBS komórki permeabilizowano 0,5% Triton X-100 przez 10 minut. Następnie komórki blokowano przez 1 godzinę 2 ml 2% BSA, roztwór blokujący odrzucono i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie do każdej studzienki dodano 2 ml przeciwciała pierwotnego [SARS-CoV-2 ({25}}nCoV) Spike Antibody (1:2000, nr kat.40591-T62, Sino Biological)] i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub 4°C przez noc. Następnie próbkę płukano trzykrotnie 2% BSA przez 5 minut na każde płukanie. Następnie do każdej studzienki dodano 2 ml przeciwciała drugorzędowego [kozie przeciwkrólicze IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, nr kat. 550037, ZenBio)] i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie próbki płukano trzykrotnie 2% BSA przez 5 minut na każde płukanie. Do każdej studzienki dodano roztwór 40,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, nr kat. S0001, Bioss, Woburn, MA, USA). i reagował przez 10 minut w ciemności. Analizę obserwowano za pomocą systemu obrazowania EVOS™ M7000 (nr kat. AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Białko S SARS-CoV-2 (1 µg/ml) powlekano przez noc w 96-płytkach dołkowych (100 µl/studzienkę) 0. 05 M bufor wodorowęglanowy. Po przemyciu PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween-20, dodać wodę do 1000 ml) pięć razy dodano roztwór blokujący i inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Próbkę surowicy rozcieńczono i dodano do każdej studzienki (100 µl/studzienkę). Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37°C próbki przemywano pięciokrotnie PBST. Dodano przeciwciało pierwotne [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, nr kat.40591-T62, Sino Biological)] i inkubowano przez 1 godzinę, następnie próbki przemyto pięciokrotnie PBST, a następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową [kozie anty-królicze IgG H&L (HRP) (1:10 000, nr kat. ab6721, abcam)] i pięć przemywa PBST. Po dodaniu 3, 30, 5 i 50-bezwodnika tetrametylobifenylu przez 5 minut, reakcję zatrzymano 2 M kwasem siarkowym. Gęstość optyczną mierzono przy 450 nm i 630 nm za pomocą instrumentu do znakowania enzymatycznego (Molecular Devices, SpectraMax 190), a następnie dopasowano do krzywej standardowej.

Korzyści z cistanche tubulosa-wzmocnić układ odpornościowy

2.9. Oznaczanie cytokin 

Płytkę (nr kat. T-k15048D-1, MSD) przemyto trzykrotnie 150 µl buforu do przemywania/studzienkę i do każdego dołka dodano 50 µl przygotowanej próbki. Następnie płytkę zamknięto przylepną uszczelką do płytek i inkubowano w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 2 godziny. Następnie płytkę przemyto trzykrotnie 150 µl buforu do przemywania/studzienkę i do każdego dołka dodano 25 µl roztworu przeciwciała detekcyjnego. Płytkę ponownie szczelnie zamknięto i inkubowano w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 2 godziny. Następnie płytkę przemyto trzykrotnie buforem do przemywania w ilości co najmniej 150 µl/studzienkę; Do każdej studzienki dodano 150 µl 2× Read Buffer T (MSD) i płytkę analizowano za pomocą aparatu MSD.

2.10. Przeciwciało neutralizujące

2.10.1. Test neutralizacji pseudowirusów

Aktywność neutralizacji surowicy myszy badano przy użyciu systemu pseudowirusowego wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Surowicę inaktywowano w łaźni wodnej przez {{0}},5 h w temperaturze 56°C, a następnie seryjnie rozcieńczano do wymaganego zakresu. Komórki HEK293 wysiano na płytkę z 96-studzienkami. Rozcieńczoną surowicę zmieszano z 200 CCID50 (dawka wirusa, która może zainfekować 50% hodowli komórkowej)/100 µl zawiesiny wirusa w stosunku 1:1 i umieszczono w inkubatorze CO2 (37 ± 1°C) na 2 godz. Następnie do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu podtrzymującego wirusa zawierającego 0,5% podwójnego przeciwciała penicylina-streptomycyna i zobojętnioną mieszaniną zaszczepiono płytkę 96-dołkową zawierającą komórki w ilości 100 µl na dołek, z dwoma powtórzeniami dołków każde rozcieńczenie. W tym samym czasie ustawiono normalną kontrolę komórek i komórki inkubowano w inkubatorze CO2 (37 ± 1°C) przez 96 godzin. Następnie 200 CCID50/100 µl roztworu wirusa rozcieńczono do 10-1~10-3. Pożywkę do hodowli komórkowej z płytki 96-odrzucono, do każdej studzienki dodano 150 µl roztworu podtrzymującego wirusa i zaszczepiono rozcieńczony roztwór wirusa w stężeniu 10-1~{{33} } do dołków płytki z 96-dołkami (50 µl na dołek). Każde rozcieńczenie powtórzono w 8 dołkach; w tym samym czasie ustawiono normalną kontrolę komórek, a następnie hodowlę przez 96 godzin. Zmiany w CPE komórek obserwowano pod odwróconym mikroskopem. Normalna kontrola komórkowa nie powinna wykazywać żadnych zmian cytopatycznych, a kontrola pozytywna powinna wykazywać zmiany CPE. Punkty końcowe neutralizacji (rozcieńczenia surowicy przeliczone na logarytmy) obliczono obserwując CPE. Kryterium seronegatywne/pozytywne wynosiło 1:12 jako kryterium pozytywne/negatywne,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Test neutralizacji na żywo

Aktywność neutralizującą surowicy myszy oceniano za pomocą testu neutralizacji na żywo. Rozcieńczoną surowicę zmieszano z SARS-CoV-2 i inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Mieszaninę dodano do płytki z 96-studzienkami w celu zakażenia komórek Vero E6. Po 72-godzinie inkubacji w temperaturze 37°C zaobserwowano efekt cytopatyczny wirusa (CPE) w powiększeniu × 40 i obliczono miano neutralizacji (odwrotność 50% rozcieńczenia surowicy wymaganego do zneutralizowania infekcji wirusem). Wszystkie powyższe procedury przeprowadzono w środowisku o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

2.11. Analiza statystyczna

Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu t dla dwóch próbek przy użyciu SPSS 26. Wartości p mniejsze lub równe 0,05 uznawano za istotne. Tendencję centralną mierzono za pomocą średniej geometrycznej miana (GMT).

3. Wyniki

3.1. Konstrukcja rekombinowanego adenowirusa

Otrzymano rekombinowany plazmid wahadłowy adenowirusa pAdeno-CMV-S1 z prawidłową insercją; jego schemat struktury pokazano na Figurze 1. Rekombinowany adenowirus zawierał genom HAdV-C5 pozbawiony regionu E1/E3. Schematyczny diagram rekombinowanego wektora adenowirusowego otrzymanego przez transfekcję plazmidem wahadłowym i plazmidem cytoszkieletu w komórkach HEK293 pokazano na Figurze 1.

3.2. Charakterystyka rekombinowanego adenowirusa

Rekombinowany plazmid zawierający docelowy gen zidentyfikowano metodą PCR (patrz Figura 2A dla wyników elektroforezy żelowej). To był powtarzany eksperyment. Sekwencjami starterów były MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag i S1-R acaataagtagggactgggtc, a sekwencjonowanie potwierdziło, że sekwencja była zgodna z projektem. Ekspresję SARS-CoV-2 S1 w komórkach wykryto metodą Western blot (ryc. 2B) i pośrednią immunofluorescencją (ryc. 2C). Zabarwienie prążka (~75 kDa) wykryto metodą Western blot i było ono zgodne z oczekiwaną pozycją prążka. Na poziomie transkrypcji ekspresję S1 in vitro wykryto metodą PT-PCR. Wyniki wykazały, że ekspresja mRNA S1 w komórkach HEK-293 była znacząco wyższa niż w grupie kontrolnej.

Rycina 1. Konstrukcja rekombinowanej szczepionki adenowirusowej i strategia eksperymentalna. (A) pAdeno-CMV-S1 jest rekombinowanym plazmidem wahadłowym adenowirusa zawierającym docelowy gen S1. pBHGlox∆E1,3Cre jest plazmidem szkieletowym adenowirusa. pBHGlox∆E1,3Cre i pAdeno-CMV-S1 ekstrahowano za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Pekin, Chiny). Dzień przed transfekcją komórki HEK293 pasażowano w kolbie do hodowli komórkowej o pojemności 25 cm2. Pożywką hodowlaną był DMEM zawierający 5% FBS bez antybiotyków. Drugiego dnia wyselekcjonowano 60–80% komórek i do komórek dodano roztwór do transfekcji. Po 7 dniach transfekcji komórki zeskrobano, odwirowano, supernatant odrzucono i komórki reanimowano PBS. Komórki wielokrotnie zamrażano i rozmrażano w temperaturach -80°C i 37°C. Po odwirowaniu supernatant zawierał roztwór pierwotnego wirusa. Rekombinowany szczep adenowirusa oczyszczono, amplifikowano i otrzymano po dalszej obróbce i oznaczono jako Ad-S1. Szczepionkę wstrzyknięto domięśniowo myszom w celu przeprowadzenia dalszych badań. (B) Przedstawiona skala czasowa immunizacji i pobrania krwi.

3.3. Miano adenowirusa

W tym eksperymencie obliczono średnio sześć pozytywnych komórek w pięciu polach mikroskopowych, a wirusa w dołku rozcieńczono 108 razy. W oparciu o wzór opisany w części Materiały i metody, miano adenowirusa wynosiło 4,74 × 1011 jednostek tworzących łysinki (pfu)/ml (Figura 2D).

3.4. Odporność komórkowa po szczepieniu

W okresie badania wystąpiły statystycznie istotne zmiany w cytokinach w surowicy (p mniejsze lub równe 0,05), co głównie wskazywało, że stężenie chemoatraktanta keratynocytów/onkogenu regulowanego ludzkim wzrostem (KC/GRO) było spadły, a stężenia IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } i TNF- wzrosły, podczas gdy stężenie IL-6 nie uległo istotnej zmianie (Rysunek 3).

Rycina 2. Identyfikacja rekombinowanego białka HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 i oznaczenie miana adenowirusa. (A) Wykrywanie metodą PCR rekombinowanego plazmidu z genem docelowym S1. (B) Wykrywanie SARS-CoV metodą Western blot-2. Komórki HEK293 o wykładniczym wzroście infekowano SARS-CoV-2 przez 48 godzin, następnie ekstrahowano białko komórkowe i rozdzielano metodą SDS-PAGE. Ekspresję SARS-CoV-2 potwierdzono metodą Western blot z kozim przeciwciałem przeciwko króliczym IgG. (C) Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek HEK-293 zakażonych Ad-S1 (zielony). Komórki wybarwiono kontrastowo 40,{22}}diamidyno- 2-fenyloindolem (DAPI) w celu wybarwienia jąder. Pasek skali 1000 µm. (D) Do pomiaru użyto testu łysinkowego. Mikrofotografie przedstawiające rozcieńczenia 10-5, 10-6, 10-7 i 10-8 (od lewej do prawej).

Rycina 3. Ad-S1 indukował zmienione poziomy cytokin typu 1/2, interferonów typu 1 i innych cytokin w osoczu. Wyniki mierzono poprzez pobranie krwi od myszy 7 dni po pierwszej immunizacji. Dane przedstawiono w postaci wykresów rozrzutu pudełkowego i wąsowego. Każde koło reprezentuje jedną osobę. Wartości p obliczono za pomocą testu t dla dwóch próbek.

3.5. Wykrywanie przeciwciał anty-SARS-CoV-2 S1 po immunizacji

Test ELISA ujawnił, że u myszy, którym wstrzyknięto pierwszy i drugi Ad-S1, występowały przeciwciała specyficzne dla SARS-CoV-2-, ale nie u myszy, którym wstrzyknięto kontrolny kapsyd adenowirusa lub roztwór PBS (Ad/PBS) (Rysunek 4A). Miana IgG wynoszące 1:210 i 1:212 wykryto u myszy zaszczepionych Ad-S1-dwa tygodnie po, odpowiednio, pierwszej i drugiej immunizacji. Miano rozcieńczenia w 28 dniu po szczepieniu (D28, GMT 2297,4) było 6,1-krotnie wyższe niż w dniu 14 (GMT 378,9).

Figura 4. Ad-S1 indukował wysokie miano przeciwciał (A) i aktywność neutralizującą (B, C) u myszy. (A) ELISA przeciwciał IgG swoistych dla SARS-CoV-2-od myszy immunizowanych Ad-S1-. (B) Analiza aktywności pseudowirusa w surowicy myszy immunizowanych Ad-S1-. (C) Analiza aktywności neutralizującej surowicy myszy immunizowanych Ad-S1-

3.6. Test przeciwciał neutralizujących

Prowokacja SARS-CoV-2 komórek Vero E6 umożliwiła wykrycie aktywności neutralizującej w immunizowanej surowicy myszy (ryc. 4B, C). Miana neutralizacji D14 i D28 komórek Vero E6 immunizowanych Ad-S1- przeciwko prowokacji żywym wirusem SARS-CoV{{10}} in vitro wynosiły odpowiednio 1:24,3 i 1:26,3. Test na pseudowirusa dał wyniki podobne do testu na żywym wirusie, z mianami neutralizacji do 1:28,1 i 1:29,6 odpowiednio w D14 i D28. Miano neutralizujące pseudowirusa D28 (GMT 769,0) było 2.7-krotnie wyższe niż miano D14 (GMT 283,7).

4. Dyskusja

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 do<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

W tym badaniu skonstruowaliśmy rekombinowaną szczepionkę adenowirusową SARS-CoV-2 zawierającą podjednostkę S1 SARS-CoV-2 i oznaczyliśmy ją Ad-S1. Podobnie jak CanSinoBIO, który został dopuszczony do obrotu [28], w tej szczepionce zastosowaliśmy HAdV-C5. Adenowirus jest szeroko stosowany w rekombinowanej terapii genowej oraz jako wektor szczepionki. Jednakże odsetek seropozytywnych genów HAdV-C5 w normalnej populacji wynosi aż 75–80% [29]. Oznacza to, że odporność przed przechowywaniem na wektory HAdV-C5 znacząco zmniejsza odporność wywołaną szczepionką. Opracowany na Uniwersytecie Oksfordzkim w Wielkiej Brytanii ChAdOx1 nCoV-19 wykorzystuje wektor adenowirusa szympansa, który dla kontrastu ma niższy odsetek seropozytywności u ludzi, a gdy jest pozytywny, zwykle wykazuje niższe miano przeciwciał w surowicy [30] . Dlatego też można zbadać wektory adenowirusowe, które mogą ominąć istniejącą wcześniej odporność, w celu zwiększenia skuteczności ochronnej szczepionki adenowirusowej. W niniejszym badaniu stan surowicy myszy przed i po immunizacji określono za pomocą testów ELISA i testów neutralizacji, co dostarczyło dowodów na odporność humoralną w przypadku kandydatów na szczepionki. Surowica wytworzona po domięśniowym wstrzyknięciu szczepionki myszom skutecznie chroniła komórki Vero E6 przed zakażeniem SARS-CoV-2 in vitro (ryc. 4). Wykryliśmy także silniejszą odpowiedź immunologiczną i lepszą ochronę u myszy po drugiej immunizacji (ryc. 4). Wyniki naszych eksperymentów są podobne do wyników eksperymentów głównego nurtu.

W miarę kontynuowania badań nad SARS-CoV-2 kilka badań wykazało, że burza cytokin wtórna do zakażenia SARS-CoV-2 może wpływać na produkcję limfocytów T, utrudniając pacjentom utrzymanie długotrwałej odporności na SARS-CoV-2 [31]. Dlatego konieczne jest ustalenie, czy Ad-S1 może indukować odporność za pośrednictwem komórek T u myszy. Nasze wyniki wykazały, że stężenia IFN i IL-12 wzrosły, a stężenia IL-4 spadły w grupie Ad-S1, co wskazuje, że przeżycie i wzrost komórek Th1 indukowane szczepionką u myszy. Wydzielanie IL-12, IL-10 i TNF- przez komórki Th1 nieznacznie wzrosło w grupie eksperymentalnej. Wyniki te wskazują, że Ad-S1 skutecznie indukował odpowiedź limfocytów T z tendencją Th1-u myszy [32]. Zwiększony poziom IL-5 wskazuje, że komórki Th2 również uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej i wywołują określone efekty. Stężenie KC/GRO w grupie eksperymentalnej było znacząco zmniejszone w porównaniu z grupą kontrolną PBS, co mogło wynikać ze zmniejszonej chemotaksji neutrofilów, która tłumiła odpowiedź zapalną i pozwalała na nieznaczną kontrolę skutków ubocznych szczepionki. Byłoby to bardziej korzystne dla osób z obniżoną odpornością, takich jak osoby starsze lub pacjenci poddawani chemioterapii. Li M. i in. [29] opracowali szczepionkę adenowirusową wykorzystującą Ad68 jako wektor. Wyniki pokazały, że aktywność neutralizującą SARS-CoV-2 in vivo można było wykryć w ciągu dwóch tygodni po domięśniowej immunizacji myszy BALB/c, a następnie nadal rosła, a miano przeciwciał neutralizujących (PRNT ID50) osiągnęło 957,3 o godz. tygodnie. Tymczasem w badaniu Liu J. i in. [33] opracowano szczepionki wykorzystujące AdC6 i AdC68 jako wektory; zarówno odpowiedzi przeciwciał wiążących, jak i neutralizujących po immunizacji wygenerowano 14 dni po dawce, z mianem IgG wynoszącym 7108 (średnie geometryczne miana, GMT; AdC6) i 5489 (GMT, AdC68). Miano neutralizacji 50 (NT50) w teście neutralizacji pseudowirusa wynosiło 125 (GMT, AdC6) i 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

W niniejszym badaniu myszy zaszczepione Ad-S1 miały miana IgG wynoszące 1:1010 i 1:122 wykryte w teście ELISA dwa tygodnie odpowiednio po pierwszej i drugiej immunizacji. Miano rozcieńczenia ad-s1 wynosiło 378,9 (GMT) po 14 dniach od zaszczepienia i 2297,4 (GMT) po 28 dniach od zaszczepienia. W teście przeciwciał neutralizujących komórki Vero E6 immunizowane Ad-S1 wykazały neutralizację 1:24,3 i 1:26,3 odpowiednio w D14 i D28 w stosunku do prowokacji żywym wirusem SARS-CoV-2 in vitro. Miana neutralizacji pseudowirusa w D14 i D28 wynosiły odpowiednio 283,7 (GMT) i 769,0 (GMT). Zatem szczepionka objęta tym badaniem była skuteczniejsza pod względem odpowiedzi immunologicznej w modelu mysim.

Ze względu na ograniczenia warunków eksperymentalnych nie wykonaliśmy analizy enzymatycznej plamki immunosorpcyjnej (ELISpot) komórek odpornościowych śledziony myszy doświadczalnych. Co więcej, nie można było przeprowadzić eksperymentów dotyczących ochrony przed atakiem SARS-CoV-2 na myszach ze względu na ograniczenia laboratorium ochrony fizycznej. Ustaliliśmy jednak, że szczepionka ma wysoką skuteczność w modelach mysich i może być stosowana jako idealny szczep rezerwowy. Ponadto immunogenność, bezpieczeństwo i skuteczność potencjalnych kandydatów na szczepionkę SARS-CoV-2 należy zbadać na dodatkowych modelach zwierzęcych (np. królikach, naczelnych, szopach, psach), ponieważ modele mysie mogą nie w pełni odzwierciedlać ludzkie mechanizmy immunologiczne cechy.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

5. Wnioski

Dane uzyskane z naszych badań przedklinicznych szczepionki adenowirusowej wykazały, że szczepionka charakteryzuje się wystarczającym bezpieczeństwem i skutecznością. Dlatego może być obiecującą i wykonalną szczepionką profilaktyczną przeciwko zakażeniu SARS-CoV-2.

Bibliografia

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; MA Dimopoulos Wgląd w cykl życiowy-2 SARS-CoV, patofizjologię i zracjonalizowane metody leczenia ukierunkowane na powikłania kliniczne-19 COVID. J. Biomed. Nauka. 2021, 28, 9. [Odn.Krzyż]

2. Pillay, gen miesiąca TS: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 nowe białko koronowe. J. Clin. Patol. 2020, 73, 366–369. [Odniesienie]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, Karolina Północna; Pahan, K. Regresja raka płuc u myszy przez donosowe podanie SARS-CoV-2 Spike S1. Nowotwory 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemia koronaawirusa: spostrzeżenia molekularne i strukturalne. J. Podstawowy mikrobiol. 2021, 61, 180–202. [Odniesienie]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Cechy strukturalne białka kolczastego wirusa SARS-CoV-2: Cele szczepień. Nauka życia. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Ściany, klimatyzacja; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, Floryda; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Tarcza glikanowa i maskowanie epitopu białka kolczastego wirusa koronowego obserwowane za pomocą mikroskopii krioelektronowej. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 jest lepszy od RBD jako antygen szczepionkowy podjednostki COVID-19. J. Med. Wirol. 2021, 93, 892–898. [Odniesienie]

8. Theoharides,TC; Conti, P. Uważaj na białko szczytowe SARS-CoV-2: jest ich więcej, niż się wydaje. J. Biol. Regul. Homeost. Agenci 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Zawieszony, T.; Lu, Z.; Tan, W. Odporność ogólnoustrojowa i śluzówkowa u myszy wywołana pojedynczą immunizacją szczepionkami opartymi na ludzkim adenowirusie typu 5 lub 41, niosącymi białko kolca wirusa bliskowschodniego zespołu oddechowego. Immunologia 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Najnowocześniejsza wektorologia ludzkiego adenowirusa w podejściu terapeutycznym. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [Odniesienie]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Skuteczność i bezpieczeństwo szczepionek przeciwko COVID-19: przegląd systematyczny. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [Odniesienie]

12. Voysey, M.; Clemensa, SAC; Madhi, SA; Weckx, Lyonia; Folegatti, premier; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnaba,SL; Bhorat, QE; i in. Bezpieczeństwo i skuteczność szczepionki ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) przeciwko SARS-CoV-2: tymczasowa analiza czterech randomizowanych, kontrolowanych badań przeprowadzonych w Brazylii, Republice Południowej Afryki i Wielkiej Brytanii. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Kieł, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analiza skuteczności ochronnej zatwierdzonych szczepionek przeciwko COVID-19 przeciwko różnym mutantom. Przód. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, Maryland; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, ÖF; i in. Skuteczność i bezpieczeństwo inaktywowanej szczepionki SARS-CoV-2 zawierającej cały wirion (CoronaVac): tymczasowe wyniki podwójnie ślepego, randomizowanego, kontrolowanego placebo badania fazy 3 przeprowadzonego w Turcji. Lancet 2021, 398, 213–222. [Odniesienie]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Bezpieczeństwo i immunogenność inaktywowanej szczepionki SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: Randomizowane, podwójnie ślepe, kontrolowane placebo badanie fazy 1/2. Zarażanie Lancetem. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; On, P.; Li, C.; Kieł, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; i in. Bezpieczeństwo i immunogenność rekombinowanej, tandemowej, powtarzalnej, dimerycznej szczepionki podjednostkowej na bazie RBD (ZF2001) przeciwko COVID-19 u dorosłych: dwa randomizowane, podwójnie ślepe, kontrolowane placebo badania fazy 1 i 2. Zarażanie Lancetem. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [Odniesienie]

17. Mallapaty, południowo-indyjska szczepionka DNA przeciwko wirusowi Covid-19 jest pierwszą na świecie szczepionką, której wkrótce będzie więcej. Natura 2021, 597, 161–162. [Odniesienie]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; i in. Cele odpowiedzi limfocytów T na koronaawirus SARS-CoV-2 u ludzi chorych na COVID-19 i osób nienarażonych. Komórka 2020, 181, 1489–1501.e1415. [Odniesienie]

19. Cao, Y.; Pod.; Guo, X.; Słońce, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; i in. Silne przeciwciała neutralizujące przeciwko SARS-CoV-2 zidentyfikowane na podstawie wysokowydajnego sekwencjonowania pojedynczych komórek komórek B rekonwalescencji pacjentów. Komórka 2020, 182, 73–84.e16. [Odniesienie]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Szczepionki: raport o stanie. Immunitet 2020, 52, 583–589. [Odniesienie]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; i in. Nowatorski skład szczepionki przeciwko SARS-CoV-19, zawierającej kombinację DNA i białek, zapewnia pełną ochronę makaków rezusów przed SARS-CoV-2. Pojawienie się. Zarażają mikroby. 2021, 10, 342–355. [Odniesienie]

22. Du, L.; Hej.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Białko kolczaste SARS-CoV – cel rozwoju szczepionek i środków terapeutycznych. Nat. Ks. Mikrobiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Długi, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. Skrócone na N-końcu białko nukleokapsydu SARS-CoV-2 jako lepszy marker serologiczny niż całe białko nukleokapsydu w ocenie immunogenności inaktywowanego SARS-CoV-2. J. Med. Wirol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Panowie, LE; Crawford, KHD; Starr, Tennessee; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Szczepionka SARS-CoV-2 mRNA-1273 wywołuje bardziej neutralizację skupioną na RBD, ale z szerszym wiązaniem przeciwciał w RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherera, EM; i in. Ocena odpowiedzi komórkowej i serologicznej na ostrą infekcję SARS-CoV-2 pokazuje funkcjonalne znaczenie domeny wiążącej receptor. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [Odniesienie]

26. On, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Domena wiążąca receptor białka kolczastego SARS-CoV indukuje bardzo silne przeciwciała neutralizujące: implikacje dla opracowania szczepionki podjednostkowej. Biochemia. Biofizyka. Rozdzielczość komuna. 2004, 324, 773–781. [Odniesienie]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fani.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; i in. Opracowywanie i stosowanie szczepionek zawierających wektory wirusowe podczas-19pandemii{1}}. Mikroorganizmy 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; i in. Immunogenność i bezpieczeństwo rekombinowanej szczepionki typu-5-wektorowego adenowirusa{-19 u zdrowych dorosłych w wieku 18 lat i starszych: randomizowane, podwójnie ślepe, kontrolowane placebo badanie fazy 2. Lancet 2020, 396, 479–488. [Odniesienie]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; i in. Jednodawkowa szczepionka szczepionką na bazie adenowirusa szympansa wywołuje trwałą i ochronną odporność przeciwko infekcji SARS-CoV-2. Przód. Immunol. 2021, 12, 697074. [Odn.Krzyż]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Opracowanie nowych wektorów szczepionek: wektory adenowirusowe szympansów. Szum. Szczepionki Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [Odniesienie]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Rolnik, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; i in. Utrata Bcl-6-wyrażających komórki pomocnicze pęcherzyków T i centra rozmnażania w przebiegu COVID-19. Komórka 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richtera, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- i IL-12 działają synergicznie, przekształcając Th17 wygenerowany in vivo w komórki Th1/Th17. EUR. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; Każdy.; Li, J.; Gao, P.; i in. Heterologiczne immunizacje pierwotne i przypominające wektorami adenowirusowymi szympansa wywołują silną i ochronną odporność na zakażenie SARS-CoV-2. Komórka Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]