Etanolowy ekstrakt z nasion Cucurbita Pepo L. modyfikuje zaburzenia neuroendokrynne u szczurów zestresowanych przewlekle i ekspresję markerów stanu zapalnego w nadnerczach i HSP70

1 Wydział Nauk Podstawowych, College of Medicine, Uniwersytet Księżnej Nourah Bint Abdulrahman (PNU), Rijad, Arabia Saudyjska,

2 Katedra Histologii Medycznej i Biologii Komórki Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Mansoura, Mansoura, Egipt,

3 Katedra Histologii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Menoufifia, Shebin El-Koum, Egipt,

4 Wydział Podstawowych Nauk Medycznych, Unaizah College of Medicine and Medical Sciences, Qassim University, Buraydah, Arabia Saudyjska,

5 Wydział Nauk Biologicznych, Wydział Nauk, King Abdulaziz University, Jeddah, Arabia Saudyjska,

6Katedra Medycznej Technologii Laboratoryjnej, Wydział Stosowanych Nauk Medycznych, University of Tabuk, Tabuk, Arabia Saudyjska,

7 Wydział Biochemii, Wydział Nauk, Uniwersytet Króla Abdulaziza, Dżudda, Arabia Saudyjska,

8Katedra Histologii i Biologii Komórki Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Assuit, Asjut, Egipt,

9Yousef Abdullatif Jameel Chair of Prophetic Medical Applications (YAJCPMA), Wydział Lekarski, King Abdulaziz University, Dżudda, Arabia Saudyjska,

10 Klinika Hematologii/Onkologii Dziecięcej, Szpital Uniwersytecki Króla Abdulaziza (KAUH), Wydział Lekarski, Uniwersytet Króla Abdulaziza, Dżudda, Arabia Saudyjska,

11 Zakład Histologii Medycznej Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Damietta, Damietta, Egipt

Więcej informacji: ali.ma@wecistanche.com

Tło:Opisano, że dynie (Cucurbita pepo L.) mają działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwzmęczeniowe i przeciwdepresyjne. Thenadnerczejest ważnym organem reagującym na stres, który utrzymuje homeostazę podczas stresu.

Cele:Niniejsze badanie miało na celu ocenę skuteczności podawania CucurbitaEkstrakt pepo L. (CP) w łagodzeniu zmian behawioralnych, biochemicznych i strukturalnych wnadnerczewywołane ekspozycją na przewlekły, nieprzewidywalny, łagodny stres (CUMS) oraz zbadanie mechanizmu tego wpływu. Materiały i metody: Czterdzieści samców szczurów albinosów podzielono na 4 grupy (n-10): kontrolę, CUMS, grupy leczone fluoksetyną i grupy leczone CP. Pod koniec eksperymentu w surowicy oceniono zmiany behawioralne, poziom kortykosteronu, prozapalne cytokiny TNF- i IL-6 oraz profil oksydacyjny/antyoksydacyjny.Nadnerkowygruczoły poddano obróbce w celu oceny histopatologicznej i immunohistochemicznej. Ekspresję genów kaspazy -3 i Ki67 oraz białka szoku cieplnego 70 (HSP70) oceniano w nadnerczach za pomocą RT-PCR.

Wyniki:Ekstrakt CP znacząco obniżył poziom kortykosteronu (p < 0.001),czas bezruchu (p < 0.001)="" oraz="" zmiany="" zapalne="" i="" oksydacyjne="" związane="" z="" depresją="" wywołaną="" cums="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" nieleczoną.="" ekstrakt="" z="" cp="" złagodził="" wywołane="" przez="">nadnerkowyzmiany histopatologiczne i znacząco obniżyły apoptozę (p < 0.001) i znacząco podwyższyły poziomy antyoksydantów w surowicy.

Słowa kluczowe:dynia, stres, depresja, kaspaza-3, ki67, Hsp70, apoptoza

Kliknij, aby uzyskać dawkę cistanche tubulosa na nadnercza

WPROWADZANIE

Ponad 264 miliony ludzi w każdym wieku cierpi na depresję na całym świecie (WHO, 2020). Wyniki osoby z depresją są na ogół słabe w szkole, w pracy iw rodzinie. Depresja może prowadzić do samobójstwa; dlatego jest uważany za drugą najczęstszą przyczynę zgonu u 15- do 29-latków (WHO, 2020). Ssaki mogą przetrwać stresujące zdarzenia poprzez aktywację odpowiednich reakcji fizjologicznych na te zdarzenia. Nadnercza są częścią osi podwzgórze-przysadka-kortyka nadnerczy (HPA) oraz osi współczująco-rdzeniowo-nadnerczowej, która utrzymuje homeostazę podczas stresu (Ulrich-Lai i wsp., 2006). Doniesiono, że ekspozycja na stres termiczny powoduje szybką ekspresję HSP70 w korze nadnerczy (Huang i wsp., 2001). Białka te mają wspólne przemieszczanie wewnątrzkomórkowe, prezentację antygenu, apoptozę i wiele innych działań (Khar et al., 2001). Opisano, że hormony egzogenne lub interferencja z hormonami endogennymi, podczas krytycznych okresów rozwoju, mogą mieć trwały wpływ na ścieżki fizjologiczne i behawioralne regulowane przez obwody neuroendokrynne podwzgórza (Gore i Patisaul, 2010). Opisano również zaburzenia neuroendokrynne w celu rozszerzenia pojęcia zaburzeń endokrynnych na pełny zakres fizjologii integracyjnej; dlatego jest to coś więcej niż zaburzenia hormonalne (Waye i Trudeau, 2011). Zmiany w regulacji neuroendokrynnej, metabolizmie i diecie/mikrobiocie są uważane za wyzwalacze zapalenia i predyspozycje do rozwoju depresji (Huang i wsp., 2019). Postulowano, że depresja – jedno z zaburzeń neuropsychiatrycznych – i zapalenie mają związek dwukierunkowy. Podczas gdy depresja sprzyja reakcjom zapalnym, stan zapalny sprzyja zaburzeniom neuropsychiatrycznym, w tym depresji (Bauer i Teixeira, 2019). Fluoksetyna, klasyczny antydepresant, jest jednym z dostępnych na rynku leków stosowanych w leczeniu depresji. Obecnie jest uważany za nowy czynnik zaburzający układ neuroendokrynny.

Ten efekt fluoksetyny jest raczej efektem ubocznym niż głównym celem terapeutycznym u ssaków (León-Olea i in., 2014). Dlatego istnieje zapotrzebowanie na bezpieczniejsze leki przeciwdepresyjne bez skutków ubocznych na stan neuroendokrynny. Dynie (Cucurbita pepo L.) to ważne gospodarczo gatunki uprawiane na całym świecie. Przynoszą korzyści odżywcze i zdrowotne, ponieważ są bogate w fenole, flawonoidy, aminokwasy, węglowodany i witaminy (Wang i wsp., 2002). Kilka badań naukowych wykazało, że dynie mają rozległą aktywność biologiczną, taką jak działanie przeciwcukrzycowe, przeciwnowotworowe, przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwzmęczeniowe i przeciwdepresyjne (Wang i in., 2012; Zhang i in., 2012; Nawirska-Olszańska i in. in., 2013; Kim Nr i in., 2016). Medycyna tradycyjna, głównie systemy ajurwedyjskie i medycyna chińska, wykorzystywały różne części dyni, w tym miąższ owoców i nasion (Perez Gutierrez, 2016). Skuteczność przeciwdepresyjna Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) i Cucurbita moschata Duch została wcześniej przetestowana w badaniu in vivo przy użyciu zwierzęcego modelu depresji wywołanego testem wymuszonego pływania (FST) i porównana z fluoksetyną (Kim Nr et al., 2016). . W jednym ze stosunkowo niedawnych przeglądów podsumowano, że żywność antydepresyjna, taka jak pestki dyni, ma 47% punktację antydepresyjną, zapewniając działanie podobne do antydepresyjnych (Lachance i Ramsey, 2018). Niedawno Dotto i Chacha poparły prowadzenie większej liczby badań na zwierzętach i badaniach klinicznych, aby potwierdzić łagodzący wpływ nasion dyni na depresję (Dotto i Chacha, 2020). Raporty te zachęcały do ​​przetestowania skuteczności dyni w łagodzeniu wpływu przewlekłego stresu na nadnercza. Dlatego niniejsze badanie przeprowadzono w celu oceny wpływu doustnego podawania ekstraktu z Cucurbita pepo L. (CP) na łagodzenie przewlekłego nieprzewidywalnego łagodnego stresu (CUMS) wywołanego przez behawioralną, biochemiczną i strukturę nadnerczy oraz zbadanie mechanizmu tego wpływu .

MATERIAŁY I METODY

Ekstrakcja i dawkowanie dyni

Cucurbita pepo L. (okaz kuponu: AQJ_95) została zakupiona na lokalnym targu w Dżuddzie w Arabii Saudyjskiej. Zostały one zidentyfikowane w zielniku King Abdulaziz University przy użyciu okazów zielnika i flory KSA (Chaudhary, 2001). W zielniku zdeponowano okazy bonów. CP został zidentyfikowany przez autorów i zweryfikowany przez botanika z Wydziału Nauk Uniwersytetu Króla Abdulaziza. Ekstrakcja CP została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszymi badaniami (Wang i in., 2012). Surowe owoce ze skórką pokrojono za pomocą krajalnicy i osuszono za pomocą liofilizatora (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Korea), a następnie rozdrobniono za pomocą elektrycznej szlifierki. Proszek przepuszczono przez sito 40-siatkowe, aby uzyskać drobny proszek i przechowywano w hermetycznym pojemniku. Wysuszony proszek (50 g) zmieszano z 450 ml 80% etanolu i pozostawiono na 1 dzień w 37°C w wytrząsarce (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact Shaking Incubator., Korea) i następnie filtrowano bawełną i bibułą filtracyjną drugiego dnia. Ten proces ekstrakcji powtórzono dwukrotnie w temperaturze 37 stopni, aby uzyskać ekstrakt etanolowy.

Identyfikacja składników CP

Skład chemiczny PE analizowano za pomocą spektrometru masowego GC-TSQ Evo 8000 (Thermo Scientific, Austin, TX, Stany Zjednoczone) z bezpośrednią kolumną kapilarną TG-5MS ( 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm grubości folii). Temperaturę pieca kolumnowego początkowo ustawiono na 50 stopni, a następnie zwiększono o 5 stopni C/min do 250 stopni C i utrzymywano przez 2 minuty, a następnie zwiększono do końcowej temperatury 300 stopni o 25 stopni/min i utrzymywano przez 2 minuty. Temperatury wtryskiwacza i linii przesyłowej MS utrzymywano odpowiednio na poziomie 270 i 260 stopni C; Jako gaz nośny zastosowano hel przy stałym natężeniu przepływu 1 ml/min. Opóźnienie rozpuszczalnika wynosiło 4 min, a rozcieńczone próbki o objętości 3 µl wstrzykiwano automatycznie przy użyciu Autosampler AS1300 sprzężonego z GC w trybie splitless we wstrzykiwaczu PTV. Widma masowe EI zebrano przy napięciach jonizacji 70 eV w zakresie m/z 50–650 w trybie pełnego skanowania. Temperaturę źródła jonów ustawiono na 250 stopni. Składniki zostały zidentyfikowane przez porównanie ich widm masowych z widmami masowymi bazy danych WILEY 09 i NIST 14, które są wykorzystywane do identyfikacji i badania składu chemicznego nieznanych składników w dowolnym ekstrakcie (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analizę przeprowadzono w typie jakościowym przy użyciu oprogramowania Thermo Scientifific™ Xcalibur™ 2.2, a wszystkie wartości podano w procentach względnych (Abd El-Kareem et al., 2016).

Projekt eksperymentalny

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań Biomedycznych na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu Króla Abdulaziz w Jeddah, KSA (numer referencyjny {{0}}). W tym badaniu z King Fahd Medical Research Center (KFMRC) uzyskano czterdzieści samców szczurów albinosów o wadze 150-200 gi w wieku 2-3 miesięcy. Przed rozpoczęciem eksperymentu szczury pozostawiono na 1 tydzień do zaaklimatyzowania się w warunkach laboratoryjnych. Dziesięć szczurów przydzielono jako grupę kontrolną, która nie została wystawiona na CUMS. Pozostałe trzydzieści szczurów poddano procedurze CUMS przez 4 tygodnie, która obejmowała różne rodzaje stresorów o różnych porach dnia, aby zapobiec przyzwyczajeniu się do stresu. Procedura CUMS została w pełni opisana we wcześniejszych pracach (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) i została przedstawiona w Tabeli 1. Szczury poddane działaniu CUMS podzielono na 3 grupy (n 10). Grupa nietraktowana (CUMS) otrzymywała nośnik 0,03 procent karboksymetylocelulozy (CMC-Na) przez zgłębnik przez 2 tygodnie. Grupa leczona FLU otrzymała FLU (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Amman, Jordan), antydepresant stosowany do walidacji farmakologicznej, rozpuszczony w CMC-Na 0,03 procent w dawce 20 mg/kg przez zgłębnik żołądkowy (Li i in., 2014). Grupa traktowana CP otrzymywała ekstrakt CP rozpuszczony w wodzie destylowanej w dawce 100 mg/kg przez zgłębnik przez 2 tygodnie według Wang et al. (2012).

Ocena zmian behawioralnych

FST przeprowadzono po 4 tygodniach, aby potwierdzić wpływ CUMS na szczury (Ali i wsp., 2017). Podczas tego testu, każdego szczura umieszczono w szklanym cylindrycznym pojemniku (wysokość 20 cm, średnica 14 cm) z 15 cm wody w temperaturze 25 ± 2 stopnie C. Szczura nagrywano na 6 minut przy użyciu oprogramowania behawioralnego (Noldus Information Technology, EthoVision XT®), a całkowity czas spędzony w bezruchu podczas 6 minut mierzył technik niewidzący grup doświadczalnych. Całkowity czas, w sekundach, spędzony przez szczury bez ruchu kończyn, z wyjątkiem niewielkiego ruchu koniecznego do utrzymania myszy na powierzchni, określono „czas bezruchu” w ciągu 6 minut.

Techniki biochemiczne

Dwadzieścia cztery godziny po zakończeniu testu behawioralnego pobrano próbki krwi z zatoki oczodołowej szczurów po znieczuleniu 4% izofluranem (SEDICO Pharmaceuticals Company, Kair, Egipt) w 100% tlenie. Następnie szczury uśmiercono przez zwichnięcie szyjki macicy. Próbki krwi wirowano przy 3,000 obr./min przez 15 min w 4 stopniach C w celu uzyskania surowicy i trzymano w -18 stopniach C do oceny biochemicznej. Poziom kortykosteronu (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Stany Zjednoczone) oceniano za pomocą zestawów do testów immunoenzymatycznych, zgodnie z instrukcjami producenta. Zgodnie z instrukcjami producenta, TNF- i IL-6 (system Quantakin R&D, zestaw USA) oceniano przy użyciu testu immunoenzymatycznego. Gęstość optyczną każdej próbki określono w dwóch powtórzeniach za pomocą mikropłytkowego czytnika ELISA ustawionego na 450 nm. Zestaw testowy substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) (Biodiagnostic; Egipt) został wykorzystany do pomiaru poziomu dialdehydu malonowego (MDA) spektrofotometrycznie przy 535 nm (Gamal et al., 2018). Poziom dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) mierzono za pomocą zestawu testowego SOD (Biodiagnostic; Egipt) (Packer, 2002). Ocenę poziomu peroksydazy glutationowej (GPX) przeprowadzono przy użyciu zestawu GPX (Randox Labs, Crumlin, Wielka Brytania). W celu ilościowego określenia aktywności katalazy (CAT) sporządzono krzywą kalibracyjną dla testu i wszystkich próbek, stosując zestawy testowe (Biodiagnostic; Egipt). Metoda została wcześniej opisana (Gamal et al., 2018).

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

Ekstrakcję RNA z próbek tkanek przeprowadzono przy użyciu odczynnika TriFast™ (PeqLab, Niemcy, nr kat.: {{0}}), jak opisano w protokole producenta. Stężenie oczyszczonego RNA oszacowano przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Stany Zjednoczone). Wyekstrahowany RNA z każdej próbki poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu do syntezy cDNA SensiFAST™ do RT-qPCR (Bioline USA Inc., Stany Zjednoczone, nr kat.: BIO-65053), zgodnie z instrukcjami producenta. Zsyntetyzowany cDNA przechowywano w stopniu -80 aż do wykorzystania w qRT-PCR. Reakcje qRT-PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline USA Inc., Stany Zjednoczone, nr kat.: BIO-94002) ​​w systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems 7500 (technologia Life , Stany Zjednoczone). Specyficzne dla genów startery dla szczurów, użyte w tym badaniu, zaprojektowano za pomocą oprogramowania Primer3 (v.0.4.0), a ich specyficzność sprawdzono przy użyciu programu NCBI/Primer-BLAST. Startery zakupiono następnie w Willowfort™ (Wielka Brytania). Starterami były GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGC ATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspaza-3 (forward 5- TGT ATGCTTACTCTACCGCACCCG-3, odwróć 5-GGCCAAGT GACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGG GCAAG-3′, 5′-CTTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′). Ki67 (do przodu 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, do tyłu 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). Mieszaninę PCR przygotowano w następujący sposób: 10 µl mieszaniny SensiFAST™ SYBR Lo-ROX, 0,8 µl startera przedniego, 0,8 µl startera wstecznego, 2 µl matrycy cDNA i 6,4 µl wody wolnej od nukleaz. Mieszanina reakcyjna została przeniesiona do termocyklera, który wcześniej zaprogramowano na utrzymywanie temperatury 95 stopni przez 2 min, następnie 40 cykli 95 stopni przez 15 s, a następnie 60 stopni przez 30 s. W każdym eksperymencie prowadzono reakcję kontroli negatywnej bez matrycy. Przeprowadzono analizę krzywych topnienia, aby udowodnić specyficzność produktów PCR, a wartość Ct dla każdej reakcji uzyskano z wykresów amplifikacji. Względną ocenę ilościową dla każdej ekspresji genu w próbkach tkanek obliczono stosując metodę progu porównawczego (ΔΔCt) z GAPDH jako genem kontroli wewnętrznej. Dla całkowitej krotności zmiany obliczono ją i zlinearyzowano za pomocą wzoru arytmetycznego 2−ΔΔCt.

Techniki histologiczne

Pod koniec eksperymentu i po znieczuleniu szczurów otwarto brzuch i wycięto prawe nadnercze. W celu uzyskania bloków parafinowych przeprowadzono utrwalanie nadnercza w 10 procentach obojętnej buforowanej formaliny i dalsze procesy. Skrawki parafinowe o grubości 4- μm przygotowano i barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E). Ponadto inne skrawki parafinowe barwiono immunohistochemicznie przy użyciu techniki streptawidyna-biotyna-peroksydaza. Szkiełka inkubowano przez noc w 4 stopniach, a następnie inkubowano je z monoklonalnym przeciwciałem anty-Ki67 (Dako Cytomation, Stany Zjednoczone, w rozcieńczeniu 1:1, 000) ​​w celu wykazania proliferacji komórek. Ponadto do wykrywania apoptozy zastosowano poliklonalne przeciwciało przeciw kaspazie-3 (Santa Cruz Biotechnology, Stany Zjednoczone, w rozcieńczeniu 1:1,000). Wykorzystano także przeciwciało poliklonalne przeciwko białku szoku cieplnego -70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Stany Zjednoczone, w rozcieńczeniu 1:1,000). Zastosowano odpowiednie biotynylowane skoniugowane drugorzędowe przeciwciało z systemu barwienia Dako. Szkiełka wybarwione tylko drugorzędowym przeciwciałem zastosowano jako kontrole negatywne. Jądra wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Za reakcję dodatnią uznano brązowe barwienie cytoplazmatyczne. Zabarwione skrawki zbadano i sfotografowano za pomocą Olympus Microscope BX-51 (Olympus) połączonego z aparatem cyfrowym i komputerem. Półilościową analizę immunoreaktywności przeciwciał przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu Pro Plus. Procentową powierzchnię reakcji immunopozytywnej oceniano w 30 polach przy powiększeniu ×400. Komórki dodatnie zliczano na 1,0 mm2 powierzchni, jak opisali Zhou i in. (2016). Zbadano co najmniej pięć pól z każdego szkiełka i obliczono średnią dla każdego zwierzęcia. Do analizy morfometrycznej u każdego zwierzęcia zbadano cztery skrawki (powiększenie x100). Grubość poszczególnych stref nadnerczy mierzono w mikrometrach. Grubość kory nadnerczy uzyskano mierząc odległość między rdzeniem a torebką nadnercza w linii prostej, po jednym pomiarze w każdym kwadrancie kory nadnerczy.

Analiza statystyczna

WYNIKI

Wyniki behawioralne

Wyniki analizy ekstraktu CP przy użyciu GC-MS

Ocena biochemiczna

Poziom kortykosteronu w surowicy

Poziom kortykosteronu znacznie wzrósł (p < {{0}}.001) u nieleczonych szczurów narażonych na CUMS w porównaniu ze szczurami kontrolnymi, podczas gdy te leczone FLU i CP wykazały znaczące zmniejszenie (p < 0,001) poziom kortykosteronu w surowicy.

Poziomy TNF i IL-6 w surowicy

Poziomy MDA, SOD, GPX i CAT w surowicy

Ekspresja genów Ki67, kaspazy-3 i HSP70

RT-PCR ujawniła nieistotnie wysoką ekspresję genu Ki67 w nadnerczach w grupie CUMS w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy w grupach leczonych FLU i CP wykazano istotnie wysoką ekspresję w porównaniu z grupą eksponowaną na CUMS (Figura 3E). . W odniesieniu do kaspazy-3 ekspresja jej genu była istotnie zwiększona (p < 0.001)="" w="" nadnerczach="" w="" grupie="" cums="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" kontrolną,="" podczas="" gdy="" w="" grupie="" flu-="" i="" grupy="" leczone="" cp="" wykazały="" znaczący="" spadek="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" eksponowaną="" na="" cums="" (rysunek="" 3f="" jeśli="" chodzi="" o="" ekspresję="" genu="" hsp70,="" zanotowano="" znacznie="" wyższy="" (p="">< 0,001)="" poziom="" w="" nadnerczach="" w="" grupie="" cums="" niż="" w="" grupie="" grupa="" kontrolna,="" podczas="" gdy="" grupa="" leczona="" flu="" i="" cp="" wykazała="" nieznaczny="" spadek="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" eksponowaną="" na="" cums="" (rysunek="">

Ocena histopatologiczna

DYSKUSJA

Współczesne społeczeństwo jest oczywiście pełne stresu, który może wynikać z codziennych problemów, opieki zdrowotnej i kwestii związanych z pracą. Stresory te mogą powodować tak zwane zaburzenia związane ze stresem (Clayton i McCance, 2014). W tym badaniu etanolowy ekstrakt z miąższu i skórki Cucurbita pepo L. został wykorzystany do zbadania jego potencjału w łagodzeniu zachowań depresyjnych wywołanych przez CUMS i jego wpływu na nadnercza. Udowodnił to m.in

znaczny wzrost poziomu kortykosteronu w surowicy i potwierdzony przez wydłużony czas bezruchu podczas FST. Wyniki te były zgodne z wcześniej opisanymi (Tang i in., 2015). Stwierdzono, że zarówno TNF-, jak i IL-6 są zaangażowane w patogenezę depresji (Taraz i wsp., 2015; Pedraz-Petrozzi i wsp., 2020). Doniesiono, że myszy z niedoborem receptorów IL-6 lub TNF są odporne na zachowania depresyjne (Viana et al., 2010). W związku z tym zostały one ocenione w tym badaniu i zaobserwowano, że zarówno TNF- jak i IL-6 były znacząco podwyższone w surowicy szczurów narażonych na CUMS przez 4 tygodnie, co wskazuje na depresję. To odkrycie poparli Numakawa i in. (2014) u myszy z behawioralną rozpaczą oraz przez Taraz et al. (2015) u pacjentów z depresją. W tym badaniu podawanie ekstraktu z dyni było związane z łagodzeniem zachowań depresyjnych, co widoczne jest poprzez istotne skrócenie czasu bezruchu FST i potwierdzone przez istotne zmniejszenie kortykosteronu i cytokin zapalnych TNF- i IL-6 w serum. Wyniki te poparli Kim Nr i in. (2016), którzy stwierdzili, że SSP przez 28 dni obniżył poziom zapalnych cytokin u szczurów z depresją.

Działanie przeciwzapalne dyni można przypisać aktywnym związkom dyni, takim jak kwas oleinowy i palmitynowy oraz estradiol. W przypadku depresji opisano zmniejszenie stężenia kwasu oleinowego, palmitynowego i linolowego (Conklin i wsp., 2010; Martín i wsp., 2010). Doniesiono, że neuroprotekcja, w której pośredniczy kwas oleinowy, jest powiązana z jego działaniem przeciwzapalnym, w którym pośredniczy aktywacja receptora gamma aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPAR-) (Song i wsp., 2019). Ponadto stwierdzono, że kwas palmitynowy hamuje fosfolipazę A(2) i dlatego jest uważany za związek przeciwzapalny (Aparna i wsp., 2012). Estradiol był jednym ze związków dyni wykrytych w tym badaniu. Doniesiono, że estradiol indukuje działanie przeciwzapalne, a następnie łagodzi zachowania depresyjne (Xu i wsp., 2015). Innym mechanizmem, za pomocą którego estradiol może indukować działanie przeciwdepresyjne, jest zwiększenie ekspresji neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) i fosforylacji ERK poprzez aktywację ER- w mózgu (Yang i wsp., 2010). W tym badaniu poziom MDA w surowicy był podwyższony, podczas gdy poziomy SOD, GPX i CAT były obniżone u szczurów eksponowanych na CUMS. Podobne zmiany udokumentowano po ekspozycji na CUMS w poprzednich badaniach i dodali, że te zmiany biochemiczne spowodowały stres oksydacyjny i upośledzenie HPA (Nabavi i in., 2015). Liu T. i in. (2015) stwierdzili również, że rozwój depresji można przypisać niskiej zawartości antyoksydantów w organizmie.

Często zgłaszano właściwości przeciwutleniające ekstraktu z owoców dyni (Bahramsoltani et al., 2017). Ponadto stwierdzono, że miąższ i skórka Cucurbita pepo L. przetwarzają wyższą aktywność przeciwutleniającą niż inne części, na przykład nasiona (Oyeleke i in., 2019). Podawanie ekstraktu z dyni, w wielu wcześniejszych badaniach, znacznie zwiększyło poziomy SOD i GPX oraz zmniejszyło MDA w surowicy myszy (Guo-Hua i wsp., 2000; Dang, 2004), a efekt ten został również udokumentowany w tym badaniu. W związku z tym aktywność antyoksydacyjna dyni może być przyczyną jej działania przeciwdepresyjnego widocznego w tym badaniu. Jest to zgodne z obserwacjami Kim Nr i in. (2016). Doniesiono, że naturalne produkty o działaniu przeciwzapalnym, przeciwutleniającym i przeciwzmęczeniowym mają również działanie przeciwdepresyjne (Jeong i in., 2015). Wszystkie te poprzednie działania zostały udowodnione w dyniach. Obserwowaną w tym badaniu w grupie CUMS zwiększoną wakuolizację cytoplazmatyczną komórek kory nadnerczy można przypisać rosnącemu zapotrzebowaniu na lipidy, które stanowią podstawę syntezy kortyzolu. Cigankova i in. (2005) zaobserwowali, że długotrwała eksperymentalna hiperdynamika skutkowała koalescencją wielu cytoplazmatycznych kropel lipidowych komórek korowych. Te kropelki lipidów zawierają cholesterol, który jest głównym prekursorem w syntezie hormonów steroidowych.

Jednak Koldysheva i Lushnikova (2008) stwierdzili, że stres spowodował znaczny spadek kropelek lipidów w komórkach kory nadnerczy, zwłaszcza ZF (Koldysheva i Lushnikova, 2008). Opisano, że po ekspozycji na stres fizyczny bodźce bólowe są przekazywane do podwzgórza, powodując wydzielanie CRH do przysadkowego układu wrotnego, co zwiększa wydzielanie ACTH i stymuluje jego receptory w ZF i ZR do zwiększenia wydzielania kortyzolu (Patti i in. , 2018). Pogrubiona torebka nadnercza i beleczki nadnercza obserwowane u szczurów eksponowanych na CUMS były wcześniej zgłaszane (El-Desouki i in., 2011; Altayeb i Salem, 2017) w wyniku zwiększonej syntezy kolagenu przez fibroblasty po ekspozycji na stres związany z unieruchomieniem. Wiele komórek w nadnerczach szczurów wystawionych na działanie CUMS wykazywało głęboko zabarwione jądra komórkowe, co wskazuje, że przeszły apoptozę, która została potwierdzona przez barwienie immunohistochemiczne kaspazy-3. Podobną obserwację przedstawili Altayeb i Salem (2017), badając wpływ stresu związanego z unieruchomieniem na nadnercza szczurów. Liu Q. i in. (2015) stwierdzili, że nadmierny stres oksydacyjny, widoczny po ekspozycji na CUMS w tym badaniu, modyfikuje poziomy ekspresji „genów związanych z apoptozą” i indukuje apoptozę i degenerację komórek poprzez szlaki sygnałowe Bcl-2, Bax i kaspazy -3. Mechanizm ten został potwierdzony w tym badaniu przez RT-PCR, który ujawnił znaczną regulację w górę ekspresji genu kaspazy-3.

Przeglądając literaturę, nie stwierdzono bezpośredniego wpływu Cucurbita pepo na apoptozę zależną od kaspazy-3 w różnych tkankach. Wydaje się, że zmniejszenie liczby kaspazy-3-dodatnich komórek apoptotycznych wykrytych w nadnerczach przypisuje się udokumentowanemu w tym badaniu działaniu przeciwutleniającemu Cucurbita pepo. Potwierdza to wiele wcześniejszych badań przeprowadzonych na innych roślinach i ziołach o znaczącej aktywności przeciwutleniającej (Banagozar Mohammadi i in., 2019; Ghazizadeh i in., 2020). Badanie to wykazało, że ekspozycja na CUMS zwiększyła liczbę komórek Ki67- w korze nadnerczy, co było wyraźnie widoczne w ZF, co wskazuje na zwiększoną liczbę proliferujących komórek, w wyniku czego grubość tej warstwy została znacznie zwiększona. Z drugiej strony liczba komórek proliferujących Ki67-dodatnich nieznacznie zmniejszyła się w rdzeniu w odpowiedzi na CUMS. Obserwacje te były zgodne z obserwacjami Ulrich-Lai et al. (2006), którzy zgłosili wzrost w jądrach komórkowych Ki67-dodatnich tylko w zewnętrznej ZF po ekspozycji na przewlekły zmienny stres, podczas gdy rdzeń wykazywał przerost komórek, a nie hiperplazję. Ponadto Laborie i wsp. (2003) opisali uogólniony wzrost czynności rdzenia kręgowego po ekspozycji na przewlekły stres,

sugerując, że przewlekły stres może prowadzić do przerostu rdzenia kręgowego. W tym badaniu podanie ekstraktu z dyni znacznie zwiększyło proliferację komórek, co jest widoczne poprzez zwiększenie ekspresji genu Ki67 i ekspresję immunologiczną w prawie wszystkich strefach i rdzeniu nadnerczy w porównaniu z CUMS. Wyjaśniało to zwiększoną grubość stref gruczołów odnotowaną w tym badaniu. Może również kompensować efekt apoptotyczny wywołany ekspozycją na CUMS. To odkrycie jest poparte przez Kim Hy et al. (2016), którzy donieśli o znacznej regulacji w górę ekspresji mRNA Ki67 i proliferacji splenocytów wyizolowanych ze śledziony myszy BALB/c leczonych SSP, strumieniem i Cucurbita moschata Duch oraz jego głównym składnikiem, -karotenem. W niniejszym badaniu ekspozycja na CUMS znacząco zwiększyła ekspresję genów i immunoekspresję HSP70 we wszystkich strefach nadnerczy. Zgodnie z tym, Zheng i in. (2008) wykazali również, że zwiększona ekspresja HSP70 po ekspozycji na stresujące warunki moduluje reakcje zapalne poprzez hamowanie aktywacji zapalnego czynnika transkrypcyjnego, jądrowego czynnika kappa B (NF-kappaB). Ponadto HSP70 może bezpośrednio wpływać na apoptozę i martwicę (Yenari i wsp., 2005). Niedawno Li i in. (2019) donieśli o nadregulacji ekspresji HSP70 w tkance nadnerczy świni po ekspozycji na stres cieplny, co wskazuje na rolę HSP70 w uszkodzeniu nadnerczy i podkreśla jego znaczenie dla odpowiedzi zapalnych.

Szybka indukcja HSP70 w odpowiedzi na stres jest uważana za kluczową dla procesu ochrony komórkowej. W naszym badaniu leczenie dyni szczurów eksponowanych na CUMS wiązało się z nieznacznym zmniejszeniem ekspresji HSP70, co wiązało się ze zmniejszoną apoptozą i odpowiedziami zapalnymi. Może to wskazywać na korzystny wpływ stosunkowo wysokiego poziomu HSP70 indukowanego zarówno przez FLU, jak i CP, ponieważ skutkował zmniejszeniem apoptozy za pośrednictwem kaspazy-3 i uwalnianiem cytokin zapalnych. Chociaż wpływ dyni na rodzinę białek szoku cieplnego nie został wcześniej opisany, opisano, że kwas oleinowy, który reprezentuje główne składniki dyń użytych w tym badaniu, zmniejsza ekspresję HSP60 w linii ludzkich limfocytów T (Martins De Lima et al., 2004), co potwierdza wyniki naszego badania. Proponowany mechanizm działania Cucurbita pepo jako substancji podobnej do leku przeciwdepresyjnego podsumowano na rycinie 7. Wśród ograniczeń tego badania była niemożność dalszego zbadania mechanizmu działania przeciwdepresyjnego CP, a zatem dalsze badania są zachęcony do tego. Podsumowując, badanie to dostarcza naukowych dowodów na skuteczność ekstraktu z Cucurbita pepo L. w łagodzeniu wywołanych przez CUMS zmian behawioralnych i biochemicznych, a także histopatologicznego wpływu na nadnercza. Efekty te były widoczne poprzez zmniejszenie apoptozy i ekspresji HSP70 i wydawały się być pośredniczone przez działanie przeciwutleniające i przeciwzapalne ekstraktu z Cucurbita pepo L.. Chociaż to badanie i kilka innych niedawnych badań udokumentowało działanie przeciwdepresyjne Cucurbita pepo i zbadało jego mechanizm, potrzebne są dalsze badania, w tym badania kliniczne, aby potwierdzić ten efekt u ludzi.

To nasz produkt przeciwzmęczeniowy! Kliknij na zdjęcie, aby uzyskać więcej informacji!

BIBLIOGRAFIA

Abd-El-Kareem, MSMA, Rabbih, MAEF, Selim, ETM, Elsherbiny, EAE-M. i El-Khateeb, AY (2016). Zastosowanie GC/EIMS w połączeniu z półempirycznymi obliczeniami do identyfikacji i badania niektórych lotnych składników olejku bazyliowego.

Altayeb, Z. i Salem, M. (2017). Badanie mikroskopem świetlnym i elektronowym nad wpływem stresu związanego z unieruchomieniem na korę nadnerczy dorosłych szczurów i możliwą rolę łagodzącą witaminy EJ Med. Histologia 1, 44–56.

Aparna, V., Dileep, KV, Mandal, PK, Karthe, P., Sadasivan, C. i Haridas, M. (2012). Właściwości przeciwzapalne kwasu N-heksadekanowego: dowody strukturalne i ocena kinetyczna. Chem. Biol. Des. 80, 434–439.

R. Bahramsoltani, MH Farzaei, AH Abdolghaffari, R. Rahimi, N. Samadi, M. Heidari i in. (2017). Ocena działania fitochemikaliów, przeciwutleniaczy i gojenia ran w skórce owocowej Cucurbita Moschata Duchesne. Iran J. Basic Med. Nauka. 20, 798-805. doi:10.22038/ IJBMS.2017.9015

Banagozar Mohammadi, A., Torbati, M., Farajdokht, F., Sadigh-Eteghad, S., Fazljou, SMB, Vatandoust, SM, et al. (2019). Serycyna łagodzi wywołane stresem zachowania depresyjne i lękowe poprzez modulację stresu oksydacyjnego, zapalenia nerwów i apoptozy w korze przedczołowej i hipokampie.

Bauer, ME i Teixeira, AL (2019). Zapalenie w zaburzeniach psychicznych: co jest pierwsze? Anny. N. Y Acad. Nauka. 1437, 57-67.

Chaudhary, S. (2001). Flora Królestwa Arabii Saudyjskiej: Ilustrowany Rijad: Ministerstwo Rolnictwa i Wody, Narodowe Herbarium, Narodowe Centrum Badań nad Rolnictwem i Wodą, 2. Rijad: Anatomia i morfologia.

Cigankova, V., Zibrin, M., Bod A, K. i Holovska, K. (2005). Wpływ długoterminowej hipodynamii eksperymentalnej na nadnercza przepiórek japońskich: badanie ultrastrukturalne. BIULETYN INSTYTUT WETERYNARYJNY PUŁAWY 49, 449.

Clayton, M. i McCance, K. (2014). „Stres i choroba” w Patofizjologii Biologiczna podstawa choroby u dorosłych i dzieci. Redaktorzy K. McCance, S. Huether, V. Brashers i N. Rote. 7 wyd. (USA: Kanada Elsevier).

Conklin, SM, Runyan, CA, Leonard, S., Reddy, RD, Muldoon, MF i Yao, JK (2010). Związane z wiekiem zmiany N-3 i N-6 wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w przedniej korze obręczy osób z dużym zaburzeniem depresyjnym. Prostaglandyny Leukot. Esencja. Kwasy tłuszczowe 82, 111-119.

R. Doron, D. Lotan, Z. Versano, L. Benatav, M. Franko, S. Armoza i in. (2014). Escitalopram lub nowatorska mieszanka ziołowa podczas lub po narażeniu na stres zmniejszają zachowania podobne do lęku poprzez modyfikacje kortykosteronu i BDNF.

Dotto, JM i Chacha, JS (2020). Potencjał pestek dyni jako funkcjonalnego składnika żywności: przegląd. Naukowy Afr. 10, e00575.

Książę, JA (1992). Podręcznik fitochemicznych składników ziół GRAS i innych roślin gospodarczych. [Online]. Boca Raton: FL: CRC Press.

El-Desouki, N., El-Refaiy, A., Abdel-Azeem, H. i El-Baely, M. (2011). Badania histologiczne i ultrastrukturalne skutków unieruchomienia

Nacisk na korę nadnerczy szczura albinosa i łagodząca rola diazepamu. J. Egipt. Ger. Soc. Zool 62, 25–45. Gamal M., Moawad J., Rashed L., Morcos MA i Sharawy N. (2018).

Możliwy udział tetrahydrobiopteryny w zaburzeniach homeostazy redoks w posocznicy - indukowanej dysfunkcji mózgu. Mózg Res. 1685, 19-28.

Gore, AC i Patisaul, HB (2010). Zakłócenia neuroendokrynne: korzenie historyczne, obecny postęp, pytania na przyszłość. Przód. Neuroendokrynol. 31, 395-399.

Guo-Hua, X., Zhi-Hong, H. i Yong-Fangl, W. (2000). Badanie możliwego działania przeciwnowotworowego i immunoompetencji polisacharydu dyniowego. J. Wuhan Prof. Med. Dz. 28, 1-4.

Hema, R., Kumaravel, S. i Alagusundaram, K. (2011). GC/MS Oznaczanie składników bioaktywnych Murraya Koenigii. J. Am. Nauka. 7, 80–83. Huang, L., Mivechi, NF i Moskophidis, D. (2001). Wgląd w regulację i funkcję głównego cząsteczkowego Hsp70 indukowanego stresem

Chaperone In Vivo: Analiza myszy z celowanym zakłóceniem genu genu hsp70.1 lub hsp70.3. Mol. Cel, Biol. 21, 8575-8591.

Huang, Q., Liu, H., Suzuki, K., Ma, S. i Liu, C. (2019). Łączenie tego, co jemy, z naszym nastrojem: przegląd diety, antyoksydantów w diecie i depresji. Przeciwutleniacze 8, 376. doi:10.3390/antiox8090376

Jeong, HJ, Kim, JH, Kim, NR, You, MS, Nam, SY, Kim, KY i in. (2015). Działanie przeciwdepresyjne Stillen. Łuk. Farmacja Res. 38, 1223-1231.

Jonnalagadda SC, Suman P., Morgan DC i Seay JN (2017). „Rozdział 2 - Najnowsze osiągnięcia dotyczące syntezy i zastosowań pochodnych betuliny i kwasu betulinowego jako środków terapeutycznych” w badaniach nad chemią produktów naturalnych. Redaktor R. Atta Ur (Elsevier). Khar, A., Ali, AM, Pardhasaradhi, BY, Varalakshmi, CH, Anjum, R. i Kumari, AL (2001). Indukcja odpowiedzi na stres powoduje powstanie komórki nowotworowej człowieka

Linie odporne na apoptozę za pośrednictwem kurkuminy: rola reaktywnych produktów pośrednich tlenu. Chaperony stresu komórkowego 6, 368-376. doi:10.1379/1466-1268(2001) 006<0368:iosrrh>2.0.co;2 Kikuchi, T., Ando, ​​H., Maekawa, KI, Arie, H., Yamada, T. i Tanaka, R. (2015). Dwa nowe glikozydy diterpenowe typu Ent-kaurane z nasion cukinii (Cucurbita Pepo L.). Fitoterapia 107, 69–76. doi:10.1016/j.fifitote.2015.09.019 Kim, HY, Nam, SY, Yang, SY, Kim, HM i Jeong, HJ (2016a). Cucurbita

Moschata Duch. A jego aktywny składnik, -karoten, skutecznie promuje odpowiedzi immunologiczne poprzez aktywację splenocytów i makrofagów. Immunofarmakol. Immunotoksykol. 38, 319–326.

Koldysheva, EV i Lushnikova, EL (2008). Ultrastrukturalna reorganizacja kory nadnerczy szczura po hipertermii całego ciała. Byk. Do potęgi. Biol. Med. 145, 650-655.

Indukowane metyraponem wyczerpanie glukokortykoidów moduluje ekspresję genu hydroksylazy tyrozynowej i N-metylotransferazy fenyloetanoloaminy w nadnerczu szczura poprzez niecholinergiczną aktywację transsynaptyczną. J. Neuroendokrynol. 15, 15–23.

Lachance, LR i Ramsey, D. (2018). Żywność przeciwdepresyjna: oparty na dowodach system profilowania składników odżywczych na depresję. Świat J. Psychiatry 8, 97-104.