Nanocytokina na bazie IL-12-w bezpieczny sposób wzmacnia odporność przeciwnowotworową poprzez czasoprzestrzenną kontrolę stanu zapalnego w celu wyeliminowania zaawansowanych nowotworów wywołanych przeziębieniem

Leczenie nowotworów oziębłych pod względem immunologicznym stanowi główne wyzwanie dla inhibitorów punktów kontrolnych układu odpornościowego (ICI). Interleukina 12 (IL-12) może wzmacniać ICI przeciwko zimnym nowotworom poprzez wytworzenie silnej odporności przeciwnowotworowej. Jednakże jego toksyczność i ogólnoustrojowa indukcja przeciwdziałających sygnałom immunosupresyjnym utrudniają translację. W tym przypadku aktywność IL-12 jest kontrolowana czasowo w celu bezpiecznego zwiększenia skuteczności bez stymulacji zakłócających odpowiedzi immunologicznych poprzez wytwarzanie nanocytokiny, która pozostaje nieaktywna przy fizjologicznym pH, ale uwalnia swoją pełną aktywność przy kwaśnym pH guza. Nanocytokina oparta na IL-12- (Nano-IL-12) gromadzi się i uwalnia IL-12 w tkankach nowotworowych, wywołując miejscowe zapalenie przeciwnowotworowe, jednocześnie zapobiegając ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej, przeciwstawnym reakcjom immunologicznym i niekorzystne skutki toksyczne nawet po wielokrotnym podaniu dożylnym. Czasoprzestrzenna kontrola stanu zapalnego za pośrednictwem Nano-IL-12- zapewnia doskonałą skuteczność przeciwnowotworową i działa synergicznie z ICI, powodując głęboki stan zapalny mikrośrodowiska nowotworu i całkowite wyeliminowanie guzów pierwotnych i przerzutowych opornych na ICI. Strategia ta może stanowić obiecujące podejście do bezpieczniejszych i skuteczniejszych immunoterapii.

Korzyści z cistanche tubulosa-przeciwnowotworowego

1. Wstęp

Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI), takie jak przeciwciała anty-PD-1 (niwolumab) i anty-CTLA- 4 (ipilimumab), zrewolucjonizowały terapię przeciwnowotworową.[1,2] Jednakże duża liczba leków pacjenci nadal nie odnoszą korzyści z tych terapii.[3] Taką słabą odpowiedź powiązano z fenotypem zimnego nowotworu, który jest niewrażliwy na ICI.[4,5] Te zimne nowotwory zwykle charakteryzują się mikrośrodowiskiem immunosupresyjnym i niskim poziomem nacieku limfocytów T, co osłabia działanie ICI.[5–7 Zatem istnieje pilne zapotrzebowanie na środki umożliwiające zmianę fenotypu nowotworu z zimnego na fenotyp zapalny (gorący) z wysokim naciekiem limfocytów T w kierunku zwiększenia skuteczności ICI i poszerzenia krajobrazu terapeutycznego. Interleukina-12 (IL-12), która należy do najsilniejszych cytokin prozapalnych, ma duży potencjał wzmacniania odporności przeciwnowotworowej i przezwyciężania oporności na ICI.[8–10] Jednak IL-12 indukuje poważne zdarzenia niepożądane pochodzenia immunologicznego (irAE) po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym.[8,10] Zatem różnorodne podejścia do inżynierii białek, w tym cytokiny immunologiczne[11–13], białka fuzyjne[14] i cytokiny wrażliwe na proteazy,[15 ] są przedmiotem intensywnych badań mających na celu poprawę bezpieczeństwa IL-12 poprzez zmniejszenie narażenia ogólnoustrojowego i zwiększenie selektywności nowotworu. Z drugiej strony IL-12 nadal ma krytyczne wady związane z czasoprzestrzenną dynamiką stanu zapalnego, które prowadzą do przeciwdziałających reakcji immunologicznych podważających jej skuteczność.[16–19] Na przykład wielokrotne wstrzyknięcia IL-12 sprzyjają ogólnoustrojową ekspansję interleukiny przeciwzapalnej-10 (IL-10) u pacjentów, co ogranicza skuteczność przeciwnowotworową.[20–22] W związku z tym opracowanie systemów zdolnych do czasoprzestrzennej kontroli IL{{36 }}zapalenie pośrednie mogłoby zmaksymalizować funkcje efektorowe i stymulować silną odporność przeciwnowotworową, unikając zakłócających reakcji immunologicznych. Niestety, dynamika stanu zapalnego w przypadku wyżej wymienionych systemów modyfikowanych białkami nie jest w pełni poznana, a ich związek z przeciwdziałaniem wtórnym reakcjom pozostaje do wyjaśnienia. W tym celu opracowaliśmy reagujące na bodźce nanocytokiny (nanocytokiny) poprzez kapsułkowanie natywnej IL-12 z biokompatybilnymi polimerami, aby uzyskać czasoprzestrzenną kontrolę jej aktywności. Nanocytokiny oparte na IL-12-(Nano-IL-12) zaprojektowano tak, aby uwalniały w pełni aktywną IL-12 po wykryciu kwaśnego pH wewnątrz guza, ponieważ kwasica jest cechą charakterystyczną raka[23] i jest powiązany z immunosupresją.[24,25] Niedawno odkryliśmy, że funkcja zmiany pH może pozwolić na wysoką i selektywną aktywację w nowotworach opornych na ICI.[26] Farmakokinetykę, bezpieczeństwo i skuteczność Nano-IL-12 oceniano w mysich modelach czerniaka zimnego i raka piersi. Nasze wyniki wykazały, że NanoIL-12 indukuje trwałą reakcję zapalną w tkankach nowotworowych, zwiększając intensywność i czas trwania ekspozycji na IL-12, unikając jednocześnie interakcji z komórkami odpornościowymi w zdrowych tkankach w celu stłumienia nieprawidłowego działania docelowa odpowiedź immunologiczna. Zatem Nano-IL-12 skutecznie blokowała przeciwdziałanie reakcjom wtórnym, zarówno ogólnoustrojowym, jak i wewnątrznowotworowym, wykazując skuteczność w dawkach 10-krotnie niższych niż natywna IL-12. Zwiększona odporność przeciwnowotworowa Nano-IL-12 w bezpieczny sposób współdziałała z ICI, intensywnie wywołując stan zapalny mikrośrodowiska nowotworu (TME), prowadząc do całkowitej odpowiedzi (CR) w modelach czerniaka opornych na ICI oraz przerzutów pierwotnych i płuc potrójnych negatywny rak piersi (TNBC).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

2. Wyniki

2.1. Nano-IL-12 wyczuwa pH wewnątrz guza, aby uwolnić w pełni aktywną cytokinę

Aby skonstruować Nano-IL-12, zsyntetyzowaliśmy poli(glikol etylenowy)-poli(LLysynę) modyfikowany bezwodnikiem karboksydimetylomaleinowym (CDM) (PEG-pLL(CDM)) za pomocą opisanej metody [27] (Schemat S1, Informacje dodatkowe). Polimer ma połowę grup aminowych w bloku pLL skoniugowaną z CDM poprzez wiązanie amidowe (rysunki S1 – S3, informacje dodatkowe). Nano-IL{{10}} powstają po prostu przez zmieszanie polimeru z cytokiną w warunkach wodnych, bez dodatku rozpuszczalników organicznych (Rysunek 1a). Grupy aminowe w polimerze tworzą kompleksy jonowe z grupami karboksylanowymi w białkach, podczas gdy grupy CDM reagują z grupami aminowymi w IL-12, jak również w pasmach polimeru, tworząc wrażliwe na pH wiązania amidowe. Skuteczność kapsułkowania IL-12 w nanocytokinach określono na około 80%, co zmierzono metodą HPLC poprzez porównanie obszarów pików wolnej IL-12 znakowanej Alexa Fluor 647 (A647) i IL-12 załadowana do nanocytokiny (ryc. 1b). W przypadku IL-12 nieznakowanej fluorescencyjnie, skuteczność kapsułkowania została potwierdzona pomiarem ELISA, ponieważ metoda ELISA może wykryć jedynie niekapsułkowaną wolną IL-12 w przereagowanej mieszaninie, ponieważ powłoka polimerowa Nano -IL-12 blokuje rozpoznawanie obciążonej IL-12 przez przeciwciało wykrywające. Zatem, obliczając stosunek niekapsułkowanej IL-12 do całkowitej ilości podawanej IL-12, skuteczność kapsułkowania również określono na około 80% (rysunek S4a, informacje dodatkowe), co jest zgodne z wynikiem z pomiarów HPLC. NanoIL-12 oczyszczono przez filtrację odśrodkową w celu usunięcia wolnej IL-12 i stosunkowo małych koniugatów polimer-IL-12 (rysunek S4b, informacje dodatkowe). Oczyszczanie potwierdzono metodą HPLC (Figura 1b, dolny panel). Tworzenie się polimerowej osłony na Nano-IL-12 potwierdzono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i dynamicznego rozpraszania światła (DLS). W TEM rdzeń NanoIL-12 obciążony IL-12 utworzony przez blok pLL polimeru i IL-12 wybarwiono octanem uranylu[28] i uwidoczniono jako jednolite czarne kropki z średnia średnica przy 23,2 ± 4 nm (ryc. 1c, d). Za pomocą DLS zmierzono średnicę hydrodynamiczną Nano-IL-12 na 42 ± 2 nm (rysunek 1e). Porównując wielkość zmierzoną za pomocą TEM i DLS, możemy obliczyć, że grubość otoczki PEG w tych cząstkach wynosi około 10 nm. Wynik ten wskazuje na gęstą PEGylację, która byłaby użyteczna dla poprawy farmakokinetyki.[29] Co więcej, badania fluorescencyjnej spektroskopii korelacyjnej (FCS) znakowanej A647-Nano-IL-12 potwierdziły tworzenie się związków o większej masie cząsteczkowej niż wolna IL647-znakowana A-12 (Tabela S1, informacje uzupełniające). Porównując liczbę cząsteczek na cząsteczkę w pomiarze FCS próbek A647-znakowanych IL-12 i A647-znakowanych Nano-IL-12, ustaliliśmy, że każdy Nano-IL{ {67}} zawiera średnio około 1,5 IL-12 cząsteczek. Ponadto stwierdzono, że ładunek powierzchniowy Nano-IL-12 jest bliski neutralności (tabela S2, informacje uzupełniające), co sugeruje, że polimer osłania ujemnie naładowany IL-12. Doniesiono, że wiązania amidowe w Nano-IL-12 utworzone pomiędzy ugrupowaniami CDM a aminami pierwszorzędowymi są wrażliwe na pH.[30] Zatem oczekuje się, że Nano-IL-12 ulegnie dysocjacji w warunkach kwasowych z uwolnieniem zamkniętej cytokiny. Najpierw sprawdziliśmy wrażliwość Nano-IL-12 na pH przy różnych wartościach pH w zakresie od pH 4,5 do 8,5 za pomocą pomiaru FCS, aby odzwierciedlić stan dysocjacji Nano-IL-12 poprzez zmianę współczynnik dyfuzji. Wzrost współczynnika dyfuzji, odpowiadający spadkowi masy cząsteczkowej cząstek, można zaobserwować w warunkach kwaśnych poniżej pH 7,0, co sugeruje, że Nano-IL-12 są stabilne w fizjologicznym pH, ale mogą utracić swoje właściwości integralność zmian wewnątrzguzowych w zakwaszonym środowisku [23,31] (ryc. 1f). Następnie zbadaliśmy kinetykę dysocjacji Nano-IL-12 przy fizjologicznym pH 7,4 i wewnątrznowotworowym pH 6,5 za pomocą pomiaru FCS. Pomiar FCS umożliwia precyzyjną ocenę współczynników dyfuzji Nano-IL-12 i uwolnionej IL-12. Nowy wynik pokazał, że Nano-IL-12 szybko utracił integralność przy pH 6,5, a współczynnik dyfuzji próbki osiągnął wartość wolnej IL-12 po 4 godzinach inkubacji, co sugeruje całkowitą aktywację Nano-IL -12 w takich warunkach. Co więcej, przy pH 7,4 Nano-IL-12 były stabilne (rysunek 1g), zachowując swój współczynnik dyfuzji nawet po kilku dniach (rysunek S4c, informacje dodatkowe). Obserwacje te potwierdzają selektywną aktywację Nano-IL-12 w wewnątrzguzowych warunkach pH i stabilność w warunkach fizjologicznych. Ponieważ IL-12 może stymulować wydzielanie IFN-𝛾 ze splenocytów,[32] wpływ ekranowania/deosłaniania polimeru na bioaktywność Nano-IL-12 oceniano in vitro w teście splenocytów ( Rysunek 1h). Nano-IL-12 indukował niższy poziom produkcji IFN-𝛾 w mysich splenocytach, co wskazuje na blokowanie bioaktywności IL-12 przez kapsułkowanie polimeru. Z drugiej strony Nano-IL-12 aktywowana przez wstępną inkubację w kwasie (pH 6,5) wykazywała podobną bioaktywność do natywnej IL-12, co sugeruje aktywowaną Nano-IL-12 może w pełni odzyskać bioaktywność cytokiny.

Rysunek 1. Nano-IL-12 aktywuje się przy pH wewnątrz guza, uwalniając w pełni aktywną cytokinę. a) Tworzenie i struktura nanocytokiny opartej na IL-12-(Nano-IL- 12). Nano-IL-12 ulega samoorganizacji w środowisku wodnym poprzez proste zmieszanie polimeru z IL-12. Zespół jest napędzany wrażliwymi na pH wiązaniami amidowymi i oddziaływaniami elektrostatycznymi. b) Wyniki HPLC wolnego białka IL-12, mieszaniny PEG-pLL(CDM) + IL-12 i oczyszczonej Nano-IL-12. Białka IL-12 są znakowane A647. c) Reprezentatywny obraz TEM oczyszczonego Nano-IL-12 wyraźnie pokazuje strukturę rdzenia cząstek. d) Rozkład średnicy rdzeni cząstek zmierzony na podstawie obrazów TEM. Zliczono n=100 cząstek. e) Rozkład średnic hydrodynamicznych Nano-IL-12 zmierzony metodą DLS. f) Zależna od pH dysocjacja Nano-IL-12 wskazana przez pomiar FCS Nano-IL-12 inkubowanego w różnym pH przez 24 godziny. Linia przerywana przy 5,3 × 107 cm2 s-1 odnosi się do współczynnika dyfuzji wolnej IL-12. g) Profil uwalniania IL-12 Nano-IL-12 mierzony metodą FCS. Linie przerywane przy 1,2 × 107 cm2 s-1 i 5,3 × 107 cm2 s-1 odnoszą się odpowiednio do współczynników dyfuzji nienaruszonej Nano-IL-12 i uwolnionej wolnej IL-12. h) Wydzielanie IFN-𝛾 przez mysie splenocyty traktowane Nano-IL-12, aktywowaną Nano-IL-12 i natywną IL-12. IFN-𝛾 mierzono za pomocą testu ELISA. Dane przedstawiono jako średnią ± SD; dla f i g, n=3 pomiarów równoległych. Dla h, n=5 pomiarów równoległych.

Konserwacja i stabilność preparatu są również ważne dla przełożenia Nano-IL-12 na lek. Dlatego opracowaliśmy liofilizowaną wersję Nano-IL-12, w której zastosowano trehalozę jako krioprotektant.[33] Odtworzona Nano-IL-12 wykazywała porównywalny rozmiar i ładunek powierzchniowy ze świeżym Nano-IL-12, bez wycieków ładunku, a także miała porównywalną czułość na pH i zdolność indukowania IFN-𝛾 in vitro (Rysunek S4d – g i Tabela S2, Informacje dodatkowe). Wyniki te potwierdzają, że liofilizowany preparat jest realnym odpowiednikiem Nano-IL-12.

Rysunek 2. Nano-IL-12 poprawia farmakokinetykę i skuteczność przeciwnowotworową. a) Obrazy IVCLSM skóry płatka ucha myszy po wstrzyknięciu dożylnym 10 µg A647-znakowanego IL-12 lub Nano-IL-12 (kolor czerwony). Pasek skali=50 μm. Średnią intensywność fluorescencji w obszarze tkanki (białe prostokąty) po 5 godzinach od wstrzyknięcia określono ilościowo i znormalizowano do maksymalnej intensywności w układzie naczyniowym bezpośrednio po wstrzyknięciu (Vmax). b) Profile krążenia krwi wolnej IL-12 i Nano-IL-12 po wstrzyknięciu dożylnym 10 µg IL-12 lub równoważnej Nano-IL-12 określone metodą ELISA. Wykreśla się także stężenie uwolnionej IL-12 z Nano-IL-12 we krwi (dane przedstawiono jako średnią ± SD, n=5 myszy na grupę). c) Obraz IVIS guzów czerniaka B16F10 wyciętych 24 godziny po wstrzyknięciu dożylnym 10 ug IL-12 lub równoważnej Nano-IL-12 znakowanej A647. d) Kwantyfikacja poziomu IL-12 w guzach 4T1 TNBC w chwili 24- i 48 godzin po wstrzyknięciu dożylnym 10 µg IL-12 lub równoważnego Nano-IL-12 za pomocą testu ELISA ( Dane przedstawiono jako średnią ± SD; n=3 myszy na grupę; wartości p obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA). e) Działanie przeciwnowotworowe pojedynczego wstrzyknięcia dożylnego (dni wstrzyknięcia zaznaczono strzałką (dzień 8 dla modelu B16F10 i dzień 7 dla modelu 4T1)) 10 µg IL-12 lub równoważnego Nano-IL{ {51}}. Wyniki w przypadku czerniaka B16F10 pokazano na górnym panelu, a wyniki w badaniu 4T1 TNBC pokazano na dolnym panelu. Poszczególne krzywe wzrostu guza pokazano na lewych panelach. Krzywe średniej objętości guza pokazano w środkowych panelach, a krzywe przeżycia pokazano w prawym panelu (dane przedstawiono jako średnią ± SEM; n=5 myszy na grupę, wartości p obliczono za pomocą analizy log-rank ).

2.2. Nano-IL-12 Poprawia farmakokinetykę IL-12 i aktywuje się w nowotworach, wzmacniając działanie przeciwnowotworowe

Kapsułkowanie w Nano-IL-12 może poprawić farmakokinetykę IL-12. Do wizualizacji krążenia Nano-IL-12 po wstrzyknięciu dożylnym (iv) wykorzystano in vivo konfokalną laserową mikroskopię skaningową (IVCLSM) do śledzenia Nano-IL opartego na A647-IL-12- -12 w naczyniach płatków uszu myszy po wstrzyknięciu z żyły ogonowej. Wolna IL-12 wykazywała wynaczynienie po wstrzyknięciu (ryc. 2a), na co wskazywała zwiększona intensywność fluorescencji w śródmiąższu tkanki. Biorąc pod uwagę, że makrocząsteczki o wielkości porównywalnej do IL-12 (75 kDa), takie jak dekstran o masie 70 kDa i albumina (65 kDa), mają ograniczony dostęp do skóry,[34] wyciek IL-12 z naczyń sugeruje niestabilność IL-12 podczas krążenia krwi. W rzeczywistości poprzednie badania wykazały proteolizę IL-12 przez enzymy obecne w surowicy.[35,36] Aby dodatkowo potwierdzić degradację IL-12 w naszych eksperymentach, stabilność A{{22 }} znakowaną IL-12 w osoczu myszy badano metodą chromatografii wykluczania (SEC). Po inkubacji z osoczem myszy odkryliśmy, że IL-12 rozkłada się na fragmenty o mniejszej masie cząsteczkowej (Rysunek S5, informacje dodatkowe), co potwierdza niestabilność IL-12 we krwi. Z drugiej strony Nano-IL-12 wykazywał minimalny wyciek do skóry, co wskazuje na ich stabilność w krążeniu krwi. Ilościowy profil krążenia zmierzony w teście ELISA potwierdził, że ogólna Nano-IL-12 krąży dłużej niż wolna IL-12 (Rysunek 2b). Tymczasem poziom aktywowanej Nano-IL-12, określony na podstawie uwolnionej IL-12, był silnie ograniczony we krwi, co wskazuje na stabilność Nano-IL-12 in vivo podczas działania ogólnoustrojowego krążenia, co pomaga ograniczyć ogólnoustrojowe skutki uboczne. Akumulacja Nano-IL-12 w sercu, śledzionie, płucach i nerkach była podobna do akumulacji wolnej IL-12 zarówno po 24, jak i 48 godzinach po podaniu, natomiast w wątrobie akumulacja Nano-IL-12 był wyższy niż wolna IL-12 po 24 godzinach, ale porównywalny po 48 godzinach (Rysunek S6, informacje uzupełniające). Nano-IL-12 wykazywała znacząco większą akumulację w guzie niż wolna IL-12 (ryc. 2c) po 24 godzinach od wstrzyknięcia. Co więcej, chociaż wolna IL-12 została usunięta z guzów po 48 godzinach od wstrzyknięcia, stężenie Nano-IL-12 pozostało wysokie (około 4-krotnie wyższe niż wolna IL{{59} }) (Rysunek 2d), co sugeruje, że Nano-IL-12 zwiększa pole pod krzywą stężenia (AUC) IL-12 wewnątrz nowotworów. Zgodnie ze zwiększoną akumulacją i żywotną aktywacją w nowotworach, Nano-IL-12 wykazała lepszą skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z wolną IL-12 w modelach podskórnego czerniaka B16F10 i ortotopowego potrójnie ujemnego raka piersi 4T1 (TNBC) (ryc. 2e). W obu modelach już pojedyncze wstrzyknięcie dożylne Nano-IL-12 w ilości odpowiadającej 10 µg IL-12 doprowadziło do znacznie lepszego hamowania wzrostu guza niż IL-12, co doprowadziło do wydłużenia czasu przeżycia . Warto zauważyć, że w modelu 4T1 TNBC, który słynie z silnej immunosupresji i oporności na leczenie ICI[37], leczenie Nano-IL-12 przyniosło wyraźnie istotny efekt terapeutyczny, podczas gdy wolna IL{{83} } było daremne w walce ze wzrostem nowotworu.

2.3. Nano-IL-12 Czasoprzestrzennie kontrolował reakcję zapalną

Aby dokładniej zbadać różnicę między biologicznym działaniem Nano-IL-12 i wolnej IL-12, poziom odpowiedzi zapalnej wywołanej leczeniem oceniano na podstawie odpowiedzi cytokin zarówno w miejscach poza celem, tj. , krwi i zdrowych narządach oraz w nowotworach (ortotopowy model 4T1). Cztery dalsze cytokiny IL-12, mianowicie IFN-𝛾, czynnik martwicy nowotworu-𝛼 (TNF-𝛼), interleukina{{10}} (IL-6) i interleukina Jako wskaźniki odpowiedzi zapalnej wybrano -10 (IL-10). Wśród nich IFN-𝛾, TNF- 𝛼 i IL-6 to ważne cytokiny prozapalne powiązane z przeciwnowotworowym działaniem IL-12,[20,38], podczas gdy IL{{20 }} to cytokina przeciwzapalna, która stanowi negatywne sprzężenie zwrotne antagonizujące stymulację IL-12.[20,39] Nano-IL-12 i wolną IL-12 wstrzyknięto dwukrotnie w dniach 0 i 3, a reakcję zapalną śledzono codziennie przez 1 tydzień. To ustawienie eksperymentalne pozwoliło nam określić wpływ zarówno pojedynczego wstrzyknięcia, jak i wielokrotnych dawek na czasoprzestrzenną odpowiedź zapalną. Pierwsze wstrzyknięcie wolnej IL-12 w dniu 0 doprowadziło do wydzielenia czterech cytokin do krwi i narządów, a maksymalne stężenie w osoczu zaobserwowano w dniu 2 (ryc. 3a–e, g), co wskazuje na silne wyłączenie -docelowy stan zapalny związany ze zdarzeniami niepożądanymi o podłożu immunologicznym (irAE) IL-12.[8,10] Z drugiej strony, pierwsze wstrzyknięcie Nano-IL- 12 wykazało znacząco niższy poziom cytokin niż wolnej IL-12 we krwi i zdrowych narządach, co wskazuje na regulację reakcji zapalnej poza celem. Drugie wstrzyknięcie wolnej IL-12 w dniu 3 ponownie pobudziło wydzielanie IFN-𝛾, TNF-𝛼 i IL-6. Jednak maksymalne poziomy IFN-𝛾 i TNF-𝛼 obserwowane w dniu 5 były wyraźnie niższe niż te obserwowane w dniu 2 po pierwszym wstrzyknięciu IL-12. Co więcej, drugie wstrzyknięcie wolnej IL-12 niezwykle podniosło poziom przeciwzapalnej IL-10 w osoczu, narządach i nowotworach, co powiązano z ogólnoustrojową hiperekspansją komórek Th1 w celu indukcji faza regulacyjna.[40] Tak zróżnicowana odpowiedź wywołana powtarzalnym leczeniem IL-12 została potwierdzona w badaniach klinicznych na ludziach i przyczynia się do zmniejszenia skutków biologicznych IL-12, w tym jej działania przeciwnowotworowego.[20] W przeciwieństwie do IL-12, drugie wstrzyknięcie Nano-IL-12 nie wzmagało wydzielania IL-10 we krwi i narządach. Ponadto stężenie cytokin zapalnych we krwi i zdrowych tkankach było znacznie niższe niż stężenie wolnej IL-12. Wyniki te sugerują, że Nano-IL-12 może nie tylko zmniejszyć ogólnoustrojową odpowiedź zapalną, ale także przezwyciężyć ograniczenia związane z wielokrotnym podawaniem IL-12, które indukują przeciwstawną odpowiedź przeciwzapalną. W guzach pojedynczy zastrzyk Nano-IL-12 zwiększył produkcję zapalnych IFN-𝛾, TNF-𝛼 i IL-6, osiągając znacznie wyższe stężenia wewnątrz guza niż wolna IL{{77} } leczenie (ryc. 3f, g). Tymczasem leczenie Nano-IL-12 indukowało w nowotworach niższy poziom przeciwzapalnej IL-10 w porównaniu z wolną IL-12, unikając wystąpienia przeciwdziałającej odpowiedzi przeciwzapalnej. Co więcej, po drugim wstrzyknięciu Nano-IL-12 wysoki poziom cytokin zapalnych utrzymywał się w nowotworach, podczas gdy wewnątrzguzowe stężenie IL-10 było utrzymywane na niskim poziomie. Ta regulacja w górę IFN-𝛾, TNF-𝛼 i IL-6 oraz regulacja w dół IL-10 w nowotworach koreluje z wysokim i utrzymującym się wewnątrznowotworowym poziomem Nano-IL-12 i wspiera nasilona reakcja zapalna na Nano-IL-12, która ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej.[41]

Aby sprawdzić, czy Nano-IL-12 może poprawić skuteczność poprzez czasoprzestrzenną kontrolę stanu zapalnego, powtórzyliśmy eksperyment z rysunku 2e, ale tym razem leczyliśmy myszy 10-krotnie niższą dawką, tj. 1 ug równoważnika IL-12, stosując schemat powtarzanego dawkowania, który wyzwala przeciwdziałającą odpowiedź immunologiczną na wolną IL- 12. W ramach tego powtarzającego się leczenia małymi dawkami Nano-IL-12 wyraźnie zwiększała skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z IL-12 w guzach 4T1 TNBC (ryc. 3h), prowadząc do wolniejszego wzrostu guza i wydłużenia przeżycia. Z drugiej strony leczenie wolną IL-12 wykazało znikomą skuteczność nawet po sześciokrotnym intensywnym wstrzyknięciu, co można przypisać ekspansji cytokin przeciwzapalnych, takich jak IL-10. Wyniki te potwierdzają zdolność Nano-IL- 12 do wzmacniania skuteczności przeciwnowotworowej poprzez czasoprzestrzenną kontrolę stanu zapalnego. Kontrola reakcji zapalnej również doprowadziła do zwiększenia bezpieczeństwa. Przeprowadziliśmy ocenę histologiczną i analizę krwi, aby określić toksyczność IL{{20}} i Nano-IL-12 po dwóch wstrzyknięciach w dniach 0 i 3 (Rysunek S7a, c, informacje uzupełniające) . Wyniki wykazały znacznie niższą toksyczność dla wątroby, nerek i trzustki po leczeniu Nano-IL-12 w porównaniu z wolną IL-12. Jako parametr toksyczności monitorowano także zmiany masy ciała podczas leczenia. Zwierzęta leczone nano-IL-12 nieznacznie przybrały na wadze podczas leczenia, podczas gdy myszy otrzymujące wolną IL-12 odnotowały spadek masy ciała (Rysunek S7b, informacje dodatkowe). Zatem obserwacje te wskazują, że Nano-IL- 12 może preferencyjnie promować odpowiedź zapalną w nowotworach, zwiększając skuteczność przeciwnowotworową, jednocześnie ograniczając niepożądane skutki w zdrowych tkankach, aby zmniejszyć toksyczność i osłabić przeciwstawną odpowiedź przeciwzapalną.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Leczenie Nano-IL-12 indukuje przeciwnowotworową infiltrację komórek układu odpornościowego w TME

IL-12 jest również znana jako czynnik stymulujący komórki T, ponieważ może stymulować wzrost i funkcję komórek T w celu inicjowania wzmocnionych przeciwnowotworowych reakcji immunologicznych. W ten sposób oceniliśmy naciek komórek CD8+ w nowotworach po wielokrotnym leczeniu Nano-IL-12. Analiza metodą cytometrii przepływowej czerniaka B16F10 leczonego dwoma wstrzyknięciami dożylnymi wolnej IL-12 lub Nano-IL-12 w ilości równoważnej/wstrzyknięciu 1 ug IL-12 wykazała, że ​​Nano-IL{{13} } znacznie zwiększał naciek limfocytów T CD8+ w guzie w porównaniu z wolną IL-12 (ryc. 4a). Przeprowadzając eksperyment zanikania komórek odpornościowych u myszy z guzem 4T1 TNBC, zbadaliśmy udział różnych populacji komórek odpornościowych w odpowiedzi na leczenie Nano-IL-12. Nano-IL-12 wstrzyknięto dożylnie pięć razy w dniach 7, 9, 11, 13 i 15 (równoważnik/wstrzyknięcie 1 µg IL-12). Co więcej, myszom wstrzyknięto dootrzewnowo (ip) przeciwciała anty-CD4, anty-CD8 lub anty-asiago GM1 w dniach 6, 8 i 10 w celu wyczerpania CD4+, CD8+ lub Komórki NK odpowiednio. Wyniki wykazały, że zmniejszenie liczby cytotoksycznych limfocytów T CD8+, limfocytów T CD4+ i komórek NK znacznie zmniejszyło skuteczność terapeutyczną Nano-IL-12, na co wskazuje szybszy wzrost guza oraz zmniejszone przeżycie w grupach zubożonych w porównaniu z myszami otrzymującymi wyłącznie leczenie Nano-IL-12 (Figura 4b). Wynik ten jest zgodny z biologiczną funkcją IL-12, w tym wzmacnianiem aktywności cytotoksycznej limfocytów T CD8[42] i komórek NK[43] oraz pośredniczeniem w różnicowaniu naiwnych limfocytów T w komórki pomocnicze T (Th). .[44]

Co więcej, różna skuteczność łagodzenia działania przeciwnowotworowego wynikająca z eksperymentu wyczerpywania sugeruje znaczenie każdej populacji komórek dla skuteczności Nano-IL-12, przy czym najważniejszą frakcją są cytotoksyczne komórki T CD8+ . Analiza immunohistochemiczna skrawków nowotworu 4T1 TNBC ujawniła przestrzenne rozmieszczenie komórek efektorowych naciekających nowotwór (ryc. 4c). Podczas gdy wolna IL-12 nie poprawiała obecności cytotoksycznych limfocytów T CD8+ i komórek Tbet+ (Th1) w nowotworach, Nano-IL-12 sprzyjała silnej infiltracji obu komórek do głębokich regiony nowotworowe. Ponadto zwiększenie poziomu Granzymu B w komórkach CD8+ sugerowało wyższy poziom aktywacji cytotoksycznych komórek T po leczeniu NanoIL-12 (Rysunek 4d). Co więcej, zaobserwowaliśmy, że leczenie Nano-IL-12 zwiększało ekspresję PD-L1 w nowotworach w porównaniu z guzami leczonymi PBS i wolną IL{{20}}. Ten zwiększony poziom PD-L1 może wynikać z wyższego poziomu IFN-𝛾 guza indukowanego przez Nano-IL-12, który, jak doniesiono, stymuluje ekspresję PD-L1 w tkance nowotworowej,[45] służąc jako mechanizm immunosupresji aby zapobiec infiltracji limfocytów. To wewnątrznowotworowe zwiększenie poziomu PD-L1 sugeruje potencjał synergii skuteczności przeciwnowotworowej Nano-IL-12 poprzez połączenie go z ICI przeciwko PD-1 lub anty-PD-L1. W oparciu o powyższą obserwację zbadaliśmy wpływ Nano-IL-12 w monoterapii oraz w połączeniu z przeciwciałami antyPD-1 na TME (Rysunek 4e). Eksperyment przeprowadzono na ortotopowych guzach TNBC przygotowanych z komórek 4T1 wykazujących ekspresję hemaglutyniny (4T1-HA), ponieważ hemaglutynina jest dobrze zdefiniowanym immunogenem, który może indukować specyficzną dla antygenu odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T w modelu mysim.[46 ,47] Myszom podano dwukrotnie 10 µg IL-12 lub równoważną Nano-IL-12 w dniach 0 i 3, a w przypadku terapii skojarzonej myszy jednocześnie otrzymały dwukrotnie wstrzyknięcia 100 µg leku anty-PD -1 przeciwciało. W dniu 7 pobrano próbki nowotworu do cytometrii przepływowej.

Wyniki potwierdziły, że leczenie Nano-IL-12 indukowało większy naciek leukocytów (CD45+) w guzie niż IL-12. Połączenie Nano-IL-12 z przeciwciałami anty-PD-1 również wykazało wyższą liczbę komórek CD45+ w nowotworach. Wśród leukocytów poziom komórek limfoidalnych i limfocytów T uległ zwiększeniu pod wpływem Nano-IL-12 i kombinacji Nano-IL- 12/anty-PD-1. Leczenie Nano-IL-12 spowodowało niewielkie zmiany w populacji komórek NK, ale doprowadziło do znaczących zmian w podgrupie komórek T w porównaniu z wolną IL-12. Warto zauważyć, że naciek limfocytów T CD8+ w guzach 4T1-HA był wyraźnie podwyższony w przypadku Nano-IL-12 niż w przypadku wolnej IL-12. Co więcej, liczba limfocytów T tetramer HA+, które odpowiadają komórkom T specyficznym dla antygenu, była znacząco zwiększona w kombinacji Nano-IL-12 z przeciwciałem anty-PD- 1, co sugeruje promowanie nabytego układu odpornościowego odpowiedź dzięki synergii Nano-IL-12 i ICI. Ogólne limfocyty T CD4+ wykazywały regulację w górę w grupach leczonych NanoIL-12. Aby dokładniej określić subpopulację limfocytów T CD4+ w nowotworach, wybarwiliśmy komórki anty-Foxp3 w celu zbadania limfocytów T regulatorowych (Tregs). Podczas gdy monoterapia anty-PD-1 nie wykazała żadnej supresji Treg w modelu guza HA 4T1-, połączenie Nano-IL-12 i anty-PD-1 dramatycznie wyczerpał Tregi. Co więcej, nowotwory leczone Nano-IL-12 prezentowały więcej limfocytów Th niż wolna IL-12. Wyniki te wskazują, że leczenie Nano-IL-12 wzmocniło filtrację przeciwnowotworowych komórek odpornościowych i działało synergicznie z przeciwciałami anty-PD-1, aby przezwyciężyć immunosupresyjny TME.

Rysunek 3. Nano-IL-12 kontrolował czasoprzestrzennie reakcję zapalną. a) Poziomy cytokin prozapalnych (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6) i przeciwzapalnych (IL-10) we krwi u myszy noszących 4T1-, którym wstrzyknięto 1{{14 }} ug IL-12 lub odpowiednik Nano-IL-12 dwukrotnie w dniach 0 i 3. Poziomy cytokin mierzono za pomocą testu ELISA. Wartości szczytowe po dwóch wstrzyknięciach (w dniach 2 i 5 dla IFN-𝛾, TNF-𝛼 i IL-10; w dniach 2 i 6 dla IL-6) są wizualizowane w postaci wykresów słupkowych na prawy panel. b–f) Poziomy cytokin w narządach i nowotworach myszy noszących 4T1-, którym wstrzyknięto 10 µg IL-12 lub równoważnej Nano-IL-12 dwukrotnie w dniach 0 i 3. Myszy poddano badaniu uśmiercano w dniach 2 i 5 w celu pobrania tkanek. (Dane przedstawiono jako średnią ± SD; n=6 myszy na grupę; wartości p obliczono za pomocą testu t dla niesparowanych.) g) Mapy cieplne poziomów cytokin we krwi, narządach i nowotworach na podstawie średnich wartości w af przeliczone na Z-score. h) Aktywność przeciwnowotworowa powtarzanego wstrzyknięcia dożylnego (wstrzykniętego w dniach 7, 9, 11, 13, 15 i 25, jak pokazano strzałkami) 1 µg IL-12 lub równoważnego Nano-IL-12 przeciwko mysim TNBC. Poszczególne krzywe wzrostu guza pokazano na lewym panelu. Krzywe średniej objętości guza pokazano na panelu środkowym, a krzywe przeżycia pokazano na prawym panelu (dane przedstawiono jako średnią ± SEM; n=6 myszy na grupę, wartości p obliczono za pomocą analizy log-rank ).

Rysunek 4. Działanie przeciwnowotworowe Nano-IL-12 wynika ze zwiększonej infiltracji komórek efektorowych w TME. a) Analiza metodą cytometrii przepływowej nacieku CTL w czerniaku po leczeniu Nano-IL-12. Myszom zaszczepiono komórki B16F10 w dniu 0. IL-12 (1 µg) lub równoważny Nano-IL-12 wstrzyknięto dożylnie dwukrotnie w dniach 8 i 11. Próbki nowotworu pobrano i analizowano w dniu 15 (dane przedstawiono jako średnią ± SD; n {{ 16}} myszy na grupę; wartości p obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA). b) Aktywność przeciwnowotworowa Nano-IL-12 po wyczerpaniu komórek CD4+, CD8+ i NK. Myszom z guzami 4T1 wstrzyknięto dożylnie Nano-IL-12 (odpowiednik 1 µg IL-12) w dniach 7, 9, 11, 13 i 15. Ponadto myszom wstrzyknięto anty-CD4 , przeciwciała anty-CD8 i anty-asiago GM1 w dniach 6, 8 i 10. Zapisano krzywe wzrostu guza (dane przedstawiono jako średnią ± SEM) i krzywe przeżycia (n=6 myszy na grupę, wartości p oblicza się za pomocą analizy log-rank). c) Obrazy IHC skrawków guza 4T1. Myszom z guzami 4T1 TNBC (średnia objętość guza: 200 mm3) dwukrotnie wstrzyknięto dożylnie PBS, 10 µg IL-12 lub równoważną Nano-IL-12 w dniach 0 i 3. W dniu 7. myszy uśmiercano w celu pobrania guzów. Komórki CD8+, Tbet lub PD-L1+ w nowotworach są wizualizowane na żółto. Jądra komórkowe barwiono barwnikiem Hoechst (niebieski). Pasek skali=1 mm. d) Barwienie immunologiczne Granzymu B (zielony) i CD8 (czerwony) w skrawkach guza 4T1. Jądra komórkowe barwiono barwnikiem Hoechst (niebieski). Żółte piksele wskazują aktywowane komórki T CD8+. Pasek skali=100 μm. e) Analiza nacieku komórek limfoidalnych w guzach 4T1-HA leczonych PBS, przeciwciałami anty-PD1, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 plus anty- Przeciwciała PD1 i Nano-IL-12 plus przeciwciała anty-PD1. IL-12 i Nano-IL-12 wstrzyknięto dożylnie w dawce 10 µg w 7. i 9. dniu po zaszczepieniu. Anty-PD-1 wstrzyknięto ip w dawce 100 µg w 8. i 10. dniu po zaszczepieniu. W dniu 17 myszy uśmiercono, a nowotwory homogenizowano do pomiaru metodą cytometrii przepływowej (dane przedstawiono jako średnią ± SD, n=5 próbek na grupę, wartości p obliczono metodą jednoczynnikowej analizy ANOVA).

2.5. Leczenie Nano-IL-12 aktywuje TME z poziomu transkrypcji w celu wzmocnienia odpowiedzi ICI

Następnie zbadaliśmy aktywację TME guzów 4T1-HA po leczeniu na poziomie ekspresji genów za pomocą analizy transkryptomu. Sekwencjonowanie próbek całkowitego RNA wyekstrahowanych z tkanek nowotworowych przeprowadzono po leczeniu PBS, przeciwciałami anty-PD-1, IL-12, Nano-IL-12 i kombinacjami cytokin z ICI. Mapa cieplna globalnej ekspresji genów wyraźnie wskazywała zróżnicowane profile genów w nowotworach otrzymujących Nano-IL-12 oraz kombinację Nano-IL-12 z anty-PD- 1 (Rysunek S11, Informacje dodatkowe ). Aby określić procesy biologiczne, na które wpływa leczenie Nano-IL-12, przeanalizowaliśmy geny o zróżnicowanej ekspresji w każdej grupie i przeprowadziliśmy analizę wzbogacania genów o zwiększonej i obniżonej ekspresji (Rysunek 5a, b). Zarówno analiza GOBP, jak i KEGG ujawniła, że ​​w porównaniu z IL-12 i PBS, leczenie Nano-IL-12 wyraźnie zwiększało stymulację proliferacji, różnicowania i aktywacji funkcjonalnej różnych efektorowych komórek odpornościowych, takich jak komórki T proliferacja, różnicowanie limfocytów T do limfocytów Th oraz aktywacja limfocytów T i szlak sygnałowy receptora limfocytów T. Co więcej, stwierdzono, że geny związane z ekspresją PD-L1 i szlakiem punktu kontrolnego PD-1 również ulegają zwiększeniu po leczeniu Nano-IL-12. Wyniki te potwierdzają silną stymulację NanoIL-12 limfocytów T obserwowaną w badaniach cytometrii przepływowej i immunohistologii. Jednocześnie leczenie Nano-IL-12 pozytywnie wpłynęło na geny powiązane z innymi komórkami odpornościowymi, takimi jak monocyty i komórki NK. Leczenie Nano-IL-12 zwiększyło także odpowiedź cytokin i inne procesy odpornościowe, takie jak prezentacja antygenu. Z drugiej strony Nano-IL-12 obniża poziom szlaków związanych z podziałem komórkowym, co sugeruje, że leczenie może hamować proliferację komórek nowotworowych (Rysunek S11, Informacje dodatkowe). Wyniki te wskazują na zalety Nano-IL-12 w aktywowaniu zarówno wrodzonej, jak i adaptacyjnej części odporności wewnątrznowotworowej.

Dalsze badania nad terapiami skojarzonymi wykazały, że leczenie skojarzone Nano-IL-12 z przeciwciałami anty-PD-1 zwiększa odporność wewnątrznowotworową w porównaniu z IL-12 i anty-PD{{6} } przeciwciała lub monoterapia anty-PD-1 poprzez stymulację zarówno wrodzonych, jak i nabytych szlaków odpornościowych (Rysunek 5b i Rycina S11c, Informacje dodatkowe). Co imponujące, połączenie NanoIL-12 z przeciwciałami anty-PD-1 spowodowało silniejsze hamowanie szlaków związanych z mitozą, co sugeruje, że to połączenie może pośredniczyć w silniejszym działaniu zabijającym naciekające komórki efektorowe przeciwko komórkom nowotworowym. W oparciu o wyniki seq RNA przeanalizowaliśmy także populacje komórek odpornościowych naciekających nowotwór (ryc. 5c, d). Podobnie jak wynik cytometrii przepływowej, grupy traktowane Nano-IL-12 wykazały zwiększoną infiltrację limfocytów T CD8+. Co więcej, wyniki ujawniły również zwiększenie liczby monocytów i granulocytów, potwierdzając wzmożenie stanu zapalnego w nowotworach na skutek wzmocnionych wrodzonych szlaków odpornościowych. Wyniki te potwierdziły, że Nano-IL-12 wywołuje silną odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworom, a połączenie z anty-PD-1 może wzmocnić ten proces.

Rysunek 5. Leczenie Nano-IL-12 zwiększa aktywację immunologiczną w TME w celu wzmocnienia przeciwciał anty-PD1. a) Wykresy wulkaniczne genów o zróżnicowanej ekspresji w porównaniu między Nano-IL-12 kontra IL-12 i Nano-IL-12 + anty-PD-1 kontra IL{{12} } anty-PD-1. Wykresy otrzymano z analizy seq RNA guzów 4T1-HA leczonych różnymi sposobami leczenia: 10 µg IL-12 i równoważnego Nano-IL-12 wstrzyknięto dożylnie w 7. i 9. dniu po zaszczepieniu . Anty-PD-1 wstrzyknięto ip w dawce 100 µg w 8. i 10. dniu po zaszczepieniu. W dniu 17 myszy uśmiercono w celu pobrania próbek nowotworu. b) Analiza wzbogacenia pokazująca zwiększone ścieżki w dwóch parach porównawczych w a. c) Mapa cieplna populacji komórek w TME określona na podstawie sekw. RNA. W celu wykreślenia figury populacje przeliczono na wyniki Z. d) Histogramy populacji komórek wykazujące istotne różnice w wielokrotnych porównaniach (dane przedstawiono jako średnią ± SD; w przypadku grupy PBS n=5 próbek; w przypadku innych grup n=4 próbek na grupę; wartości p oblicza się za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA).

2.6. Nano-IL-12 współdziała z ICI, aby skutecznie eliminować nowotwory pierwotne i przerzutowe

Aby zbadać potencjał terapeutyczny Nano-IL-12 w zakresie synergii z ICI, u myszy wyhodowano ortotopowe pierwotne nowotwory TNBC poprzez zaszczepienie komórek 4T1 w poduszce tłuszczowej sutka. Myszom podano Nano-IL-12 w różnych schematach dawek i schematach kombinacji z ICI, aby przetestować skuteczność przeciwnowotworową odpowiednich terapii. Stwierdziliśmy, że nawet przy niskiej dawce (odpowiednik 1 µg IL-12/wstrzyknięcie) wielokrotne leczenie Nano-IL-12 wywierało wyraźne działanie przeciwnowotworowe przeciwko pierwotnym nowotworom TNBC w monoterapii, ponieważ wykazano przez zahamowanie tempa wzrostu guza i przedłużone przeżycie (Rysunek S12, informacje uzupełniające). Jednak leczenie bezpłatną IL-12 w tej dawce nie wykazało żadnej skuteczności, nawet w połączeniu z terapią przeciw PD. Połączenie Nano-IL- 12 z anty-PD-1 dodatkowo zwiększyło skuteczność i osiągnięto CR. Następnie zbadaliśmy wyższą dawkę Nano-IL-12 (równoważność/wstrzyknięcie 10 µg IL-12) i połączyliśmy ją z koktajlami ICI (przeciwciała antyPD-1 i anty-CTLA4), aby spełnić działanie terapeutyczne potencjał. Warto zauważyć, że przy tej dawce terapia skojarzona Nano-IL-12 z ICI zatrzymała wzrost guza i całkowicie go wykorzeniła (Figura 6a), przy czym u wszystkich myszy w tej grupie leczenia wykazano CR. Co więcej, wyleczone myszy wykazały odporność na ponowne narażenie nowotworu na komórki 4T1, co potwierdza istnienie solidnej pamięci immunologicznej po leczeniu skojarzonym Nano-IL-12 i ICI.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

TNBC jest znany jako agresywny nowotwór z dużą częstością występowania przerzutów odległych.[48,49] Dlatego następnie zbadaliśmy działanie Nano-IL-12 w modelu TNBC z przerzutami. Opracowano model spontanicznych przerzutów TNBC poprzez resekcję pierwotnych ortotopowych guzów 4T1, co doprowadzi do rozwoju przerzutów w wielu narządach, głównie w płucach.[50] W tym modelu terapia skojarzona Nano-IL-12 z ICI również przyniosła zadowalające wyniki, co spowodowało zatrzymanie postępu przerzutów do płuc (ryc. 6b) i doprowadziło do CR u wszystkich leczonych myszy. Co więcej, po ponownym podaniu dożylnego wstrzyknięcia komórek 4T1, większość wyleczonych myszy wykazywała silną oporność, co wskazuje na skuteczną pamięć immunologiczną po połączeniu Nano-IL-12 i ICI. Oprócz TNBC przetestowaliśmy także Nano-IL-12 w połączeniu z ICI w modelu pierwotnego czerniaka B16F10 (rysunek S13, informacje dodatkowe). Wyniki pokazały, że połączenie Nano-IL-12 (równoważność/wstrzyknięcie 10 µg IL-12) z przeciwciałem anty-PD-1 doprowadziło do CR u 4 myszy z 6 w grupie , a wyleczone myszy wykazywały oporność na ponowne podanie komórek B16F10, co sugeruje silną pamięć immunologiczną.

3. Dyskusja

Opracowaliśmy strategię IL-12 aktywowaną przez nowotwór, wykorzystującą wrażliwe nanocytokiny (Nano-IL-12), które mogą wyciszyć bioaktywność IL-12 przy pH 7,4, ale odzyskać w pełni aktywną cytokinę przy wewnątrznowotworowe pH. Po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym Nano-IL-12 stabilnie krążyła w krwiobiegu, zmniejszając odpowiedź immunologiczną w miejscach niepatologicznych i występowanie irAE, nawet po wielokrotnym podaniu. Z drugiej strony wysoka akumulacja i aktywacja Nano-IL-12 w nowotworach prowadzi do znacznego zwiększenia skuteczności i synergii z ICI, osiągając CR w modelach zimnych nowotworów, które są oporne na ICI, i zapewniając solidną pamięć immunologiczna po leczeniu.

Nano-IL-12 głęboko aktywował TME, wywołując silne wydzielanie cytokin zapalnych, zwiększoną infiltrację komórek efektorowych i zmniejszoną obecność komórek immunosupresyjnych. Co więcej, Nano-IL-12 zwiększyła poziom PD-L1 w komórkach nowotworowych, co może promować aktywność przeciwciał anty-PD-1. Zmiany w TME wywołane przez Nano-IL-12 współpracowały z przeciwciałami antyPD-1 w celu stymulacji odporności nowotworowej poprzez wzmocnienie prezentacji antygenów, zwiększoną obecność komórek efektorowych i wzmocnienie ich aktywności oraz promowanie interakcji komórek odpornościowych. Badania kliniczne wykazały, że blokada punktu kontrolnego anty-PD1/anty-PD-L1 daje wyższy odsetek odpowiedzi u pacjentów z TNBC z dodatnim wynikiem PD-L1-z dużą liczbą limfocytów naciekających nowotwór.[51,52] Jednakże, ogólne działanie blokady immunologicznych punktów kontrolnych w monoterapii przeciwko TNBC nie było zadowalające[53,54] ze względu na ogólnie niską ekspresję i znacząco heterogenny TME TNBC[55,56] W rzeczywistości tylko blokada PD-L1 w połączeniu z chemioterapią (Nab-Paclitaxel) został zatwierdzony do stosowania u pacjentów z TNBC z przerzutami, co daje jedynie skromne korzyści w zakresie całkowitego przeżycia u niewielkiej części pacjentów z TNBC.[57] Zatem potencjał Nano-IL-12 do zastąpienia immunosupresyjnego TME i zwiększenia ekspresji PD-L1 w TNBC może stanowić solidną alternatywę w zakresie zwiększania współczynnika odpowiedzi na blokadę punktów kontrolnych. Zwiększone bezpieczeństwo Nano-IL-12 stanowi także znaczącą zaletę w zastosowaniach terapeutycznych. Poprzednie badania kliniczne wykazały, że IL-12 podawana ogólnoustrojowo wywołuje silną toksyczność hematologiczną i wątrobową.[58,59] Takie działania niepożądane są głównie związane z wytwarzaniem IFN-𝛾 i TNF-𝛼 indukowanego przez IL{{40} }.[42,60] W naszym badaniu Nano-IL-12 wykazywała znacznie niższy poziom cytokin niż wolna IL-12 we krwi i narządach, co ograniczało uszkodzenie narządów. W ten sposób mogliśmy wstrzyknąć Nano-IL- 12 kilka razy w dawce 10 µg IL-12 na mysz, czyli około 500 µg kg-1, co stanowi w przybliżeniu {{52} }krotnie wyższa niż maksymalna tolerowana dawka (MTD) IL-12 u ludzi, tj. 500 ng kg-1. [61] Innym ważnym skutkiem ubocznym ogólnoustrojowej terapii IL-12 obserwowanym w badaniach klinicznych jest wystąpienie adaptacyjnej odpowiedzi przeciwzapalnej po drugim podaniu IL-12, co prowadzi do zmniejszenia skuteczności. [20,21] Zjawisko takie powiązano z mechanizmami ujemnego sprzężenia zwrotnego związanymi z nadprodukcją przeciwzapalnej IL-10 i spadkiem poziomu cytokin prozapalnych, takich jak IFN-𝛾, TNF-𝛼 i IL{{ 67}}.[20,22] Nano-IL-12 zapobiegła wzrostowi IL-10 we krwi i narządach po drugim podaniu, co mogłoby być wygodne w przypadku realizacji schematów powtarzanego podawania bez spadku wartości działanie przeciwnowotworowe. Warto zauważyć, że leczenie Nano-IL-12 nie zwiększyło stężenia IL-10 w nowotworach, utrzymując wewnątrz guza wysoki poziom IFN-𝛾, TNF-𝛼 i IL-6.

Rysunek 6. Nano-IL-12 działa synergicznie z inhibitorami punktów kontrolnych układu odpornościowego, aby wyeliminować nowotwory piersi. Zarówno w ortotropowym, jak i przerzutowym modelu TNBC, myszy pogrupowano tak, aby otrzymały terapie PBS, IL-12 + ICI (anty-CTLA4 i anty-PD-1) oraz Nano-IL-12 + ICI (dawka i harmonogram leczenia pokazano odpowiednio na schemacie na górnych panelach). a) Terapia skojarzona Nano-IL-12 i ICI doprowadziła do całkowitej eliminacji guzów ortotopowych u wszystkich leczonych myszy. Poszczególne krzywe wzrostu guza pokazano na lewym panelu. W prawym górnym panelu pokazano średnią objętość guza i krzywe przeżycia. Wyleczone myszy wykazały silną obronę przed ponownym wstrzyknięciem komórek 4T1 do sutka, bez wzrostu guza u leczonych myszy (prawy dolny panel). b) Terapia skojarzona Nano-IL-12 i ICI wykazała silne hamowanie postępu nowotworu przerzutowego. Po leczeniu (dzień 23) płuca myszy leczonych terapią skojarzoną Nano-IL-12 + ICI wykazały wyraźnie mniej przerzutów, co pokazano na reprezentatywnych zdjęciach (zielone strzałki: przerzuty makroskopowe) i ocenie histologicznej (pasek skali {{21 }} μm) przedstawione w lewym panelu. Terapia skojarzona Nano-IL-12 + ICI ostatecznie doprowadziła do całkowitej odpowiedzi u wszystkich leczonych myszy, jak wskazują krzywe przeżycia (prawy górny panel). Wyleczone myszy wykazały także silną obronę przed ponownym atakiem nowotworu poprzez wstrzyknięcie komórek 4T1 (prawy dolny panel). (Dane przedstawiono jako średnią ± SEM.; n=6 myszy na grupę; wartości p obliczono za pomocą analizy log-rank).

Ponieważ IL-12 jest uważana za jedną z najsilniejszych cytokin immunostymulujących, intensywnie bada się kilka podejść mających na celu złagodzenie toksyczności wywołanej IL-12-i zwiększenie jej skuteczności. Strategie wykorzystujące bezpośrednie wstrzyknięcie do guza, takie jak preparaty oparte na IL-12 i adiuwantach[62] oraz plazmidowym DNA[63] lub informacyjnym RNA[64] kodującym IL-12 do wytwarzania cytokiny in situ, mogą zmaksymalizować indeks terapeutyczny.[8] Jednakże administracja lokalna może napotkać w klinice kilka ograniczeń, w tym leczenie nowotworów rosnących w pozycjach, w których nie można wstrzykiwać,[65], skuteczność zależna od operatora,[66], nierównomierny rozkład wstrzykiwanych leków w guzie,[67] i dostarczanie niezgodne z celem wywołane wyciekiem.[68] Co więcej, działanie przeciwnowotworowe preparatów wstrzykiwanych do guza przeciw przerzutom odległym w dużej mierze zależy od zmiennej skuteczności efektu abskopalnego,[69] który wykazał niską częstość występowania w badaniach klinicznych[70–72] i może nie być w stanie przezwyciężyć sygnałów immunosupresyjnych w przerzutach.[73] Możliwość bezpiecznego podawania Nano-IL-12 w drodze ogólnoustrojowego wstrzyknięcia dożylnego, co stanowi standardową procedurę kliniczną, może pozwolić na przewidywalną farmakokinetykę i może zapewnić dostęp do wszystkich miejsc guza poprzez dopływ krwi. Białka fuzyjne Fc oparte na IL[14] i immunocytokiny[11–13] również mają te same zalety co NanoIL-12. Jednakże składnik IL-12 w tych związkach jest aktywny ogólnoustrojowo, co budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa. Na przykład długo krążące białka fuzyjne IL-12 wykazały wysoki poziom IFN-𝛾[74,75] w surowicy, a cytokiny odpornościowe IL-12 wykazały akumulację w miejscach poza celem.[76, 77] Zdolność Nano-IL-12 do kontrolowania aktywacji czasoprzestrzennej może zapewnić bezpieczną i skuteczną strategię o specyficzności w zakresie celowania w nowotwór.

Korzyści z cistanche tubulosa-przeciwnowotworowego

Ograniczeniem naszego obecnego badania jest to, że Nano-IL-12 opiera się na mysiej IL-12. Biorąc pod uwagę, że homologia między mysią IL-12 a ludzką IL-12 wynosi około 60–70%, konieczne będą dalsze badania w celu określenia składu nanocytokiny opartej na ludzkiej IL-12-o aktywności i profile bezpieczeństwa porównywalne z systemem opartym na myszy. Na szczęście wstępne testy wykazały, że polimery użyte w naszym badaniu mogą również pokrywać ludzką IL-12 przy podobnej wrażliwości na pH. Co więcej, ponieważ polimery można precyzyjnie zaprojektować, możliwe byłoby opracowanie systemu opartego na ludzkiej IL-12-z odpowiednimi profilami czasoprzestrzennymi do użytku przez ludzi. Podsumowując, Nano-IL-12 jako nanocytokiny osiągnęły skuteczną kontrolę czasoprzestrzenną aktywności IL-12 po podaniu ogólnoustrojowym, zapewniając precyzyjną stymulację odporności wewnątrznowotworowej w celu uzyskania zadowalającego bezpieczeństwa i wyników terapeutycznych w przypadku pierwotnego i przerzutowego zimnego guza modele, współdziałając z blokadą punktów kontrolnych. Ponieważ polimery stosowane do składania Nano-IL-12 można zaprojektować tak, aby umożliwiały kapsułkowanie szerokiego zakresu białek o różnych masach cząsteczkowych i ładunku powierzchniowym, system ma potencjał do szerszych zastosowań, takich jak kapsułkowanie innych cytokin terapeutycznych, a nawet koktajle cytokinowe. Co więcej, biorąc pod uwagę, że układ polimerowy można dalej modyfikować tak, aby wykrywał inne bodźce poza pH,[78] nanocytokiny można zaprojektować tak, aby działały na różne mikrośrodowiska nowotworu. Wreszcie, biorąc pod uwagę potencjał translacyjny zastosowanych polimerów i nanocytokin, strategia ta jest obiecująca dla przyszłości immunoterapii nowotworów.

Bibliografia

[1] AJ Korman, SC Garrett-Thomson, N. Lonberg, Nat. Ks. Drug Discovery 2021, 21, 509.

[2] A. Ribas, JD Wolchok, Science 2018, 359, 1350.

[3] A. Haslam, V. Prasad, JAMA Network Open 2019, 2, e192535.

[4] P. Sharma, BA Siddiqui, S. Anandhan, SS Yadav, SK Subudhi, J. Gao, S. Goswami, JP Allison, Cancer Discovery 2021, 11, 838.

[5] JD Martin, H. Cabral, T. Stylianopoulos, RK Jain, Nat. Wielebny Clin. Onkol. 2020, 17, 251.

[6] CM Fares, EM Van Allen, CG Drake, JP Allison, S. HuLieskovan, Am. Towarzystwo Clin. Onkol. Edukować. Książka. 2019, 39, 147.

[7] K. Chamoto, R. Hatae, T. Honjo, Int. J. Clin. Onkol. 2020, 25, 790.

[8] KG Nguyen, MR Vrabel, SM Mantooth, JJ Hopkins, ES Wagner, TA Gabaldon, DA Zaharoff, przód. Immunol. 2020, 11, 2510.

[9] EA Chiocca, AB Gelb, CC Chen, G. Rao, DA Reardon, PY Wen, WL Bi, P. Peruzzi, C. Amidei, D. Triggs, L. Seften, G. Park, J. Grant, K Truman, JY Buck, N. Hadar, N. Demars, J. Miao, T. Estupinan, J. Loewy, K. Chadha, J. Tringali, L. Cooper, R. V Lukas, Neuro-Oncology 2021, 24, 951.

[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Raki 2021, 13, 167.

[11] A. Mansurow, J. Ishihara, P. Hosseinchi, L. Potin, TM Marchell, A. Ishihara, J.-MM Williford, AT Alpar, MM Raczy, LT Gray, MA Swartz, JA Hubbell, Nat. Biomed. inż. 2020, 4, 531.

[12] N. Pasche, D. Neri, Drug Discovery Today 2012, 17, 583.

[13] J. Strauss, CR Heery, JW Kim, C. Jochems, RN Donahue, AS Montgomery, S. McMahon, E. Lamping, JL Marte, RA Madan, M. Bilusic, MR Silver, E. Bertotti, J. Schlom, JL Gulley, Clin. Rak Res. 2019, 25, 99.

[14] K. Jung, JH Ha, JE Kim, JA Kim, YJ Kim, CH Kim, YS Kim, OncoImmunology 2018, 7, e1438800.

[15] A. Mansurov, P. Hosseinchi, K. Chang, AL Lauterbach, LT Gray, AT Alpar, E. Budina, AJ Slezak, S. Kang, S. Cao, A. Solanki, S. Gomes, J.- M. Williford, MA Swartz, JL Mendoza, J. Ishihara, JA Hubbell, Nat. Biomed. inż. 2022, 6, 819.

[16] HD Chang, A. Radbruch, ekspert ks. Clin. Immunol. 2014, 3, 709.

[17] H. Chang, A. Radbruch, D. Rheumaforschungszentrum, Ann. NY Acad. Nauka. 2007, 1109, 40.

[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014, 22, 237.

[19] C. Asselin-Paturel, M. Isabelle Vergnon, B. Hamid Echchakir, M. Guillaume Dorothé, M. Sé vrine Blesson, M. Franç oise Gay, B. Fathia Mami-Chouaib, S. Chouaib, Cancer 2001, 91, 113.

[20] JEA Portielje, CHJ Lamers, WHJ Kruit, A. Sparreboom, RLH Bolhuis, G. Stoter, C. Huber, JW Gratama, Clin. Rak Res. 2003, 9, 76.

[21] JP Leonard, ML Sherman, GL Fisher, LJ Buchanan, G. Larsen, MB Atkins, JA Sosman, JP Dutcher, NJ Vogelzang, JL Ryan, Blood 1997, 90, 2541.

[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. Rak Res. 1998, 4, 75.

[23] C. Corbet, O. Feron, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Oncoimmunology 2013, 2, e22058.

[25] S. Damgaci, A. Ibrahim-Hashim, PM Enriquez-Navas, S. PilonThomas, A. Guvenis, RJ Gillies, Immunology 2018, 154, 354.

[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.

[27] A. Tao, GLo Huang, K. Igarashi, T. Hong, S. Liao, F. Stellacci, Y. Matsumoto, T. Yamasoba, K. Kataoka, H. Cabral, Macromol. Biologia. 2020, 20, 1900161.

[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.

[29] JS Suk, Q. Xu, N. Kim, J. Hanes, LM Ensign, Adv. Dostawa leków Rev. 2016, 99, 28.

[30] CY Sun, Y. Liu, JZ Du, ZT Cao, CF Xu, J. Wang, Angew. Chem., Int. wyd. 2016, 55, 1010.

[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Cancer Metastasis Rev. 2019, 38, 149.

[32] G. Trinchieri, F. Gerosa, J. Leukocyte Biol. 1996, 59, 505.

[33] T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede, L. Paccou, Y. Guinet, NT Correia, A. Hedoux, J. Pharm. Nauka. 2020, 109, 496.

[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuaki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Stem Cells Int. 2013, 3, 1932.

[35] S. Jayanthi, BP Koppolu, KG Nguyen, SG Smith, BK Felber, TKS Kumar, DA Zaharoff, Stem Cells Int. 2017, 7, 5360.

[36] MP Hwuang, RJ Fecek, T. Qin, WJ Storkus, Y. Wang, J. Controlled Release 2019, 318, 270.

[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.

[38] G. Trinchieri, Annu. Ks. Immunol. 1995, 13, 251.

[39] L. Meyaard, E. Hovenkamp, ​​SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996, 156, 2776.

[40] A. Cope, GLe Friec, J. Cardone, C. Kemper, Trends Immunol. 2011, 32, 278.

[41] SP Kerkar, RS Goldszmid, P. Muranski, D. Chinnasamy, Z. Yu, RN Reger, AJ Leonardi, RA Morgan, E. Wang, FM Marincola, G. Trinchieri, SA Rosenberg, NP Restifo, J. Clin . Inwestować. 2011, 121, 4746.

[42] W. Lasek, R. Zago˙zdzon, M. Jakobisiak, Cancer Immunol. Immunoinny. 2014, 63, 419.

[43] C. Zhang, J. Zhang, J. Niu, Z. Zhou, J. Zhang, Z. Tian, ​​Hum. Immunol. 2008, 69, 490.

[44] NG Jacobson, SJ Szabo, RM Weber-Nordt, Z. Zhong, RD Schreiber, JE Darnell, KM Murphy, J. Exp. Med. 1995, 181, 1755.

[45] K. Mimura, JL Teh, H. OKamama, K. Shiraishi, LF Kua, V. Koh, DT Smoot, H. Ashktorab, T. Oike, Y. Suzuki, Z. Fazreen, BR Asuncion, A. Shabbir , WP Yong, J. So, R. Soong, K. Kono, Cancer Sci. 2018, 109, 43.

[46] T. Watanabe, S. Watanabe, G. Neumann, H. Kida, Y. Kawaoka, J. Virol. 2002, 76, 767.

[47] AS Bergot, A. Durgeau, B. Levacher, BM Colombo, JL Cohen, D. Klatzmann, Cancer Gene Ther. 2010, 17, 645.

[48] ​​R. Dent, M. Trudeau, KI Pritchard, WM Hanna, HK Kahn, CA Sawka, LA Lickley, E. Rawlinson, P. Sun, SA Narod, Clin. Rak Res. 2007, 13, 4429.

[49] BG Haffty, Q. Yang, M. Reiss, T. Kearney, SA Higgins, J. Weidhaas, L. Harris, W. Hait, D. Toppmeyer, J. Clin. Onkol. 2006, 24, 5652.

[50] AV Paschall, K. Liu, J. Visualized Exp. 2016, 2016, 54040.

[51] A. Marra, G. Viale, G. Curigliano, BMC Med. 2019, 17, 90.

[52] R. Thomas, G. Al-Khadairi, J. Decock, Przód. Onkol. 2021, 10, 3464.

[53] S. Adams, P. Schmid, HS Rugo, EP Winer, D. Loirat, A. Awada, DW Cescon, H. Iwata, M. Campone, R. Nanda, R. Hui, G. Curigliano, D. Toppmeyer, J. O'Shaughnessy, S. Loi, S. Paluch-Shimon, AR Tan, D. Card, J. Zhao, V. Karantza, J. Cortés, Ann. Onkol. 2019, 30, 397.

[54] LY Dirix, I. Takacs, G. Jerozolima, P. Nikolinakos, HT Arkenau, A. Forero-Torres, R. Boccia, ME Lippman, R. Somer, M. Smakal, LA Emens, B. Hrinczenko, W. Edenfield, J. Gurtler, A. von Heydebreck, HJ Grote, K. Chin, EP Hamilton, Breast Cancer Res. Traktować. 2018, 167, 671.

[55] EA Mittendorf, AV Philips, F. Meric-Bernstam, N. Qiao, Y. Wu, S. Harrington, X. Su, Y. Wang, AM Gonzalez-Angulo, A. Akcakanat, A. Chawla, M. Curran, P. Hwu, P. Sharma, JK Litton, JJ Molldrem, G. Alatrash, Cancer Immunol. Rozdzielczość 2014, 2, 361.

[56] MT Barrett, E. Lenkiewicz, S. Malasi, A. Basu, JH Yearley, L. Annamalai, AE McCullough, HE Kosiorek, P. Narang, MA Wilson Sayres, M. Chen, KS Anderson, BA Pockaj, Breast Rak Res. 2018, 20,71.

[57] P. Schmid, S. Adams, HS Rugo, A. Schneeweiss, CH Barrios, H. Iwata, V. Diéras, R. Hegg, S.-A. Im, GS Wright, V. Henschel, L. Molinero, SY Chui, R. Funke, A. Husain, EP Winer, S. Loi, LA Emens, N. Engl. J. Med. 2018, 379, 2108.

[58] MK Gately, U. Gubler, MJ Brunda, RR Nadeau, TD Anderson, JM Lipman, U. Sarmiento, Ther. Immunol. 1994, 1, 187.

[59] UM Sarmiento, JH Riley, PA Knaack, JM Lipman, JM Becker, MK Gately, R. Chizzonite, TD Anderson, Lab. Inwestować. 1994, 71, 862.

[60] VM Eng, BD Car, B. Schnyder, M. Lorenz, S. Lugli, M. Aguet, TD Anderson, B. Ryffel, VFJ Quesniaux, J. Exp. Med. 1995, 181, 1893.

[61] JA Gollob, KG Veenstra, RA Parker, JW Mier, DF McDermott, D. Clancy, L. Tutin, H. Koon, MB Atkins, J. Clin. Onkol. 2003, 21, 2564.

[62] Y. Agarwal, LE Milling, JYH Chang, L. Santollani, A. Sheen, EA Lutz, A. Tabet, J. Stinson, K. Ni, KA Rodrigues, TJ Moyer, MB Melo, DJ Irvine, KD Wittrup , Nat. Biomed. inż. 2022, 6, 129.

[63] ML Lucas, L. Heller, D. Coppola, R. Heller, Mol. Tam. 2002, 5, 668.

[64] SL Hewitt, D. Bailey, J. Zieliński, A. Apte, F. Musenge, R. Karp, S. Burke, F. Garcon, A. Mishra, S. Gurumurthy, A. Watkins, K. Arnold, J. Moynihan, E. Clancy-Thompson, K. Mulgrew, G. Adjei, K. Deschler, D. Potz, G. Moody, DA Leinster, S. Novick, M. Sulikowski, C. Bagnall, P. Martin, JM Lapointe, H. Si, C. Morehouse, M. Sedic, RW Wilkinson, R. Herbst i in., Clin. Rak Res. 2020, 26, 6284.

[65] RS Riley, CH June, R. Langer, MJ Mitchell, Nat. Ks. Drug Discovery 2019, 18, 175.

[66] I. Melero, E. Castanon, M. Alvarez, S. Champiat, A. Marabelle, Nat. Wielebny Clin. Onkol. 2021, 18, 558.

[67] LM Wein, JT Wu, DH Kirn, Cancer Res. 2003, 63, 1317.

[68] J. Hong, C.-O. Yuna, BMC Biomed. inż. 2019, 1, 17.

[69] A. Mukhopadhyay, J. Wright, S. Shirley, DA Canton, C. Burkart, RJ Connolly, JS Campbell, RH Pierce, Gene Ther. 2018, 26, 1.

[70] MA Postow, MK Callahan, CA Barker, Y. Yamada, J. Yuan, S. Kitano, Z. Mu, T. Rasalan, M. Adamow, E. Ritter, C. Sedrak, AA Jungbluth, R. Chua , AS Yang, R.-A. Roman, S. Rosner, B. Benson, JP Allison, AM Lesokhin, S. Gnjatic, JD Wolchok, N. Engl. J. Med. 2012, 366, 925.

[71] EF Stamell, JD Wolchok, S. Gnjatic, NY Lee, I. Brownell, Int. J. Radiat. Oncol., Biol., Fiz. 2013, 85, 293.

[72] EB Golden, S. Demaria, PB Schiff, A. Chachoua, SC Formenti, Cancer Immunol. Rozdzielczość 2013, 1, 365.

[73] TY Seiwert, AP Kiess, J. Clin. Onkol. 2021, 39, 1.

[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerott, A. Cheung, A. Grinberg, N. Wagtmann, Cancer Res. 2021, 81, 1714

[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.

[76] J. Sharifi, LA Khawli, P. Hu, S. King, AL Epstein, Hybrid Hybridomics 2001, 20, 305.

[77] C. Halin, S. Rondini, F. Nilsson, A. Berndt, H. Kosmehl, L. Zardi, D. Neri, Nat. Biotechnologia. 2002, 20, 264.

[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. Matko. 2013, 12, 991.

[79] E. Becht, NA Giraldo, L. Lacroix, B. Buttard, N. Elarouci, F. Petitprez, J. Selves, P. Laurent-Puig, C. Sautès-Fridman, WH Fridman, A. de Reyniès, Biol genomu. 2016, 17, 218