SNP Rs708727 związany z chorobą Alzheimera w SLC41A1 może zwiększać ryzyko choroby Parkinsona: raport z rozszerzonego badania słowackiego, część 2

2.2. Analizy genetyczne

Analizy genetyczne przeprowadzono na SNP A1 rs11240569, rs708727 i rs823156 w kohorcie 508 pacjentów z ChP (w porównaniu ze 150 pacjentami w badaniu pilotażowym) i kohorcie 472 osób z grupy kontrolnej (w porównaniu z 120 pacjentami z grupy kontrolnej w badaniu pilotażowym) [37]. Zatem liczba pacjentów z chorobą Parkinsona i probantów z grupy kontrolnej wzrosła w tym badaniu odpowiednio 3,4--krotnie i 3,9-krotnie w porównaniu z badaniem pilotażowym.

Wiele osób z wiekiem doświadcza utraty pamięci, ale u osób z chorobą Parkinsona zmiany w pamięci mogą być bardziej wyraźne. Nie powinniśmy jednak myśleć, że osoby cierpiące na chorobę Parkinsona są zagrożone pogorszeniem pamięci, ponieważ są rzeczy, które możemy zrobić, aby pomóc im ją zachować.

Po pierwsze, konsekwentne wykonywanie niektórych ćwiczeń ćwiczących mózg może pomóc osobom cierpiącym na chorobę Parkinsona poprawić pamięć. Działania te mogą obejmować: robienie Sudoku, granie w gry planszowe, rozwiązywanie łamigłówek i inne. Dzięki tym działaniom mogą ćwiczyć pamięć, poprawiać funkcjonowanie mózgu i pomagać w utrzymaniu stanu psychicznego.

Po drugie, bardzo istotny wpływ na pamięć osób chorych na chorobę Parkinsona ma także dieta. Do diety możemy dodać pokarmy bogate w białko i składniki odżywcze, takie jak ryby, fasola, orzechy itp. Pokarmy te mogą pomóc nam zachować zdrowie i poprawić naszą pamięć.

Wreszcie regularne ćwiczenia mogą również pomóc osobom cierpiącym na chorobę Parkinsona poprawić pamięć. Ćwiczenia nie tylko pomagają nam zachować zdrowie fizyczne, ale co ważniejsze, poprawiają funkcjonowanie naszego mózgu. Dzięki regularnym ćwiczeniom mogą poprawić funkcję krążeniowo-oddechową, poprawić elastyczność mięśni i kości oraz poprawić pamięć.

Podsumowując, to, czy u osób chorych na chorobę Parkinsona wystąpi pogorszenie pamięci, zależy od ich stylu życia i nawyków żywieniowych, a także od tego, czy zwracają uwagę na takie rzeczy, jak trening mózgu i ćwiczenia. Wierzę, że dopóki będziemy zwracać uwagę na te aspekty, pamięć pacjentów z chorobą Parkinsona można skutecznie poprawić. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć. Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola to tradycyjny chiński materiał leczniczy o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność mięsa mielonego wynika z różnorodnych zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasu karboksylowego, polisacharydów, flawonoidów itp. Składniki te mogą promować zdrowie mózgu różnymi kanałami.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) w naszej całkowitej kohorcie (przypadki PD + probanci w grupie kontrolnej), w przybliżeniu porównywalny z zakresem fq całkowitej populacji alleli mniejszych (MATPFR) podanym w bazach danych gnomAD i ExAC, jak następuje: fqo (obserwowane) vs. dla (raportowane) {{1 }}% ​​kontra 29-30%.

Allel drugorzędny fq dla rs708727 (G > A) w naszej całkowitej kohorcie był wyższy niż MATPFR w bazach danych gnomAD i ExAC (fq, vs. dla=40% vs. 29-30%), ale był porównywalny z allel drugorzędny rs708727 fq zgłoszony dla populacji europejskiej w bazie danych ALFA (41%). Allel drugorzędny rs823156 (A > G) fq w całej naszej kohorcie wynosił 17%, a zatem był niższy niż MATPFR w bazach danych gnomAD i ExAC (23–30%), ale był porównywalny z mniejszym allelem rs823156 fq odnotowanym dla populacji europejskiej w baza ALFA (18%).

Częstość występowania mniejszego allelu rs9438393 (A > G) w całej kohorcie wynosiła 40%, a zatem była znacznie wyższa niż MATPFR wynoszący 26–29% odnotowanego w bazach danych gnomAD i TOPMED, ale była porównywalna z mniejszym allelem rs9438393 częstość alleli zgłoszona w bazie danych ALFA dla populacji europejskiej (41%). Allel drugorzędny rs56152218 (T > C) w całej kohorcie był obecny z fq wynoszącym 38%, co mieści się w zakresie MATPFR wynoszącym 32–46% podanego w bazach danych ALSPAC, TOPMED i ALFA (populacja europejska).

Co ciekawe, w populacjach Wietnamu, Korei i Kataru allelem drugorzędnym jest T, a nie C, jak zaobserwowano w populacji europejskiej [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, dostęp: 2 sierpnia 2021 r.)]. Stwierdzono, że fq mniejszego allelu w rs61822602 (G > T) wynosi 12%. Jest to porównywalne z częstością alleli T odnotowaną w bazach danych ALSPAC i TWINSUK (odpowiednio 12% i 13%), ale jest znacznie wyższe niż fq allelu T odnotowane w populacji europejskiej w bazie danych ALFA (6%).

Wszystkie testowane SNP A1 w naszych kohortach PD i kontrolnych znajdowały się w równowadze Hardy'ego-Weinberga (HWE; Tabela 4).

Następnie obliczyliśmy iloraz szans (OR) mniejszego allelu i genotypów zawierających mniejszy allel dla każdego testowanego SNP. Wyniki te podsumowano w Tabeli 5. Genotyp GA w rs708727 powiązano z PD (OR=1.42 (1,08–1,87), p=0,01) w naszej populacji. Ponadto przetestowaliśmy powiązanie poszczególnych kombinacji genotypowych dla każdego testowanego SNP z PD w modelach genetycznych recesywnych, dominujących i całkowicie dominujących (Tabela 6). Zgodnie z wcześniejszymi danymi zidentyfikowaliśmy powiązanie mniejszego allelu rs708727 (A) z PD w modelach genetycznych dominujących (GG vs. GA + AA) i całkowicie nadmiernie dominujących (GG + AA vs. GA) (ORD {{16} },36 (1,05–1,77), p=0,02 i ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02, odpowiednio). Pozostałe SNP nie wykazały związku z chorobą Parkinsona w badanych modelach genetycznych (tab. 6).

Zbadaliśmy także równość proporcji populacji dowolnej kombinacji genotypowej składającej się z dupletów, trojaczków, czwórek, pięcioraczków lub sześcioraczków testowanych SNP w kohorcie PD (N {0}}) i kohorcie kontrolnej ( N=100), aby zbadać wielkość wpływu interakcji między testowanymi SNP A1 na podatność na rozwój choroby Parkinsona w naszej populacji. W sumie 12 kombinacji genotypowych (dwa duplikaty, siedem trojaczków i trzy czwórki, tabela 7) ze znacząco (p < 0.05, 10 genotypów; p < 0,06, dwa genotypy ) zidentyfikowano różne liczby w kohortach PD i kontrolnych (Tabela 7). Zgodnie z kryteriami Cohena [39], które opisują różnice w proporcjach, tylko triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) z 12 genotypów wykazał „średnią” różnicę wielkości zdefiniowaną przez h(2arcsin√ prp1 Cohena) –2arcsin√ prp2) Większy lub równy 0,5.

Wartość h dla pozostałych 11 genotypów mieściła się w przedziale od 0.32 do 0.46, a zatem mieściła się w przedziale h od 0.2 do 0.5, co oznacza definiuje małe różnice w proporcjach (tab. 7) [39]. Dlatego triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) może mieć znaczenie kliniczne i należy przeprowadzić przyszłe badania tego genotypu pod kątem podatności na PD. W przypadku rs11240569, rs708727 i rs823156 przeprowadziliśmy ten sam typ analizy z danymi źródłowymi z kohorty 508 pacjentów z PD i kohorty 472 kontroli. Cztery genotypy, dwa duplety (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) i dwie trojaczki (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AA(rs823156), (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), ze znacząco (p < 0,05) różnymi liczebnościami w kohorcie PD i kontrolnej, h Cohena obliczone dla każdego z czterech genotypów było poniżej progu 0,2 [39], tym samym różnica w proporcjach populacji pomiędzy badanymi grupami była we wszystkich czterech przypadkach znikoma.

Za najważniejszy czynnik ryzyka wystąpienia idiopatycznej choroby Parkinsona uważa się starzenie się, a następnie płeć męską [37]. W naszym badaniu pilotażowym wiek, w którym wystąpiła idiopatyczna choroba Parkinsona w kohorcie 150 pacjentów z chorobą Parkinsona, nie był skorelowany z obecnością jakiejkolwiek kombinacji genotypowej dla SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 [37]. Tutaj skorelowaliśmy wiek, w którym wystąpiła PD z (1) obecnością każdej kombinacji genotypowej SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 w grupie 508 pacjentów z PD (ryc. 2) oraz (2) z obecnością każdego kombinacja genotypowa dla SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 i rs61822602 w podkohorcie pacjentów z PD, losowo wybranych z kohorty PD do sekwencjonowania promotora A1 (ryc. 3). Jeśli chodzi o wiek zachorowania, jednoczynnikowa analiza ANOVA wykazała, że ​​nie było istotnej (p < 0,05) różnicy między subpopulacjami genotypowymi dla każdego z testowanych SNP zarówno w dużej kohorcie PD, jak i w podkohorcie PD pacjenci. Zatem żaden konkretny genotyp badanych SNP nie wpływa na wiek wystąpienia idiopatycznej postaci PD. Jest to w pełni zgodne z wnioskami wyciągniętymi z naszego badania pilotażowego [37].

Przeprowadziliśmy również ten sam typ analizy dla każdego z testowanych SNP w subpopulacjach kobiet i mężczyzn, które wywodziły się z dużej kohorty (N=508) i podkohorty (N=96 ) pacjentów z ChP. Jak wykazano na dodatkowych rysunkach S1–S3, nie ma istotnego (p <{6}},05) związku między wiekiem zachorowania a obecnością jakiejkolwiek konkretnej kombinacji genotypów w testowanych SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218, i rs61822602 w podgrupach podzielonych na płeć wyprowadzono albo z dużej kohorty PD (NM=306, NF=202) albo podkohorty PD wybranej do sekwencjonowania promotora A1 (NM {{20} }, NF=42).

2.3. Uczenie maszynowe RandomForest (RF-ML)

Wszystkie SNP A1 przetestowano pod kątem ich zdolności do rozróżniania pacjentów z PD i kontroli za pomocą RF-ML. Algorytm RF-ML został przeszkolony na podstawie naszych danych i oszacowano znaczenie dyskryminacyjne poszczególnych SNP za pomocą konstrukcji technicznej, znanej jako głębokość grafu [37,40]. Podobnie jak w naszym badaniu pilotażowym [37], zdolność predykcyjną testowanych SNP wizualizowano i określano ilościowo odpowiednio za pomocą krzywych ROC (charakterystyka działania odbiornika) i AUC (obszar pod krzywą ROC). Zdolność dyskryminacyjna predyktorów jest podana w przedziale AUC od 100% (maksymalna zdolność dyskryminacyjna) do 50% (minimalna zdolność dyskryminacyjna); AUC < 50% odpowiada brakowi zdolności rozróżniania.

Algorytm RF trenowano w następujących trybach: (1) z trzema lub sześcioma (Tabela 8) konkretnymi SNP A1 (każdy SNP, trzy genotypy (AMAM/AMAm/AmAm, gdzie AM oznacza allel główny, a Am allel mniejszy), jako predyktor (trzy lub sześć modeli RF, po jednym dla każdego SNP), (2) z genotypowymi duplikatami sparowanych SNP jako predyktorami (trzy modele RF (trzy SNP) lub 15 modeli RF (sześć SNP), po jednym na każdą parę SNP; Tabela 8), (3) z genotypowymi trójkami trzech SNP jako predyktorami (jeden model RF (trzy SNP) lub 20 modeli RF (sześć SNP), po jednym dla każdej trójki SNP; Tabela 8), (4) z genotypowe czworaczki sześciu SNP jako predyktory (15 modeli RF, po jednym na każdy czwórkę; Tabela 8), (5) z genotypowymi pięcioraczkami sześciu SNP jako predyktorami (sześć modeli RF, po jednym na każdy pięcioraczek; Tabela 8) oraz ( 6) z sekstupletem genotypowym (jeden model RF, tabela 8).

Tak więc, gdy jako predyktory zastosowano singletony, duplety, trojaczki, czworaczki, pięcioraczki i sześcioplety SNP A1, nie zapewniały one możliwości rozróżnienia pomiędzy pacjentami z PD a grupą kontrolną (Tabela 8). Dlatego też, zgodnie z analizą RF-ML i zgodnie z badaniem pilotażowym [37], SNP A1 nie mają potencjału, aby służyć jako czynniki odróżniające grupę kontrolną od pacjentów z PD, a w przypadku PD nie mają wartości predykcyjnej ani diagnostycznej w populacji słowackiej .

3. Dyskusja

Locus PARK16 zyskał uwagę społeczności naukowej ze względu na jego związek z chorobą Parkinsona i omówioną rolę w określaniu podatności na tę złożoną chorobę. W 2019 roku opublikowaliśmy badanie pilotażowe, w którym przeanalizowaliśmy powiązanie trzech SNP A1, a mianowicie rs11240569, rs708727 i rs823156, z idiopatyczną postacią choroby Parkinsona w populacji Słowaków (Słowian Zachodnich). W naszym badaniu nie znaleziono zgłoszonego związku rs11240569 i rs823156 z podatnością na chorobę Parkinsona, głównie w populacjach azjatyckich/orientalnych [37]. Żadnego związku nie udało się potwierdzić za pomocą statystyk częstościowych (konserwatywnych analiz genetycznych) ani analizy RF-ML [37].

Głównym ograniczeniem naszego badania pilotażowego była jednak stosunkowo mała liczba pacjentów/probantów w kohortach chorych na PD i kontrolnych (odpowiednio 150 i 120). Podkreśliliśmy, że ze statystycznego punktu widzenia dane należy interpretować ostrożnie ze względu na małą liczebność próby w obu kohortach oraz małą moc statystyczną przeprowadzonych analiz [37]. Niemniej jednak, stosując podejście ML, które wymaga znacznie mniejszych rozmiarów próbek niż konwencjonalne statystyki częstości lub przybliżone obliczenia bayesowskie, byliśmy w stanie z pewnością zbadać zdolność poszczególnych SNP A1 do rozróżniania pacjentów z PD od kontroli. We wszystkich przypadkach podejście ML ujawniło zasadniczo zerowe znaczenie diagnostyczne i predykcyjne SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 w populacji słowackiej [37].

W tym badaniu zbadaliśmy nie tylko trzy wyżej wymienione SNP, ale także trzy SNP (rs9438393, rs56152218 i rs61822602) zlokalizowane w regionie promotora A1. Te SNP zidentyfikowano poprzez sekwencjonowanie 96 próbek PD, a następnie analizę RFLP próbek kontrolnych i weryfikację RFLP sekwencjonowanych próbek PD. Nasze analizy genetyczne nie wykazały zasadniczo żadnego związku żadnego z trzech nowo badanych SNP z chorobą Parkinsona. To samo dotyczy rs11240569 i rs823156, które analizowano w podkohortach PD i kontrolnych (96/100), a także w kohortach 508 pacjentów z PD i 472 kontroli. Wyniki te są całkowicie zgodne z wynikami badania pilotażowego [37]. Jednakże w dużych kohortach rs708727 wiąże się ze zwiększonym ryzykiem choroby Parkinsona w populacji słowackiej.

Według naszej najlepszej wiedzy żadne badanie nie powiązało dotychczas bezpośrednio A1 SNP rs708727 ze zmienionym ryzykiem rozwoju choroby Parkinsona [19,37]. W naszym powiększonym badaniu (w porównaniu z badaniem pilotażowym [37]) mniejszy allel A w rs708727 jest powiązany ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia choroby Parkinsona w przypadku badania u dominujących [40] (ORD=1.36 (1,05– 1,77), p=0,02) lub całkowicie dominujący [41] (modele ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02) (tab. 5). Zatem obecność mniejszego allelu (A) w rs708727 może wiązać się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju choroby Parkinsona. Podczas gdy Sanchez-Mut i in. [27] oraz Wang i in. [42] wyraźnie wykazali, że obecność mniejszego allelu A w rs708727 zmienia metylację promotora PM20D1 (a tym samym jego ekspresję) w sposób zależny od dawki (ilościowy), co jest najlepiej dopasowanym modelem genetycznym w naszym badaniu wskazują, że obecność jednego allelu rs708727 A jest wystarczająca do zmiany podatności na wystąpienie PD. Podatność na PD (fenotyp), dotycząca tego, czy w rs708727 (genotyp) występuje jedna czy dwie kopie mniejszego allelu, pozostaje do dokładniejszego wyjaśnienia.
Sanchez-Mut i in. zidentyfikowali PM20D1 (zlokalizowany w locus PARK16 i kodujący domenę peptydazy M20-zawierającą enzym białko pierwsze o aktywności zarówno hydrolazy, jak i peptydazy; syntaza/hydrolaza N-tłuszczowego acyloaminokwasu) jako cechę ilościową metylacji i ekspresji locus (mQTL) sprzężony z haplotypem związanym z ryzykiem AD, który wykazuje cechy podobne do wzmacniacza i kontaktuje się z promotorem PM20D1 poprzez zależną od haplotypu pętlę chromatyny zależną od czynnika transkrypcyjnego CTCF (CCCTC) [27]. Porównując próbki od zdrowych osób z grupy kontrolnej i pacjentów z zaawansowanym stadium AD, odkryli, że PM20D1 konsekwentnie wykazuje hipermetylację promotora u pacjentów z AD [27]. A1 SNP rs708727 koreluje z poziomami metylacji DNA PM20D1 w ludzkiej korze czołowej i hipokampie [27], podobnie jak SNP rs960603 [27]. Wang i wsp. w swojej pracy dotyczącej krwi obwodowej uzyskali dane potwierdzające, że PM20D1 jest mQTL, w którym pośredniczy głównie związany z ryzykiem choroby Alzheimera A1 SNP rs708727 [42].

Co więcej, ich dane podłużne pokazują, że hipometylacja zachodzi przed objawowym wystąpieniem AD, co prawdopodobnie ułatwia rosnącą ekspresję PM20D1 w celu aktywacji jego funkcji ochronnej [42]. Postęp AD charakteryzuje się rosnącym poziomem metylacji wysp CpG w DMR (regionie różnicowo metylowanym) promotora PM20D1 u pacjentów z AD, co ostatecznie prowadzi do hamowania transkrypcji i ekspresji genów [27,42,43]. PM20D1 powiązano także z cukrzycą [44], otyłością [45] i stwardnieniem rozsianym [46], a ponieważ jest zlokalizowany w locus PARK16, zakłada się jego możliwy udział/powiązanie z PD [47].

Pomimo braku molekularnych analiz mechanistycznych, w świetle naszych aktualnych danych spekulujemy, że AD i PD (oraz inne rzadsze choroby neurodegeneracyjne) mają wspólne nie tylko „dobrze znane” mechanizmy patofizjologiczne (np. zaburzona mitofagia, retromer i proteasom funkcje), ale także mechanizmy epigenetyczne, takie jak zależna od A1 rs708727-regulacja ekspresji PM20D1 [27,42]. Nasza praca pośrednio zwiększa potrzebę szczegółowego wyjaśnienia roli endogennych N-acyloaminokwasów (NAA), które są metabolizowane przez PM20D1, w patobiologii choroby Parkinsona i innych chorób neurodegeneracyjnych. Obecnie wiadomo, że NAA i N-acylowe koniugaty neuroprzekaźników (NAAN) odgrywają ważną rolę w neuromodulacji [48,49]. Dowodów łączących ekspresję PM20D1 z N-acylodopaminą (NADA) dostarczono w niedawnej pracy Song i in. Autorzy ci wykazali, że delecja kir6.2 (podjednostka tworząca pory kanałów K+ wrażliwych na ATP) prowadzi do zmniejszenia liczby mitochondriów i obniżonej produkcji ATP poprzez wzrost poziomu PM20D1 i czynników rozprzęgających oddychanie mitochondrialne , w tym NADA, w mysim śródmózgowiu [49].

NADA jest silnym inhibitorem 5-lipoksygenazy (5-LOX) i jego dystrybucja ogranicza się do mózgu, gdzie poziomy są najwyższe w prążkowiu i bardzo niskie gdzie indziej [48,50,51]. 5-LOX katalizuje syntezę leukotrienu lub 5-HpETE (5-kwasu hydroperoksyeikozatetraenowego) z kwasu arachidonowego i jest powiązany z neurodegeneracją (AD i PD) poprzez udział w zapaleniu układu nerwowego [51, 52]. Sugerujemy zatem, że zmniejszona ekspresja PM20D1, późniejsza mniejsza liczebność NADA i zwiększona aktywność 5-LOX znacząco przyczyniają się do patologii PD (i innych chorób neurodegeneracyjnych).

Sanchez-Mut i współpracownicy wykazali, że nadekspresja PM20D1 w mysim hipokampie AD skutkuje poprawą uczenia się, podczas gdy jego obniżenie zwiększa obciążenie płytkami amyloidowymi [27]. W otępieniu związanym z ChP istotne znaczenie mają zarówno patologie Lewy’ego, jak i Alzheimera [53]. Znacząca grupa pacjentów z ChP cierpi na postępującą demencję w trakcie choroby [54]. Biorąc te obserwacje pod uwagę, spekulujemy, czy aktywność połączona z rs708727-, która wycisza PM20D1, przyczynia się do wystąpienia otępienia PD i czy monitorowanie aktywności PM20D1 może służyć jako parametr prognostyczny w przypadku wystąpienia otępienia PD.

Wcześniej opublikowane prace sugerowały udział transporterów Mg2+ w patobiologii choroby Parkinsona [18–22,55]. A1, będący kluczowym czynnikiem w homeostazie Mg komórek somatycznych, został bezpośrednio powiązany z chorobą Parkinsona [20–22]. Mutacje punktowe w A1 prowadzące do podstawień p.A350V, p.R244H i p.R285Q przypuszczalnie powiązano z PD i zakłada się, że zarówno mutacje braku funkcji, jak i utraty funkcji w A1 mają szkodliwe konsekwencje dla neuronów, tym samym przyczyniając się do fenotypu PD [20–22]. Ta praca pośrednio wskazuje na możliwość, że nie tylko zaburzenia podstawowej funkcji A1 (wymiana Na+/Mg2+), ale także epigenetyczna regulacja ekspresji (i aktywności) PM20D1 związana z A1-(rs708727) przyczyniają się do patobiologia PD.

W tym badaniu zidentyfikowaliśmy triplet genotypowy GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) jako potencjalnie znaczący klinicznie (h większy lub równy 0,5). Co ciekawe, rs708727 z genotypem GG wchodzi w skład tripletu. Jednakże w świetle wcześniejszych badań można by oczekiwać, że genotyp zawierający mniejszy allel A w rs708727 będzie powiązany z potencjalnym ryzykiem choroby Parkinsona związanym z tą trójką. Obecnie nie jesteśmy w stanie komentować żadnych interakcji molekularnych/genetycznych/epigenetycznych obejmujących SNP w trójce GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), a tym samym jakiegokolwiek domniemanego wkładu tej trójki w sumę ryzyka wystąpienia PD.

W naszym badaniu pilotażowym wykorzystaliśmy RF-ML do oceny i interpretacji naszych danych [37]. Główna zaleta analizy danych RF-ML jest dwojaka: (1) pozwala na ilościowe określenie zdolności dyskryminacyjnej SNP między pacjentami z PD a grupą kontrolną [37] oraz (2) wymaga mniejszej wielkości próbek do oceny dyskryminacyjne znaczenie poszczególnych SNP lub ich kombinacji [37]. Co więcej, RF-ML omija problem wartości p często związany z większymi próbkami, nawet jeśli są one dostępne [56]. Podobnie jak w naszym poprzednim raporcie, nie wykazano, że żaden z testowanych SNP A1 ma zdolność rozróżniania w naszej kohorcie pacjentów z PD od osób bez choroby Parkinsona (Tabela 8). Zatem możemy założyć, że żaden z testowanych SNP A1 nie nadaje się do służenia jako dyskryminator PD/nie-PD w populacji słowackiej.

Jeśli chodzi o związek A1 rs708727 ze zmienionym ryzykiem PD, wynik naszej analizy RF-ML wydaje się na pierwszy rzut oka sprzeczny (tabele 5 i 6 w porównaniu z tabelą 8). Jakobsdottir i in. w swoich analizach regresji logistycznej i krzywej ROC wykazali, że nawet silne powiązania genetyczne nie gwarantują automatycznie skutecznego rozróżniania przypadków i kontroli [57]. Pomimo tego, że są słabymi klasyfikatorami, SNP ze znaczącym OR mogą być bardzo cenne przy ustalaniu hipotez etiologicznych [57]. W naszym przypadku A1 SNP rs708727 nie ma mocy klasyfikacyjnej w odniesieniu do PD, a zatem nie ma znaczenia klinicznego. Jednakże jego słaby, ale istotny związek ze zmienionym ryzykiem PD pozwolił nam spekulować na temat udziału rs708727 w patobiologii PD w podobny lub taki sam sposób, jak w przypadku AD [27].

4. Materiały i metody

4.1. Uczestnicy badania (podstawowa charakterystyka)

W sumie do badania włączono 980 probantów (508 pacjentów z ChP i 472 osoby z grupy kontrolnej, spełniające kryteria włączające). Idiopatyczną postać choroby Parkinsona diagnozowali neurolodzy w pięciu ośrodkach diagnostycznych choroby Parkinsona (w Martinie, Bratysławie, Trenczynie, Zwoleniu i Koszycach) zgodnie z kryteriami diagnostycznymi choroby Parkinsona MDS (Movement Disorder Society). Wszyscy pacjenci byli leczeni standardową terapią anty-PD. Średni wiek pacjentów z ChP wynosił 68,4 ± 9,6 lat. Średni wiek zachorowania wynosił 61,7 ± 10,7 lat. Najmłodszy przypadek zdiagnozowano w wieku 34 lat, najstarszy – 89 lat. Grupa PD składała się z 202 kobiet (K) i 306 mężczyzn (M), zatem stosunek K:M wynosił 1:1,5.

Kohorta kontrolna probantów składała się z pacjentów zewnętrznych i wewnętrznych z Kliniki Medycyny Pracy i Toksykologii (Szpital Uniwersytecki Martin (UHM)) oraz Kliniki Neurologii (UHM). Do grupy kontrolnej włączono tylko tych pacjentów, u których wcześniej nie zdiagnozowano żadnej choroby neurodegeneracyjnej ani neuropsychiatrycznej, takiej jak cukrzyca lub osteoporoza (wszystkie choroby przypuszczalnie związane ze zmienioną ekspresją A1 i deregulacją funkcji A1). Średni wiek probantów w grupie kontrolnej wynosił 68,3 ± 11,6 lat. Grupę kontrolną stanowiło 208 kobiet i 264 mężczyzn, zatem w grupie kontrolnej stosunek F:M wyniósł 1:1,3.

Podkohorta pacjentów z PD, w której zsekwencjonowano region promotora A1, składała się z 96 losowo wybranych osób. Stosunek K:M wynosił 1:1,3 (42 kobiety i 54 mężczyźni). Średni wiek pacjentów w podkohorcie PD wynosił 67,{{10}} ± 9,5 roku. Podkohorta kontrolna składała się z 41 kobiet i 59 mężczyzn, zatem stosunek F:M wyniósł 1:1,4. Średni wiek probantów w podkohorcie kontrolnej wynosił 59,8 ± 5,0 lat.

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną na Wydziale Lekarskim Jessenius Uniwersytetu Komeńskiego (JFM CU). Dopuszczenie zostało odnotowane pod numerem identyfikacyjnym: EK 66/2019. Wszyscy uczestnicy badania podpisali formularze świadomej zgody.

4.2. Przetwarzanie próbek

Próbki krwi zebrano do probówek BD Vacutainer® traktowanych EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Genomowy DNA wyizolowano ze świeżych (UHM) lub zamrożonych próbek krwi (inne ośrodki PD) przy użyciu zestawu Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Maddison, WI, USA) zgodnie z protokołem producenta. Wyizolowane próbki DNA przechowywano w temperaturze -80°C.

4.3. Genotypowanie

Genotypowanie przeprowadzono na 358 próbkach PD i 352 próbkach kontrolnych. Wyniki tych eksperymentów analizowano razem z wynikami wcześniej zgłoszonymi przez Cibulka i in. [37]. SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 analizowano przy użyciu sond genotypujących TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 i C_9238453_10/rs708727 (wszystkie Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA) w taki sam sposób, jak podano wcześniej [37].

4.4. Sekwencjonowanie Sangera

Region promotora podzielono na cztery nakładające się fragmenty/amplikony, ponieważ był zbyt długi dla pojedynczego przebiegu sekwencjonowania. Przed sekwencjonowaniem regiony docelowe amplifikowano. Startery zaprojektowano przy użyciu narzędzia internetowego Primer3Plus [https://primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (dostęp: 3 maja 2018 r.)]. Każdą parę starterów sprawdzono pod kątem obecności wielu produktów amplifikacji za pomocą internetowego narzędzia PCR UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (dostęp: 3 maja 2018 r.)].

Startery i programy PCR użyte do amplifikacji czterech fragmentów podsumowano w dodatkowych tabelach S1 i S2. Kompozycje mastermiksów dla każdego fragmentu podsumowano w SA3. Fragmenty 3 i 4 charakteryzują się dużą zawartością nukleotydów G i C (odpowiednio 67,4% i 71,9%). Wydajność reakcji zwiększono przez dodanie 10 x GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estonia). Produkt PCR oczyszczono przy użyciu żelu NucleoSpinTM i zestawu PCR Clean-up (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Niemcy). W kolejnym etapie oczyszczony produkt PCR rozcieńczono do odpowiedniego stężenia do wstępnego sekwencjonowania PCR (SA4, SA5). We wstępnym sekwencjonowaniu PCR stosowano wyłącznie startery do przodu (fw). Mieszanka reakcyjna zawierała także BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) i dideoksynukleotydy.

W rezultacie otrzymaliśmy mieszaninę produktów o różnej wielkości zakończonych dideoksynukleotydami oznaczonymi fluorescencją. Produkty następnie oczyszczono przy użyciu zestawu SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zgodnie z protokołem producenta. Objętość 3 µl oczyszczonego produktu przeniesiono do płytki z 96-studzienkami razem z 12 µl wysokiej jakości dejonizowanego formamidu (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Mieszaninę denaturowano przez 5 minut w temperaturze 95°C w termocyklerze. Fragmenty rozdzielono na 8-urządzeniu mikrokapilarnym ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Sekwencje wyeksportowano i wizualizowano za pomocą oprogramowania Chromas (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Australia). Pliki FASTA przesłano do BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) i dopasowano do referencyjnego ludzkiego genomu (wersja GRCh38.p12).

Przewidywania miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych i ich zmian dokonano za pomocą narzędzia internetowego ConSite [dostępnego pod adresem: http://consite.genereg.net/ (dostęp: 3 września 2020 r.)] [38]. Pobrano sekwencje z allelem głównym i allelem mniejszym i wygenerowano widma czynników transkrypcyjnych (TF). Analizę przeprowadzono bez wcześniejszego ustalenia minimalnej specyficzności. Zmiany w profilach wiązania TF w oparciu o obecność wariantów podsumowano w Tabeli 2.

4,5. Analiza RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych).

Składniki mieszaniny reakcyjnej i warunki PCR amplifikowanej reakcji PCR podsumowano w SA6 i SA7. Do zaprojektowania ograniczeń amplikonów wykorzystano internetowe narzędzie in silico NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (dostęp: 14 lutego 2020 r.)]. Do analizy RFLP wybrano następujące enzymy restrykcyjne: Hpy166II (wykrywanie rs9438393), NIaIII (wykrywanie rs56152218) i BmrI (wykrywanie rs61822602). Wszystkie enzymy zakupiono od New England Biolabs. Dla wariantu rs144056491 nie byliśmy w stanie zaprojektować eksperymentu RFLP, ponieważ nie był dostępny odpowiedni enzym. Po ograniczeniu spodziewaliśmy się, że fragmenty podsumowane w SA8 utworzą wydajność. Po restrykcji produkty rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (NIaIII i Hpy166II 1% żel; BmrI 2% żel), a następnie wizualizowano na instrumencie PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Określono genotypy dla każdego SNV.

4.6. Analiza danych

Dane zbadano i przeanalizowano za pomocą R [R Core Team (2021); R: język i środowisko obliczeń statystycznych. R Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria. Adres URL https://www.R-project.org/, wer. 4.0.5 (2021-03-31)]. Badanie asocjacji genetycznych (GAS) i analizę mocy przeprowadzono przy użyciu bibliotek R HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Odkrywanie dialllelicznych markerów genetycznych: pakiet HardyWeinberga. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli i in. (2021); DescTools: Narzędzia do statystyk opisowych. Wersja pakietu R 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Narzędzia epidemiologiczne. Wersja pakietu R 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Podstawowe funkcje analizy mocy. Wersja pakietu R 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] i samodzielnie opracowany kod. Modelowanie predykcyjne RandomForest przeprowadzono przy użyciu biblioteki R randomForestSRC [Ishwaran H. i Kogalur UB (2021); Szybkie ujednolicone lasy losowe do przetrwania, regresji i klasyfikacji (RF-SRC), wersja pakietu R 2.11.0.]. Dane wizualizowano za pomocą biblioteki R beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: Fabuła roju pszczół, alternatywa dla Stripcharta. Wersja pakietu R 0.3.1. Adres URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Do przetestowania hipotezy zerowej o równości średniego wieku zachorowania w populacji dla trzech subpopulacji genotypów dla każdego SNP zastosowano jednoczynnikową analizę ANOVA. Wyniki z wartością p poniżej 0,05 uznano za istotne statystycznie.

5. Wnioski

Podsumowując, nasze dane sugerują słabe, ale znaczące powiązanie A1 SNP rs708727 z PD w dominujących i nadmiernie dominujących modelach genetycznych w populacji słowackiej. Żaden z pozostałych testowanych SNP A1 (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 i rs61822602) nie był powiązany z chorobą w żadnym z testowanych modeli genetycznych. Analizy RF-ML wykazały, że wszystkie testowane SNP A1 są słabymi klasyfikatorami/prognozami PD, dlatego ich zastosowanie w praktyce klinicznej jako markerów diagnostycznych lub prognostycznych pozostaje znikome. Jednakże powiązanie rs708727 z chorobą Parkinsona pozwoliło nam spekulować, że allel drugorzędny (G > A) związany z ryzykiem choroby Parkinsona w rs708727 przyczynia się do wystąpienia i postępu choroby poprzez zaburzenie epigenetycznej regulacji ekspresji PM20D1 – mechanizmu, o którym wiadomo, że odgrywa rolę w patobiologii AD. Hipotezę tę należy dokładniej zbadać, aby sformułować rozstrzygające stwierdzenie. Ponadto należy wyjaśnić możliwy związek między otępieniem związanym z chorobą Parkinsona a rs708727.

Autorskie Wkłady:

Konceptualizacja, MK; metodologia, MK, MC, MG (Marian Grendar) i MB; oprogramowanie, MG (Marian Grendar); walidacja, MC, MB i MK; analiza formalna, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS i MG (Milan Grofik); dochodzenie, MC i MB; weryfikacja danych, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN i EK; pisanie – przygotowanie projektu oryginalnego, MK; pisanie – recenzja i redakcja, MC, MG (Marian Grendar) i ZP; wizualizacja, MK, MC i MG (Marian Grendar); nadzór, MK; administracja projektami, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS i BV; pozyskanie środków finansowych, MK Wszyscy autorzy przeczytali i zgodzili się z opublikowaną wersją manuskryptu.

Finansowanie:

Praca ta była wspierana przez Słowacką Agencję Badań i Rozwoju, grant nr APVV-19-0222 oraz Agencję Grantów Naukowych Ministerstwa Edukacji, Nauki, Badań i Sportu Republiki Słowackiej oraz Słowackiej Akademii Nauk, grant nr VEGA 1/0554/19, oba do MK

Oświadczenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej:

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną na Wydziale Lekarskim Jessenius Uniwersytetu Komeńskiego (JFM CU). Zatwierdzenie zostało zarejestrowane pod numerem identyfikacyjnym: EK 66/2019.

Oświadczenie o świadomej zgodzie:

Od wszystkich osób biorących udział w badaniu uzyskano świadomą zgodę.

Oświadczenie o dostępności danych:

Pełny zestaw danych znajduje się w artykule. Charakter i zakres uwzględnionych danych pozwala na dalszą metaanalizę. Wszelkie informacje dotyczące badania można uzyskać na żądanie od odpowiedniego autora.

Podziękowanie:

Dziękujemy wszystkim uczestnikom badania i członkom ich rodzin. Dziękujemy także Martinowi Marakowi (JFM CU) za jego kompetentne wsparcie techniczne projektu, Janowi Radvanszky'emu i Rastislavowi Hekelowi (obaj GENETON sro) za pomocne rady dotyczące analiz promotora A1 oraz Theresie Jones za redakcję językową rękopis.

Konflikt interesów:

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Bibliografia

1. Tatarkowa, Z.; de Baaij, JHF; Grendara, M.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Sponder, G.; Hoenderop, JGJ; Röntgen, M.; Turcanova Koprusakova, M.; i in. Spożycie Mg2+ w diecie i wymiennik Na+/Mg2+ SLC41A1 wpływają na składniki energii mitochondrialnej w kardiomiocytach mysich. Wewnętrzne J. Mol. Nauka. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Yamanaka, R.; Tabata, S.; Shindo, Y.; Hotta, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; OK, K. Homeostaza mitochondrialna Mg2+ decyduje o metabolizmie energii komórkowej i podatności na stres. Nauka. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudev, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Jak rodzime i obce kationy metali wiążą ATP: implikacje dla litu jako środka terapeutycznego. Nauka. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolisek, M.; Zsurka, G.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p jest zasadniczym składnikiem głównego elektroforetycznego systemu napływu Mg2+ do mitochondriów. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Schindl, R.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p tworzy w mitochondriach selektywny kanał Mg2+. Biofizyka. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolisek, M.; Sponder, G.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Tatarkowa, Z.; Werner, T.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: krytyczne kompendium bieżących badań nad komórkowymi transporterami Mg2+ innymi niż TRPM6/7. Ks. Physiol. Biochemia. Farmakol. 2019, 176, 65–105. [Odniesienie]

7. Kubota T.; Shindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Kudo, S.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; OK, K. Mitochondria to wewnątrzkomórkowe magazyny magnezu: badanie poprzez jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne w komórkach PC12. Biochim. Biofizyka. Acta 2005, 1744, 19–28. [Odniesienie]

8. Sponder, G.; Abdulhanan, N.; Fröhlich, N.; Mastrototaro, L.; Aschenbach, JR; Röntgen, M.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolisek, M. Nadekspresja wymiennika Na+/Mg2+ SLC41A1 osłabia sygnalizację sprzyjającą przeżyciu. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Yamaguchi, H.; Wang, HG Kinaza białkowa PKB/Akt reguluje przeżycie komórek i apoptozę poprzez hamowanie zmian konformacyjnych Bax. Onkogene 2001, 20, 7779–7786. [Odniesienie]

10. Vauzour, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Williamsa, RJ; Spencer, JP Aktywacja szlaków sygnałowych sprzyjających przetrwaniu Akt i ERK1/2 leży u podstaw antyapoptotycznego działania flawanonów w neuronach korowych. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [Odniesienie]

11. Muddapu, wirtualna rzeczywistość; Dharshini, SAP; Chakravarthy, VS; Gromiha, MM Choroby neurodegeneracyjne — czy przyczyną jest niedobór metaboliczny? Przód. Neurologia. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pathak, D.; Berthet, A.; Nakamura, K. Niedobór energii: czy przyczynia się do neurodegeneracji? Anna. Neurol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharshini, SAP; Taguchi, YH; Gromiha, MM Badanie kryzysu energetycznego w chorobie Alzheimera za pomocą badania transkryptomu. Nauka. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Twig, G.; Shirihai, OS Wzajemne oddziaływanie dynamiki mitochondriów i mitofagii. Przeciwutleniacz. Sygnał Redox. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Zhang, W.; Mam, H.; Yang, M. NIPA2 reguluje funkcję osteoblastów poprzez modulację mitofagii w osteoporozie w cukrzycy typu 2. Nauka. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadler, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokes, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; i in. LTRPC7 to Mg. Regulowany przez ATP kanał kationów dwuwartościowych wymagany do żywotności komórek. Natura 2001, 411, 590–595. [Odniesienie]

17. Kolisek, M.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Ludzki gen SLC41A1 koduje wymiennik Na+/Mg2+. Jestem. J. Physiol. Fizjoterapia komórkowa. 2012, 302, C318–C326. [Odniesienie]

For more information:1950477648nn@gmail.com