Dostarczany drogą oddechową krótkołańcuchowy octan kwasu tłuszczowego zwiększa odporność przeciwwirusową podczas infekcji rinowirusem

Tło: 

Uważa się, że mikrobiota odgrywa główną rolę w regulacji odporności poprzez uwalnianie metabolitów immunomodulujących, takich jak krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA). Rinowirusy (RV) wywołują choroby górnych dróg oddechowych i przyspieszają zaostrzenia astmy i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc poprzez słabo poznane mechanizmy. Lokalne interakcje między SCFA a przeciwwirusowymi odpowiedziami immunologicznymi w drogach oddechowych nie były wcześniej badane.

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) to kwasy organiczne wytwarzane w wyniku fermentacji celulozy i innych włókien pokarmowych przez pożyteczne bakterie w jelitach. Badania wykazały, że SCFA mają istotny wpływ na układ odpornościowy człowieka.

Po pierwsze, SCFA mogą promować integralność bariery śluzówki jelit i wzmacniać funkcję bariery jelitowej. Bariera jelitowa jest pierwszą linią obrony chroniącą środowisko jelitowe. Jeśli bariera jelitowa jest uszkodzona, szkodliwe substancje mogą przedostać się do układu krwionośnego przez ścianę jelita, powodując stan zapalny i nieprawidłowy układ odpornościowy. Badania wykazały, że SCFA mogą wzmacniać integralność bariery jelitowej i zmniejszać ryzyko zapalenia jelit poprzez promowanie różnicowania i proliferacji komórek błony śluzowej, zwiększając grubość błony śluzowej i produkcję śluzu.

Po drugie, SCFA mają funkcję regulowania komórek odpornościowych. Badania wykazały, że SCFA mogą promować różnicowanie i proliferację komórek odpornościowych oraz regulować funkcję komórek odpornościowych. SCFA mogą również zmniejszać produkcję cytokin zapalnych i hamować aktywność komórek odpornościowych, chroniąc w ten sposób ludzki układ odpornościowy. Inne badania wykazały również, że SCFA mogą regulować funkcję komórek T, zwiększać funkcje autoimmunologiczne i odgrywać pewną rolę w zapobieganiu i leczeniu chorób autoimmunologicznych.

Krótko mówiąc, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe odgrywają ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu odpornościowego człowieka. Powinniśmy zwrócić uwagę na rozsądną kombinację struktury diety, bogatej w błonnik pokarmowy, aby zwiększyć liczbę i różnorodność pożytecznych bakterii w jelitach, promując w ten sposób produkcję SCFA oraz utrzymanie stabilności i zdrowia układu odpornościowego człowieka. Z tego punktu widzenia musimy poprawić naszą odporność. Cistanche może znacznie poprawić odporność, ponieważ Cistanche jest bogaty w różnorodne substancje przeciwutleniające, takie jak witamina C, witamina C, karotenoidy itp. Składniki te mogą wychwytywać wolne rodniki i zmniejszać stres oksydacyjny. Stymulują i poprawiają odporność układu odpornościowego.

Kliknij zalety Cistanche Tubulosa

Cel:

Staraliśmy się zbadać, czy manipulacja metabolitami płucnymi poprzez podawanie SCFA dostarczanych do płuc może modulować odporność przeciwwirusową na zakażenie RV.

Metody:

Zbadaliśmy wpływ donosowego podawania octanu, maślanu i propionianu SCFA na podstawową ekspresję sygnatur przeciwwirusowych i octanu w mysim modelu zakażenia RV i liniach komórek nabłonka płuc zakażonych RV. Dodatkowo oceniliśmy wpływ octanu, maślanu i propionianu na zakażenie RV w zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórkach nabłonka oskrzeli.

Wyniki:

Donosowe podawanie octanu indukowało podstawową regulację w górę IFN-b, czego nie obserwowano w przypadku innych SCFA. Ekspresja RIG-I indukowana maślanem. Traktowanie myszy octanem donosowym zwiększyło ekspresję genu stymulowanego interferonem i IFN-1 podczas zakażenia RV i zmniejszyło miano wirusa w płucach 8 godzin po zakażeniu. Octan łagodził indukowane wirusem odpowiedzi prozapalne z atenuowaną mucyną płucną i ekspresją IL -6 obserwowaną w dniach 4 i 6 po zakażeniu. To wzmacniające interferon działanie octanu zostało potwierdzone w ludzkich liniach komórkowych nabłonka oskrzeli i pęcherzyków płucnych. W zróżnicowanych pierwotnych komórkach nabłonka oskrzeli leczenie maślanem lepiej modulowało ekspresję genów IFN-b i IFN-1 podczas infekcji RV.

Wnioski:

SCFA zwiększają odporność przeciwwirusową i zmniejszają obciążenie wirusem oraz reakcje prozapalne podczas infekcji RV. (J Allergy Clin Immunol 2023;151:447-57.)

Zbiorowiska bakterii obecne na powierzchniach błony śluzowej (mikrobiota) odgrywają kluczową rolę w homeostazie immunologicznej i dyktują reakcję na stany zapalne i zakaźne, w tym astmę, zapalenie jelita grubego oraz infekcje bakteryjne i wirusowe.1-5 Metabolity bakteryjne, takie jak krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA), głównie octan, maślan i propionian, są obecnie dobrze znanym łącznikiem między mikrobiomem jelitowym a komórkami gospodarza.6,7 Cząsteczki te powstają w wyniku metabolizmu błonnika pokarmowego przez składniki mikroflory jelitowej. SCFA mają zarówno działanie miejscowe, jak i ogólnoustrojowe. Modulują aktywację i funkcję komórek odpornościowych poprzez mechanizmy, w tym aktywację receptorów sprzężonych z białkiem G (tj. Gpr41, Gpr43 lub Gpr109a) i hamowanie deacetylaz histonowych, i wykazano, że promują homeostazę błony śluzowej i tolerancję doustną. Niedawno opisano istnienie mikrobiomu w dolnych drogach oddechowych, a pojawiające się dowody wskazują, że komensale oddechowe są również organizmami aktywnymi metabolicznie, zdolnymi do wytwarzania metabolitów o zdolności immunomodulacyjnej, takich jak SCFA.8 Zatem SCFA są albo uwalniane lokalnie przez mikroflorę płuc, albo pochodzące z mikroflory jelitowej mogą odgrywać znaczącą rolę w regulacji odporności. Jednak działanie przeciwwirusowe SCFA przeciwko rinowirusom (RV) jest nieznane.

RV są odpowiedzialne za ogromne obciążenie chorobami zakaźnymi na całym świecie, wywołując łagodne, samoograniczające się przeziębienia u zdrowych osób i przyspieszając zaostrzenia u osób z przewlekłymi chorobami płuc, takimi jak astma lub przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP). Choroby te powodują znaczne koszty ekonomiczne w infrastrukturze opieki zdrowotnej na całym świecie. Obecnie nie ma skutecznych terapii ani zarejestrowanych szczepionek przeciwko RV, ponieważ duża różnorodność serotypów/szczepów stanowi poważne wyzwanie dla badań.9 Dlatego pilnie potrzebne jest opracowanie nowych metod zapobiegania i leczenia infekcji RV. Mikrobiomem jelitowym można manipulować terapeutycznie, aby zapewnić korzyści kliniczne w przypadku chorób zakaźnych jelit (np. Clostridium difficile). Potencjał podawania komensali oddechowych lub związanych z nimi metabolitów w celu podobnego zwiększenia odporności przeciwbakteryjnej płuc pozostaje niezbadany.10

Wcześniej wykazaliśmy, że podawanie diety bogatej w błonnik lub SCFA octan, maślan i propionian chroni myszy przed zakażeniem syncytialnym wirusem oddechowym (RSV).5 Doustne podawanie octanu indukowało produkcję IFN-b i zwiększoną ekspresję genów stymulowanych interferonem ( ISG) w płucach podczas zakażenia RSV. Ponadto stwierdziliśmy, że octan podawany bezpośrednio do dróg oddechowych chroni przed infekcją RSV poprzez zwiększenie ekspresji ISG w płucach.11 W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że bezpośrednie podanie octanu do dróg oddechowych w celu zwiększenia lokalnych stężeń metabolitów drobnoustrojów miałoby podobny efekt ochronny wpływ na zakażenie RV. Tutaj pokazujemy, że podawanie octanu in vivo myszom zwiększa przeciwwirusowe interferony typu I i typu III (IFN), zmniejsza replikację RV i osłabia immunopatologię wywołaną przez wirusy. Rozważając odpowiedź przeciwwirusową in vitro określonych typów komórek na szerszy zakres SCFA, stwierdzamy, że związki te nie wpływają na odpowiedzi IFN makrofagów pęcherzykowych i mają zróżnicowany wpływ na nabłonek, z bardziej wyraźnym efektem wzmacniającym działanie przeciwwirusowe obserwowanym w przypadku maślanu w porównaniu z maślanem z innymi SCFA, co sugeruje, że efekty in vivo mogą być spowodowane bardziej złożonymi interakcjami komórka-komórka. Dane te sugerują, że manipulowanie środowiskiem metabolitów drobnoustrojów płucnych może stanowić nowe podejście do zapobiegania lub leczenia wirusowych infekcji dróg oddechowych.

METODY

Oświadczenie dotyczące etyki

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z ustawą Animals Act 1986 i wytycznymi Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE), zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez wytyczne brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (brytyjska licencja projektowa PPL nr P07D80C24).

Propagacja i kwantyfikacja RV

W badaniach nad mysią i ludzką linią komórkową hodowano serotyp-A1 (RV-A1) mniejszej grupy RV w komórkach Ohio HeLa (European Collection of Cell Cultures). Zainfekowane komórki zebrano po 24 godzinach, wirus zatężono i oczyszczono, a następnie przeprowadzono oznaczenie TCID50 (50-procentowa dawka zakaźna dla hodowli tkankowej) w celu oceny miana wirusa, jak opisano wcześniej.12 W przypadku badań ludzkich pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli (BEC) , RV-A1 namnożono w komórkach RD-ICAM{11}} z własnego materiału wyizolowanego z próbek klinicznych i zsekwencjonowano w celu potwierdzenia tożsamości. Miareczkowano RV-A1 przez infekowanie komórek RD-ICAM{16}} seryjnie rozcieńczonym RV-A1, a następnie obserwacje efektów cytopatycznych i test TCID50 w celu oceny miana wirusa.

Badanie myszy

Sześciotygodniowe samice myszy BALB / c zakupiono od Harlan Laboratories (Derby, Wielka Brytania) i utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów w Imperial College London (Wielka Brytania). Myszy wstępnie leczono donosowo 50 ml octanu, maślanu lub propionianu sodu (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) pod lekkim znieczuleniem izofluoranem. W niektórych eksperymentach myszy następnie zakażono donosowo 50 ml RV (5 3 106 TCID50) 24 godziny później. Dawka leczenia octanem wynosiła 20 mM zgodnie z naszym poprzednim badaniem przy użyciu tego samego podejścia.11 Leczenie octanem podawano donosowo co 24 godziny po zakażeniu.

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

Całkowity RNA z płuc (100 mg tkanki płucnej) i lizat komórkowy ekstrahowano przy użyciu zestawu RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA zsyntetyzowano przy użyciu losowych starterów heksamerowych (zestaw OmniscriptRT, Qiagen). Pierwszej nici cDNA użyto do ilościowego oznaczenia IFN-b, IFN-1, Viperin, MuC5AC (mysz i człowiek), OAS1, RIG-I (Ddx58), MAVS, MDA -5 (mysz) i kopii RV przy użyciu Testy TaqMan ze starterami i sondami, jak opisano wcześniej.13 W celu bezwzględnego oznaczenia ilościowego każdy gen normalizowano do poziomu 18s rRNA, a dokładne kopie genu będącego przedmiotem zainteresowania obliczono przy użyciu krzywej standardowej utworzonej przez amplifikację plazmidowego DNA. Alternatywnie do obliczenia ekspresji genów użyto 2- DDCt (zmiana krotności). Warunki PCR były zgodne z protokołami TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass). Test ekspresji genów przeprowadzono stosując StepOne (Applied Biosystems, Waltham, Mass).

Płyn do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

Myszy uśmiercano przez dootrzewnowe podanie zbyt dużej dawki roztworu pentobarbitonu i kaniulowano tchawice. Płuca przemyto 3 razy sterylnym PBS. Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) odwirowano, supernatant zebrano do pomiaru dwuniciowego DNA, a osady zawieszono do całkowitej liczby komórek i różnicowania. W celu różnicowego zliczania komórek, szkiełka cytospinowe barwiono MayGrunwald-Giemsa, a procedurę liczenia przeprowadzał doświadczony badacz w sposób ślepy.

Pomiar dwuniciowego DNA

Dwuniciowy DNA mierzono w płynie BAL przy użyciu odczynnika dwuniciowego DNA Quant-iT PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA) zgodnie z protokołem producenta.

Analiza histologiczna

Po BAL płuca perfundowano PBS przez serce i napełniano 4% paraformaldehydem, a następnie lewe płuco utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Następnie skrawki zatopiono w bloczkach parafinowych i pocięto na skrawki 5-mm, barwione hematoksyliną i eozyną. Naciek zapalny mierzono w mikrometrach i wykonano 10 pomiarów, zaczynając od końca nabłonka oskrzeli lub naczyń do końca nacieku zapalnego, stosując oprogramowanie Olympus CellSens Standard (Olympus Corporation, Tokio, Japonia). Wszystkie liczenia przeprowadzono ślepo na warunki eksperymentalne.

Cytometrii przepływowej

Komórki izolowano z płuc przez perfuzję PBS, a następnie trawiono w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 1 mg/ml kolagenazy IV (Invitrogen-Gibco, Waltham, Mass). Komórki wyizolowane z płuc i BAL inkubowano z blokiem Mouse Fc (nr 553141 BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) przez 20 minut. Komórki przemyto i wybarwiono przeciwciałami powierzchniowymi anty-CD45 (1:200, #557235, klon 30-F11, BD Biosciences). W celu barwienia wewnątrzkomórkowego komórki utrwalano za pomocą cytofix/cytoplazmy (BD Biosciences) i anty-RIG-I (1:50, #35H2L48, ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass), a po inkubacji komórki znakowano drugorzędowym kozim przeciwciałem przeciwkróliczym IgG H&L Cy{18}}sprzężony (1:1000, # ab97075, Abcam, Cambridge, Mass). Próbki pobierano w cytometrze przepływowym BD FACS Canto-II (BD Biosciences). Dane analizowano w oprogramowaniu FlowJo (wersja 10, Tree Star, Inc, Ashland, Va).

Badania in vitro na liniach komórek nabłonka

Ludzkie BEC (BEAS-2B) i ludzkie komórki nabłonka płuc (A549) zakupiono od ATCC (Manassas, Va) i hodowano jak opisano wcześniej. 13 Komórki wysiano pojedynczo w stężeniu 1.5 3 105 komórek/ml w 12-płytkach z dołkami. Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu komórki traktowano 400 mM octanem sodu (Sigma-Aldrich) przez kolejne 24 godziny. Następnie komórki infekowano RV-A1 (Multiplicity of Infection [MOI] 2) przez 1 godzinę, po czym usunięto wirusa, komórki przemyto i dodano nową pożywkę uzupełnioną 5% FBS. Dalsze traktowanie octanem (400 mM) dodawano natychmiast po zakażeniu i co 24 godziny aż do zebrania komórek.

Zbiór podstawowych BEC i zatwierdzenie etyki

BEC od zdrowej osoby niepalącej pobrano ze szczotkowania oskrzeli podczas bronchoskopii, za pisemną świadomą zgodą. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone przez Hunter New England Area Health Service Ethics Committee (05/08/10/3.09) i zatwierdzone przez University of Newcastle Safety Committee (H{5}}).

Warunkowe przeprogramowanie BEC i kultur na granicy faz powietrze-ciecz

BEC zostały warunkowo przeprogramowane za pomocą inhibitora kinazy białkowej związanej z rho (końcowe stężenie 10mM) oraz w połączeniu z napromieniowanymi fibroblastami NIH-3T3 w hodowlach jednowarstwowych, jak opisano wcześniej.14,15 Warunkowo przeprogramowane pożywki składały się z stosunek 1:2 zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywki Eagle (wysoka zawartość glukozy 1 L-glutaminy)/Ham's F12 uzupełnionej 5% FCS, hydrokortyzonem (400 ng/ml), insuliną (5 mg/ml), rekombinowanym ludzkim nabłonkowym czynnikiem wzrostu (10 ng /ml), toksyny cholery (8,4 ng/ml), adeniny (23,9 mg/ml) i 0,2% penicyliny-streptomycyny.16 Ekspandowane warunkowo przeprogramowane BEC zostały odsadzone od inhibitora kinazy białkowej związanej z rho i wysiano na {{24} }dołkowe poliestrowe membrany transwell i różnicowano na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) przez 25 dni, jak opisano wcześniej.17 Eksperymenty przeprowadzono z n 5 4 powtórzeniami biotechnicznymi. Standardowe barwienie błękitem alcjanowym, pH 2,5 i kwasem nadjodowym-Schiffa wykonano na skrawkach ALI o grubości 5- mm, aby uwidocznić pseudostratyfikowany nabłonek (patrz ryc. E1 w internetowym repozytorium tego artykułu na stronie www.jacionline.org).

Traktowanie SCFA w hodowli BEC

Przed infekcją hodowle ALI traktowano bazowo 100, 4{11}}0 lub 1600 mM maślanu octanu lub propionianu przez 24 godziny w 6{22}}0 ml końcowej pożywki ALI złożonej z podstawowej pożywki nabłonka oskrzeli i pożywki Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco (stosunek 50:50) zawierającej hydrokortyzon (0,1 procenta) , insulina bydlęca (0,1 proc.), epinefryna (0,1 proc.), transferyna (0,1 proc.), ekstrakt z przysadki bydlęcej (0,4 proc.) i etanoloamina (80 mM), MgCl2 (0,3 mM), MgSO4 (0,4 mM), BSA (0,5 mg /ml), amfoterycyna B (250 mg/ml), kwas all-trans-retinowy (30 ng/ml), penicylina/streptomycyna (2 procent) i rekombinowany ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu (0,5 ng/ml). W dniu zakażenia pożywkę podstawową zastąpiono nową pożywką końcową ALI i leczeniem SCFA, które pozostawiono do analizy punktu końcowego.

Infekcja RV i pobieranie próbek

Hodowle ALI-BEC zakażono wierzchołkowo RV-A1. Początkowo roztwór podstawowy RV-A1 rozcieńczono, aby uzyskać MOI 0, 1, i dodano do wierzchołkowej powierzchni hodowli na 2 godziny w 5 0 ml podstawowej pożywki nabłonka oskrzeli z dodatkami, 1% insulina- transferyna-selen i 0,5% kwas linolowy. Pożywkę infekcyjną zastąpiono następnie 500 ml świeżej pożywki bazowej nabłonka oskrzeli (z dodatkami) na pozostałą część doświadczenia. Płukanie wierzchołkowe (100 ml PBS) i podstawowe próbki pożywki zebrano 8- i 48- godzinę po zakażeniu i przechowywano w temperaturze 280°C. Komórki przechowywano w 350 ml buforu RLT (Qiagen) zawierającego 1 procent 2- merkaptoetanolu w temperaturze 280°C do analizy ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR RT (ryc. E2, C).

Zgodnie ze zwiększonymi przeciwwirusowymi efektami immunologicznymi, octan miał tendencję do zmniejszania liczby kopii wirusowego RNA (ryc. E2, D) i zmniejszania liczby żywych wirusów (ryc. E2, E) po 48 godzinach od zakażenia. W komórkach BEAS2B, linii BEC, zaobserwowaliśmy, że traktowanie octanem zwiększyło ekspresję mRNA IFNB1 w 8 godzin po zakażeniu i mRNA IFNL2 w 4 i 8 godzin po zakażeniu (ryc. E2, F). Nie było znaczącego wpływu na ekspresję Viperin (ryc. E2, F). W przeciwieństwie do wpływu na miano wirusa obserwowanego w komórkach A459, nie było wpływu octanu na ilościowe oznaczenie wirusowego RNA lub TCID50 w komórkach BEAS2B (ryc. E2, G i H).

Wpływ leczenia SCFA na odpowiedzi przeciwwirusowe w kulturach zakażonych ALI-BEC

Po zaobserwowaniu wzmacniającego działania octanu w liniach komórek nabłonka płuc, następnie staraliśmy się ocenić efekty w modelu pierwotnych komórek nabłonka zróżnicowanych w ALI (system eksperymentalny, który wierniej rekapituluje komórki in vivo). Różnicowanie i morfologię komórek potwierdzono przez utworzenie komórek kubkowych (barwienie kwasem nadjodowym-Schiffa) (ryc. E1).

Octan znacząco zwiększał IFNB1 i IFN12/3 (IL28) na BEC zakażonych RV w porównaniu z komórkami niezakażonymi (ryc. 3, B i D), ale nie było różnicy w porównaniu z nietraktowanymi komórkami zakażonymi RV. Octan miał tendencję do zmniejszania wirusowego RNA albo po 8 godzinach, albo po 48 godzinach od zakażenia RV-A1 (ryc. 3, A i B). Biorąc pod uwagę, że octan miał mniej wyraźny wpływ wzmacniający na indukcję RV odpowiedzi IFN typu I w pierwotnie zróżnicowanych komórkach nabłonka, rozszerzyliśmy nasze badania, aby ustalić, czy maślan lub propionian mają dostrzegalne efekty. Maślan i propionian również zwiększały ekspresję genów mRNA IFNb, IFN12/3 (IL28) i IFN11 (IL29) w porównaniu z komórkami niezainfekowanymi (ryc. 3, F, G, H i L). Traktowanie maślanem zwiększyło ekspresję IFNB1, IL28 i IL29 po 48 godzinach od zakażenia RV w porównaniu z nieleczonymi komórkami zakażonymi RV, chociaż efekt ten nie był wystarczający, aby mieć wpływ na miano wirusa (ryc. 3, I, J, K, i ja). Nie stwierdziliśmy efektu supresyjnego na ekspresję MUC5AC indukowaną przez RV przy żadnej dawce leczenia SCFA (patrz ryc. E3, AC, w internetowym repozytorium tego artykułu na stronie www.jacionline.org). Łącznie dane te wskazują, że w przeciwieństwie do danych z mysich i ludzkich linii komórkowych, SCFA mają bardziej ograniczony wpływ na odporność przeciwwirusową w zróżnicowanych pierwotnych komórkach nabłonkowych.

Brak wpływu SCFA na odpowiedzi IFN typu I w makrofagach pęcherzykowych

Aby zbadać, czy działanie przeciwwirusowe octanu i / lub innych SCFA wynikało z modulacji makrofagów pęcherzykowych (głównej komórki wczesnej odpowiedzi podczas infekcji wirusowych i kluczowego źródła IFN typu I), oceniliśmy wpływ podawania SCFA na ex vivo odpowiedzi przeciwwirusowe w makrofagach stymulowanych RVA1. Stwierdziliśmy, że podawanie SCFA nie miało znaczącego wpływu na indukcję Ifnb1, Viperin lub OAS1 przez RV, co wskazuje, że wzmacniające odporność działanie SCFA nie występuje poprzez wpływ na makrofagi pęcherzykowe (patrz ryc. Repozytorium na www.jacionline.org).

Dostarczane drogą oddechową SCFA wzmocnione IFN-b i receptory wykrywające wirusy przed zakażeniem RV

Aby uzyskać dodatkowy mechanistyczny wgląd w szlaki przeciwwirusowe zaangażowane we wzmacnianie IFN typu I przez SCFA, następnie zbadaliśmy wpływ tych związków na geny wykrywające szlak przeciwwirusowy. Ponownie podaliśmy donosowo 3 SCFA (octan, maślan i propionian) w stężeniach 20 mM przez 24 godziny (ryc. 4, A). Nie stwierdziliśmy wpływu żadnego z SCFA na ekspresję czujnika cytozolowego wirusowego RNA MDA5 lub jego cząsteczki adaptorowej MAVS (ryc. 4, B i C). I odwrotnie, podawanie maślanu (ale nie innych SCFA) zwiększało ekspresję mRNA RIGI (ryc. 4, D). Stwierdzono, że zwiększający wpływ maślanu na ekspresję RIG-I występuje specyficznie w komórkach nabłonka/zrębu płuc (CD452), bez efektu obserwowanego w hematopoetycznych komórkach odpornościowych (CD451) (ryc. 4, EI). Łącznie dane te wskazują, że różne SCFA mogą działać poprzez specyficzne szlaki wykrywania przeciwwirusowego w celu regulacji odporności wrodzonej.

DYSKUSJA

Badanie to daje nowy wgląd w potencjalne korzyści podawania metabolitów drobnoustrojów bezpośrednio do dróg oddechowych w celu zwiększenia wrodzonej odporności płuc. Błonnik pokarmowy i SCFA pochodzące z mikroflory jelitowej od dawna kojarzone są z korzystnym wpływem na zdrowie płuc. Randomizowane badanie kontrolowane placebo wykazało, że stosowanie prebiotyków (błonnika) u wcześniaków zapobiegało zakażeniom RV w pierwszym roku życia.20 Błonnik pokarmowy to niestrawne polisacharydy, które mogą być rozkładane do SCFA na drodze fermentacji mikrobiologicznej. Badania wykazały również, że SCFA mogą modulować zdrową mikroflorę jelitową.21 Nasze badanie podkreśla, że ​​podawanie SCFA do dróg oddechowych może również mieć bezpośredni lokalny korzystny wpływ na reakcje gospodarza. Zidentyfikowaliśmy odrębny mechanizm od wpływu diety na mikroflorę, który obejmuje bezpośrednią stymulację płuc wrodzonej odporności przeciwwirusowej przez SCFA.

Nasze dane pokazują, że podawanie octanu SCFA zwiększa podstawową ekspresję przeciwwirusowych mediatorów immunologicznych w stanie ustalonym. Jest to koncepcyjnie zgodne z rolą octanu w przygotowaniu płuc do silniejszego wczesnego uwalniania IFN. Zostało to poparte naszymi odkryciami, że podawanie octanu zwiększyło również indukcję IFN i ISG w odpowiedzi na infekcję RV u myszy. Wiązało się to ze zmniejszoną liczbą wirusów i późniejszym zahamowaniem odpowiedzi prozapalnych i produkcji śluzu. Wszystkie te efekty zostałyby uznane za korzystne w kontekście ostrej infekcji wirusowej. Nasze dane pasują do literatury pokazującej, że octan jest zaangażowany w zapewnianie szeroko zakrojonych korzyści zdrowotnych, takich jak poprawa funkcji serca, poprawa wytwarzania czerwonych krwinek i tworzenie pamięci immunologicznej.22 Co więcej, octan jest związany z modulacją różnych funkcje odpowiedzi immunologicznej23-25 i zwalczanie chorób układu oddechowego.

Zbadaliśmy również wpływ podawania octanu na zakażenie RV nabłonka, ponieważ jest to główne miejsce początkowej replikacji wirusa. Stwierdziliśmy podobne wzmacniające przeciwwirusowe działanie octanu w ludzkich liniach komórkowych płuc, z silniejszym działaniem obserwowanym w komórkach A549 niż w komórkach B BEAS -2 (o których wiadomo, że wyrażają wyższy podstawowy poziom IFN i ISG).27 ,28 Może to częściowo wyjaśniać, dlaczego traktowanie octanem miało mniejszy wpływ na komórki B BEAS{5}}. W przeciwieństwie do tego zaobserwowaliśmy, że w ludzkich pierwotnie zróżnicowanych BEC (ALI-BEC) nie było wyraźnego wpływu octanu na odpowiedzi IFN typu I na RV. Ponadto oceniliśmy również zdolność octanu i innych SCFA do modulowania odpowiedzi IFN typu I w makrofagach pęcherzykowych hodowanych ex vivo i podobnie nie stwierdziliśmy żadnego efektu. Ta niezgodność między wynikami in vivo i in vitro może sugerować, że wiele typów komórek i komunikacja komórka-komórka może być odpowiedzialna za wyraźny fenotyp obserwowany in vivo, z mniejszym efektem obserwowanym, gdy izolowane komórki są traktowane SCFA.

Chociaż głównym celem naszych badań była ocena wpływu SCFA na wrodzoną odporność przeciwwirusową, można sobie wyobrazić, że może wystąpić dalszy wpływ na adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne, a przyszłe badania mogą koncentrować się na potencjalnym wpływie na populacje i produkcję limfocytów T i B. przeciwciał neutralizujących.

Należy również zauważyć, że zastosowany przez nas model myszy jest modelem, w którym zachodzi stosunkowo ograniczona (24-36 godzin) replikacja wirusa, chociaż wszystkie zmierzone punkty końcowe są zależne od replikacji.12,29 Dalsze badania z wykorzystaniem szczepów wirusów przystosowanych do myszy gdzie zachodzi trwalsza replikacja wirusa, mogą wykazywać głębsze i trwałe efekty. Co więcej, nasze eksperymenty przeprowadzono wyłącznie na samicach myszy, a dalsze badania powinny potwierdzić, czy podobne efekty występują u samców.

Chociaż octan miał ograniczone działanie w ALI-BEC, zaobserwowaliśmy, że podawanie maślanu może zwiększyć indukcję RV odpowiedzi IFN typu I. Dane te kontrastują z badaniem Chemudupati i in.,30 które wykazało hamujący wpływ maślanu na odpowiedzi IFN typu I. Jednak w tym badaniu wykorzystano znacznie wyższe stężenia maślanu i skupiono się również na różnych wirusach układu oddechowego.

Wytwarzanie śluzu w płucach jest cechą charakterystyczną zakażenia RV, co prowadzi do zwiększenia ciężkości klinicznej i zaostrzenia astmy i POChP,31,32 szczególnie poprzez wzmocnienie stanu zapalnego dróg oddechowych przez MUC5AC.33 Wykazaliśmy, że leczenie octanem zmniejsza ekspresję Muc5AC w płucach w dniach 4 i 6 po infekcji. W związku z tym wykazano, że SCFA osłabiają produkcję śluzu w płucach podczas zakażenia grypą34 i alergicznego zapalenia dróg oddechowych.34,35 Jednak w komórkach ALI-BEC octan nie modulował ekspresji genu Muc5AC, chociaż należy zauważyć, że późniejsze punkty czasowe były nie zbadane. Nasza obserwacja zmniejszonej ekspresji mucyny u myszy leczonych octanem i zakażonych wirusem jest zgodna z naszymi wcześniejszymi odkryciami, że IFN typu I negatywnie reguluje ekspresję mucyny głównych dróg oddechowych Muc5ac podczas infekcji wirusowej.14 Mechanizmy molekularne, przez które to zachodzi, są niejasne , chociaż wcześniejsze dowody wskazują, że zapalenie typu 2, w którym pośredniczy IL{16}}, może mieć znaczenie w indukcji MUC5AC.36,37 Dalsze badania powinny dążyć do pełniejszego zrozumienia, w jaki sposób octan może wpływać na produkcję śluzu w drogach oddechowych.

Aby zbadać mechanizmy molekularne, poprzez które SCFA indukują IFN, dodatkowo zmierzyliśmy ekspresję genów wykrywających szlak przeciwwirusowy. Zaobserwowaliśmy, że maślan iw mniejszym stopniu octan mogą indukować ekspresję RIG-I w komórkach nabłonka płuc myszy naiwnych. Nasze dane sugerują, że te SCFA zwiększają odpowiedź wykrywającą wirusy, przygotowując płuca do zwiększonej wrodzonej odpowiedzi na infekcję wirusową.

Upośledzone wytwarzanie IFN typu I ex vivo w odpowiedzi na zakażenie RV wykazano w komórkach nabłonka dróg oddechowych zarówno w przypadku astmy, jak i POChP.38,39 Postuluje się, że ten defekt zwiększa u tych osób podatność na zaostrzenia wywołane wirusem. Mechanizmy napędzające te defekty są nieznane. Potrzebne są dalsze prace z wykorzystaniem modeli zwierzęcych lub systemów hodowli chorych komórek, aby określić, czy dysbioza drobnoustrojów obserwowana w astmie i POChP prowadzi do względnego niedoboru octanu lub innych SCFA, który można skorygować poprzez podawanie w celu przywrócenia upośledzonej odporności przeciwwirusowej.

Podsumowując, stosowanie SCFA w leczeniu infekcji RV wiąże się ze zwiększeniem produkcji IFN typu I i typu III, centralnych składników przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej płuc. Badanie to podkreśla, że ​​podawanie drogą oddechową metabolitów drobnoustrojów, takich jak SCFA, może mieć korzystny wpływ na odporność przeciwwirusową i może potencjalnie złagodzić nasilenie wirusowych chorób układu oddechowego.

BIBLIOGRAFIA

1.Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C, et al. Metabolizm mikroflory jelitowej błonnika pokarmowego wpływa na choroby alergiczne dróg oddechowych i hematopoezę. Nat Med 2014;20:159-66.

2. Thorburn AN, McKenzie CI, Shen S, Stanley D, Macia L, Mason LJ i in. Dowody na to, że astma jest chorobą pochodzenia rozwojowego, na którą wpływa dieta matki i metabolity bakteryjne. Nat Commun 2015;6:7320.

3. Rivera-Chavez F, Zhang LF, Faber F, Lopez CA, Byndloss MX, Olsan EE i in. Wyczerpanie bakterii Clostridia wytwarzających maślan z mikroflory jelitowej napędza tlenową ekspansję światła Salmonelli. Komórkowy mikrob-gospodarz 2016;19:443-54.

4. Fachi JL, Secca C, Rodrigues PB, Mato FCP, Di Luccia B, Felipe JS i in. Octan koordynuje reakcje neutrofili i ILC3 przeciwko C. difficile poprzez FFAR2. J Exp Med 2020;217:jem.20190489.

5. Antunes KH, Fachi JL, de Paula R, da Silva EF, Pral LP, Dos Santos AA i in. Octan pochodzący z mikroflory chroni przed zakażeniem syncytialnym wirusem oddechowym poprzez odpowiedź interferonu GPR{2}}typu 1. Nat Komunia 2019;10:3273.

6. Correa-Oliveira R, Fachi JL, Vieira A, Sato FT, Vinolo MA. Regulacja funkcji komórek odpornościowych przez krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Clin Transl Immunol 2016;5:e73.

7. Koh A, De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, Backhed F. Od błonnika pokarmowego do fizjologii gospodarza: krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe jako kluczowe metabolity bakteryjne. Komórka 2016;165: 1332-45.

8. Sulaiman I, Wu BG, Li Y, Tsay JC, Sauthoff M, Scott AS i in. Funkcjonalne profilowanie genomowe dolnych dróg oddechowych mikrobiomu w celu wychwycenia aktywnego metabolizmu drobnoustrojów. Eur Respir J 2021;58:2003434.

9. Glanville N, Johnston SL. Wyzwania w opracowaniu krzyżowej serotypowej szczepionki na rinowirusy. Bieżąca opinia Virol 2015;11:83-8.

10. Spacova I, De Boeck I, Bron PA, Delputte P, Lebeer S. Miejscowe środki przeciwdrobnoustrojowe przeciw wirusowym infekcjom dróg oddechowych. Trendy Mol Med 2021;27:538-53.

11. Antunes KH, Stein RT, Franceschina C, da Silva EF, de Freitas DN, Silveira J, et al. Octan krótkołańcuchowego kwasu tłuszczowego wyzwala odpowiedź przeciwwirusową, w której pośredniczy RIG-I w komórkach niemowląt z zapaleniem oskrzelików wywołanym przez syncytialny wirus oddechowy. EBioMedicine 2022;77:103891.

12. Bartlett NW, Walton RP, Edwards MR, Anisenko J, Caramori G, Zhu J i in. Mysie modele choroby wywołanej przez rinowirusa i zaostrzenia alergicznego zapalenia dróg oddechowych. Nat Med 2008;14:199-204.

13. Singanayagam A, Glanville N, Girkin JL, Ching YM, Marcellini A, Porter JD i in. Supresja kortykosteroidów odporności przeciwwirusowej zwiększa obciążenie bakteryjne i produkcję śluzu w zaostrzeniach POChP. Nat Komuna 2018;9:2229.

14. Gentzsch M, Boyles SE, Cheluvaraju C, Chaudhry IG, Quinney NL, Cho C, et al. Ratunek farmakologiczny warunkowo przeprogramowanych komórek nabłonka oskrzeli mukowiscydozy. Am J Respir Cell Mol Biol 2017;56:568-74.

15. Liu X, Ory V, Chapman S, Yuan H, Albanese C, Kallakury B i in. Inhibitor ROCK i komórki odżywcze indukują warunkowe przeprogramowanie komórek nabłonka. Am J Pathol 2012;180:599-607.

For more information:1950477648nn@gmail.com