Chemiczna i genetyczna dyskryminacja Cistanches Herba na podstawie UPLC-QTOF/MS i kodów kreskowych DNA

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang i Linfang Huang *

Abstrakcyjny

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), znana jako „żeń-szeń pustyni”, ma uderzający leczniczy wpływ na siłę i odżywienie, szczególnie wzmacniając nerki, aby wzmocnić yang. Jednak dwa roślinne pochodzenie Cistanches Herba,Cistanche deserticolaorazCistanche tubulosa, różnią się pod względem działania farmakologicznego ichemicznyskładniki. Aby rozróżnić pochodzenie roślinneCistanchesHerba, system połączonych metodchemicznyorazgenetyczny–Technologia UPLC-QTOF/MS i kodowanie kreskowe DNA–zostały po raz pierwszy zastosowane w tym badaniu. Wyniki wskazują, że trzy potencjalne związki markerowe (izomer kamneozydu II, cistanozydu C i cistanozydu A) uzyskano w celu rozróżnienia dwóch źródeł za pomocą analiz PCA i OPLS-DA. Kody kreskowe DNA umożliwiły dokładne rozróżnienie dwóch źródeł pochodzenia. Drzewo NJ pokazało, że dwa źródła skupiły się w dwóch kladach. Nasze odkrycia pokazują, że dwa początkiCistanchesHerba posiada różnechemicznykompozycje igenetycznyodmiany. Jest to pierwsza zgłoszona ocena dwóch źródełCistanches Herba, a odkrycie ułatwi kontrolę jakości i jej zastosowanie kliniczne.

Kliknij tutaj, aby uzyskać więcej informacji o Cistanche

Wstęp

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), znana jako „żeń-szeń pustyni”, pochodzi z suszonych soczystych łodygCistancheDeserticola YC Ma i Cistanche tubulosa (Schrenk) Peruka według Chińskiej Farmakopei (edycja 2010) i jest popularna ze względu na tonizującą nerkę yin, korzystnie wpływającą na esencję życiową i relaksujące jelita. Obecnie Cistanches Herba jest rozprowadzana głównie na suchych i ciepłych pustyniach w północno-zachodnich Chinach, szczególnie w prowincjach Xinjiang i Mongolii Wewnętrznej. Jednak dwa źródła Cistanches Herba różnią się pod względem ich aktywności farmakologicznej ichemicznyskładniki. Tu i in. badał wywar z trzechCistanche(C. deserticola, C.tubulosa, Cistanche salsa) i stwierdzili, że C.tubulosa wykazywała najniższy efekt w mysim modelu niedoboru Yang [1]. Zhang i in. porównali aktywność farmakologiczną C. deserticola, C. tubulosa i C. salsa i stwierdzili, że gatunki te mają funkcje lecznicze, takie jak przeciwdziałanie zmęczeniu i tolerancja na hipoksję, ale nie w takim samym stopniu [2]. Poprzednie badania wykazały, żechemicznyskładnik i wskazał różnicęchemicznyskładnik i zawartość dla pochodzenia roślinnegoCistanchesHerba [3]. Jeśli chodzi o zastosowanie kliniczne i krążenie rynkowe, jako środek wzmacniający, C. tubulosa jest tradycyjnie stosowany jako środek wspomagający krążenie krwi oraz w leczeniu impotencji, bezpłodności, lumbago, osłabienia organizmu w Japonii [4]–[8].

W związku z tym bardzo ważne jest rozróżnienie dwóch źródełCistanchesHerba do kontroli jakości i zastosowania klinicznego. Jednak nie ma badań skupiających się na dyskryminacji dwóch źródeł Cistanches Herba. Wiele badanych metod, w tym mikroskopia, ultrafiolet i detekcja w podczerwieni, metoda powtórzeń między prostymi sekwencjami, zostało wykorzystanych do identyfikacji rodzaju Cistanches, ale nie tylko dla dwóch źródeł, zwłaszcza [9]–[20]. Tutaj używamy łączniechemicznyi technik molekularnych pozwalających na rozróżnienie dwóch źródełCistanchesHerba, UPLC-QTOF/MS (ultrasprawna chromatografia cieczowa sprzężona z kwadrupolową spektrometrią mas czasu przelotu) i kodowanie kreskowe DNA. UPLC-QTOF/MS dostarcza informacje szybciej i wydajniej w porównaniu z innymi technikami. Wysoka selektywność i czułość UPLC-QTOF/MS zaowocowała jego zastosowaniem zarówno do analiz ilościowych, jak i jakościowych, a także do analizy metabolitów i identyfikacji związków kompleksowych w Tradycyjnej Medycynie Chińskiej [21]–[22]. Opracowano również analizę głównych składowych (PCA) i rzutowanie ortogonalne na analizę dyskryminacyjną utajonej struktury (OPLSDA) w celu identyfikacji potencjalnych związków markerowych. Kodowanie kreskowe DNA, łatwiejsza i bardziej uniwersalna technologia markerów molekularnych, wykorzystuje fragment DNA do identyfikacji gatunków lub rodzajów. Jest obiektywny, dokładniejszy i łatwiejszy do wykonania niż tradycyjne metody identyfikacji i inne technologie markerów molekularnych. Co więcej, kodowanie kreskowe DNA zostało z powodzeniem zastosowane do identyfikacji zwierząt i roślin, w tym roślin leczniczych [23]–[26].

Celem tych badań jest ustanowienie systemu metod naukowych, połączonego UPLC-QTOF/MS i kodowaniem kreskowym DNA, do rozróżniania dwóch roślin pochodzenia roślinnegoCistanchesHerba.

Materiały i metody

Oświadczenie etyczne

Potwierdzamy, że badania terenowe nie obejmowały gatunków zagrożonych lub chronionych. W przykładowych informacjach uwzględniono współrzędne GPS, patrz tabela 1."

Tabela 1 PróbkiCistanchedeserticola i Cistanche tubulosa.

WLMQ oznaczało miasto Wu Lu Mu Qi; GJH oznaczało Gan Jia Hu; HBKSEMG oznaczało Hoboksar Mongol Autonomous County; KLMY oznaczało miasto Ke La Ma Yi; BDJLSM oznaczało pustynię Badain Jaran; ALSZQ oznaczało lewy sztandar Alxa; DSX oznaczało hrabstwo Dong San; CL oznaczało hrabstwo Ce Le; MF oznaczało hrabstwo Min Feng; HT oznaczało hrabstwo He Tian.

Materiały roślinne i odczynniki

Soczyste łodygiCistanchesHerby zebrano z dzikich obszarów pustynnych w Mongolii Wewnętrznej, w prowincjach Qinghai, w regionie autonomicznym Xinjiang Uygur, w Chińskiej Republice Ludowej (tabela 1) w maju 2012 r. Wszystkie próbki do badań zebrano w dzikich regionach pustynnych, a nie na gruntach prywatnych, gdzie nie były wymagane żadne specjalne uprawnienia. Tożsamość botaniczna łodyg została potwierdzona przez dr Linfang Huang. Próbki bonów zostały zdeponowane w Instytucie Rozwoju Roślin Leczniczych. Do analizy UPLC zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) acetonitryl (Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy) i kwas mrówkowy (Tedia, USA). Wodę dejonizowaną oczyszczono stosując system Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Wszystkie innechemikaliabyły klasy analitycznej.

przygotowanie próbki

CistanchesPróbki Herby (1,0 g, 65-mesh) przeniesiono do 50-ml kolby stożkowej i dodano 50 ml 70% metanolu. Po moczeniu przez 30 min, ultradźwięki (35 kHz) prowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 min. Po odwirowaniu przy 10,000 obr/min przez 10 min, supernatant przechowywano w 4 stopniach i filtrowano przez membranę 0,22-μm przed wstrzyknięciem do systemu UPLC-QTOF/MS do analizy.

UPLC-QTOF/MS

Do analizy UPLC zastosowano następujące systemy/parametry: system Waters Acquity (Waters) wyposażony w pompę do dostarczania binarnego rozpuszczalnika, automatyczny podajnik próbek i detektor PDA połączony ze stacją danych Waters Empower 2; ultradźwięki (250W, 50kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Chiny); oraz elektroniczny model wagi analitycznej AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zurych, Szwajcaria). Zastosowano kolumnę Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 x 100 mm, Waters) i kolumnę zabezpieczającą Waters C18 (ten sam materiał, wody) i utrzymywano w 30°C. Faza ruchoma składała się z 0,1% wodnego roztworu kwasu mrówkowego (A) i acetonitrylu (B) z następującym programem gradientu: 0-3 min, 10-22% B; 3-4 min, 22-23% B; 4-6 min, 23-35% B; 6-8 min, 35-37% B; 8-11 min, 37-42% B; 11-12 min, 42-48% B; 12-15 min, 48 procent -50 procent B przy szybkości przepływu 0,3 ml/min. Objętość wstrzyknięcia wynosiła 5 µl.

Analizę UPLC/MS przeprowadzono na systemie QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, Wielka Brytania) wyposażonym w źródło jonizacji elektrorozpylania (ESI) działające w trybie jonów ujemnych. Jako gaz desolwatacyjny zastosowano N2. Temperaturę desolwatacji ustawiono na 45{{10}} stopni przy szybkości przepływu 800 l/h, a temperaturę źródła ustawiono na 120 stopni. Napięcia kapilary i stożka zostały ustawione odpowiednio na 2500 i 40 V. Dane zebrano między 50-1200 Da z czasem skanowania 0.1-s i opóźnieniem między skanami 0.01-s w czasie 15-min analizy. Jako gaz do zderzeń użyto argonu pod ciśnieniem 7.06661023 Pa. Wszystkie dane MS zebrano przy użyciu systemu LockSpray, aby zapewnić dokładność masy i powtarzalność. Jon [MH]- leucyny-enkefaliny przy m/z 554,2615 zastosowano jako masę blokującą w trybie ujemnego ESI.

Dane UPLC-QTOF/MS dlaCistanchesPróbki ziół przeanalizowano w celu zidentyfikowania potencjalnych zmiennych dyskryminujących. Wyszukiwanie pików, wyrównanie i filtrowanie surowych danych ES przeprowadzono przy użyciu menedżera aplikacji Marker Lynx, wersja 4.1 (Waters, Manchester, Wielka Brytania). Zastosowano następujące parametry: czas retencji (tR) 0–15 min, masa 50-1200 Da, tolerancja czasu retencji 0,02 min oraz masa tolerancja 0,02 Da. Wykorzystano trzy powtórzone próbki zebrane z każdej lokalizacji geograficznej (n = 3). Do stworzenia modelu wykorzystano łącznie 6339 zmiennych.

Kodowanie kreskowe DNA: ekstrakcja DNA, amplifikacja PCR i sekwencjonowanie

Próbki pobrane z suszonych mięsistych łodyg C. deserticola i C.tubulosa (30 mg) pocierano przez 2 minuty z częstotliwością 30 r/s. DNA ekstrahowano zgodnie z instrukcjami producenta (Tiangen). W szczególności protokół został zmodyfikowany tak, że chloroform został zastąpiony mieszaniną chloroformu: alkoholu izoamylowego (24∶1 w tej samej objętości) i roztworu buforowego GP2 z izopropanolem (taka sama objętość). Roztarty proszek umieszczono w 1,5 ml probówkach Eppendorfa, dodano 700 µl wstępnie ogrzanego do 65 stopni GP1 i 1 µl merkaptoetanolu, aby wymieszać na worteksie przez 10–20 s i inkubowano przez 60 minut w 65 stopniach; Dodanie 700 µl mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24∶1), wirowanie przez 5 minut przy 12000 rpm (∼13400×g); Odpipetować supernatant do nowej probówki, dodając 700 µl izopropanolu, mieszając przez 15–20 minut; Przeciągnięcie całej mieszaniny do kolumny wirowej CB3 i wirowanie przez 40 s przy 12000 obr./min; Odrzucenie filtratu i dodanie 500 µl GD (dodawanie ilościowo bezwodnego etanolu przed użyciem), wirowanie przy 12000 obr/min przez 40 s; odrzucenie przesączu i dodanie 700 µl PW (dodawanie ilościowo bezwodnego etanolu przed użyciem) w celu przemycia membrany, wirowanie przez 40 s przy 12000 obr./min; Odrzucenie filtratu i dodanie 500 µl PW, wirowanie przez 40 s przy 12000 rpm; Odrzucenie filtratu i wirowanie przez 2 minuty przy 12000 obr./min w celu usunięcia pozostałości buforu do płukania PW; Przeniesienie kolumny wirówkowej CB3 do czystej 1,5 ml probówki Eppendorfa i suszenie w temperaturze pokojowej przez 3–5 minut; Wiruj przez 2 minuty przy 12000 obr./min, aby uzyskać całkowite DNA. Startery do łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) oparto na wcześniej opisanych sekwencjach [4], [5]. Mieszaniny reakcyjne PCR zawierały 2-µl matrycy DNA, 8.5-µl ddH2O, 12.5-µl 2x Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Chiny), 1/{ {57}}μl starterów do przodu/do tyłu (F/R) (2,5 μM), w końcowej objętości 25 μl. Amplifikację PCR przeprowadzono w sposób opisany przez Kress et al. [4]. Starterami reakcji PCR były fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5′-3′) oraz rev TH:CGGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5′-3′). Produkty PCR rozdzielono i wykrywano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Produkty PCR oczyszczono zgodnie z protokołem producenta i bezpośrednio poddano sekwencjonowaniu.

Wyrównanie i analiza sekwencji

Sekwencje ITS i ITS2 zostały zebrane z bazy danych GenBank. Sekwencje z sekwencjonowania próbek przekazano do bazy danych GenBank (numery dostępu wymieniono w tabeli 1), zmontowano za pomocą CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co., USA) i wyrównano za pomocą ClustalW. Kimura 2-Odległości parametrów (K2P), zawartość GC w bazie i drzewa sąsiadujące (NJ) zostały obliczone i skonstruowane przy użyciu MEGA 5.05 z metodą Bootstrap (ponowne próbkowanie 1000) i modelu K2P [27]. Luka w kodzie kreskowym (obszar odstępnika, który powstał między wewnątrzgatunkowymi i międzygatunkowymigenetycznyzmienności) oraz skuteczność identyfikacji (zdolność identyfikacji do porównywania różnych kodów kreskowych) zostały sporządzone i obliczone na podstawie metody opisanej przez Meyera i Paulaya [28].

Wyniki

Wstępne przypisanie pików przez UPLC-QTOF/MS

Reprezentatywne chromatogramy C. deserticola i C.tubulosa z różnych obszarów produkcyjnych przedstawiono na rycinie 1. Chromatogram linii papilarnych wykazał podobieństwa międzyCistanchesPróbki ziół. W sumie wykryto 23 zakwalifikowane piki masowe i zidentyfikowano 16 pików, dopasowując czasy retencji i widma masowe do wcześniej opisanych (Tabela 2) [29]–[35]. Piki 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 i 23 zostały wstępnie zidentyfikowane jako cistanozyd F, kwas mussaenozydowy, cistanbulozyd C1/C2, kamneozyd II , izomer kamneozydu II, echinakozydu, cistanozydu A, akteozydu, izoakteozydu, syringalidu A-3′- -L-ramnopiranozydu, cistanozydu C, 2′-acetyloakteozydu, osmantuzydu B, cistanozydu D, tubulozydu B, oraz cistancynenzydu A, odpowiednio.Chemicznyskładniki określono jako głównie glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), podczas gdy jeden związek, kwas mussaenozydowy, był irydoidalnym polisacharydem. PhG są głównymi związkami aktywnymi pod względem leczenia niewydolności nerek oraz działania antyoksydacyjnego i neuroprotekcyjnego [36].

Rysunek 1 Reprezentatywne chromatogramy C. deserticola i C.tubulosa.

Po lewej stronie znajdowały się chromatogramy C. deserticola zebrane z różnych miejsc; po prawej stronie były chromatogramy C. tubulosa zebrane z różnych lokalizacji. Ten rysunek pokazuje różnice między tymi dwoma początkami wchemicznyprofile.

Tabela 2 Wstępnie zidentyfikowane związki z C. deserticola i C.tubulosa.

PCA C. deserticola i C. tubulosa

Do rozróżnienia próbek różnych gatunków roślin wykorzystano PCA. PCA to nienadzorowana wielowymiarowa metoda analizy danych, której celem jest wizualizacja podobieństw i/lub różnic w danych wielowymiarowych składu metabolitów wtórnych [37]. Dwuskładnikowy model PCA odpowiadał łącznie za 46,04 proc. zmienności (PC1, 36,43 proc.; PC2, 9,61 proc.). Rysunek 2 pokazuje, że 24 próbki pogrupowano w dwie grupy w wynikach PCA wykreślonych według pochodzenia gatunku, co wskazuje, że skład chemiczny C. deserticola i C. tubulosa różnił się znacząco.

Rysunek 2 PCA C. deserticola i C. tubulosa.

Próbki te podzielono na dwie grupy w zależności od ich pochodzenia gatunkowego, co wskazywało, że skład chemiczny C. deserticola i C. tubulosa był znacząco różny.

OPLS-DA i identyfikacja znaczników

Aby zidentyfikować potencjałchemicznymarkery do rozróżniania dwóch gatunków, wygenerowano wykres S OPLS-DA (ryc. 3). Na wykresie S każdy punkt reprezentuje jedną parę jonów tR–m/z. Osie X i Y reprezentują odpowiednio wkład i pewność jonu; im większa odległość pary jonów t R–m/z od zera, tym większy udział/pewność tego jonu w różnicy między dwiema grupami. Tak więc jon tR–m/z wskazujący na dwa końce „S” reprezentuje charakterystyczne markery o najwyższej pewności w każdej grupie.

Rysunek 3 OPLS-DA (wykres S) C. deserticola i C.tubulosa.

Jeden wykres przedstawia jedną parę jonów tR–m/z. Te kwadratowe działki byłychemicznyStwierdzono, że jony znacznikowe rozróżniają dwa źródła. Wykresy kwadratowe w trzecim kwadrancie przedstawiały jony markerów chemicznych o wyższym udziale i pewności w C. deserticola, a wykresy kwadratowe w pierwszej ćwiartce to jony markerów chemicznych o wyższym udziale i pewności w C. tubulosa.

Wyniki OPLS-DA wykazały, że UPLC-QTOF/MS można wykorzystać do rozróżnienia C.deserticolaod C.tubulosa(rys. 3). Określono w sumie sześć wiarygodnych i znaczących markerów ułatwiających odróżnienie tych grup (tabela 3). Tożsamości trzech potencjalnych markerów zostały wstępnie przypisane. Składniki skorelowane z tymi trzema jonami zostały wstępnie zidentyfikowane jako izomery kamneozydu II, cistanozydu C i cistanozydu A. Związki markerowe a, b i c można wykorzystać do rozróżnienia dwóch gatunków roślin, jako intensywności jonów a i b w C.deserticolabył wyższy niż w C. tubulosa (ryc. 4A, 4B), a marker c można było wykryć w C. tubulosa, ale nie w C. deserticola (ryc. 4C).

Rysunek 4 Intensywność jonów znaczników a, b i c.

Intensywność jonów markerowych a i b w C. deserticola była wyższa niż w C. Tubulosa, a jon markerowy c można było wykryć w C. tubulosa, ale nie można go było wykryć w C. deserticola.

Tabela 3 Pary jonów Marer tR–m/z na wykresie S.

Kod kreskowy DNA: informacje o sekwencji i wydajność identyfikacji

Informacje o sekwencji przedstawiono w tabeli 4. Średniagenetycznyodległość psbA-trnH (0.1732) była istotnie większa niż w pozostałych dwóch regionach (0.0740, 0,1197). Średnia zawartość GC w psbA-trnH (20,64 procent) była mniejsza niż w pozostałych dwóch regionach (55,00 procent, 55,00 procent). Chociaż w tym badaniu nie uzyskano wskaźnika powodzenia ITS i ITS2, region psbA-trnH działał dobrze w amplifikacji i sekwencjonowaniu PCR (100 procent, 87,23 procent). Skuteczność identyfikacji została osiągnięta za pomocą analizy BLAST1 i metody najbliższej odległości i odzwierciedlała głównie wskaźnik powodzenia kodów kreskowych. Region psbA-trnH był wyraźnie wyższy niż pozostałe dwa kody kreskowe pod względem skuteczności identyfikacji w oparciu o dwie metody. Niedobór sekwencji jest najprawdopodobniej powodem, dla którego region ITS wykazywał 100-procentową skuteczność identyfikacji w oparciu o metodę BLAST1, a 0 w oparciu o metodę najbliższej odległości.

Tabela 4 Skuteczność identyfikacji trzech loci przy użyciu różnych metod identyfikacji gatunku.

Analiza rozbieżności genetycznej za pomocą sześciu parametrów

Sześć parametrów wykorzystano do analizy zmienności wewnątrzgatunkowej i rozbieżności międzygatunkowej przy użyciu trzech kodów kreskowych (tabela 5). Znacząca różnica między odmianami między- i wewnątrzgatunkowymi wskazywała na użyteczność kodów kreskowych DNA. W tym przypadku minimalna odległość międzygatunkowa trzech kodów kreskowych była wyższa niż maksymalna odległość międzygatunkowa. Co więcej, region psbA-trnH miał większą maksymalną odległość wewnątrzgatunkową i średnią odległość międzygatunkową niż pozostałe dwa kody kreskowe, co wskazuje, że region psbA-trnH dobrze radził sobie z rozróżnianiem dwóch źródełCistanchesHerba.

Tabela 5 Analiza rozbieżności międzygatunkowej i zmienności wewnątrzgatunkowej trzech kodów kreskowych.

Analiza luki w kodach kreskowych w celu identyfikacji C. deserticola i C. tubulosa

Luka w kodach kreskowych przedstawia niezwykłą zmienność międzygatunkową i wewnątrzgatunkową oraz pokazuje oddzielne, nienakładające się rozkłady między próbkami wewnątrzgatunkowymi i międzygatunkowymi. W tym badaniu (ryc. 5) zakres odległości ustalono na 0–{7}}.45, ponieważ największa odległość K2P psbA-trnH między C. deserticola i C. tubulosa była bliska { {11}}.45. Trzy kody kreskowe wykazywały wyraźne luki w rozkładzie zmienności wewnątrz- i międzygatunkowej. Co więcej, przerwa w psbA-trnH była znacznie większa niż w pozostałych dwóch kodach kreskowych. Dlatego region psbA-trnH może być idealnym kodem kreskowym do rozróżniania dwóch źródełCistanchesHerba.

Rysunek 5 Względny rozkład rozbieżności międzygatunkowej i zmienności wewnątrzgatunkowej w trzech kodach kreskowych.

Przeanalizowano trzy kody kreskowe ITS2, ITS, psbA-trnH pod kątem względnego rozkładu rozbieżności międzygatunkowej i zmienności wewnątrzgatunkowej między C. deserticola i C. tubulosa na podstawie K2Pgenetycznydystans.

Drzewo sąsiadujące (NJ)

Drzewo NJ ilustruje relacje między gatunkami i ułatwia określenie ich grupowania. W niniejszej pracy zbudowano drzewo NJ trzech kodów kreskowych w oparciu o model K2P (rys. 6). Wyniki pokazały, że dwa źródłaCistanchesHerba podzieliła się na dwa klady oddzielnie. W ten sposób drzewo NJ wyraźnie rozróżniaC. deserticola i C. tubulosa.

Rysunek 6 Drzewo NJ C. deserticola i C.tubulosa z trzema kodami kreskowymi.

Zbudowano drzewo NJ C. deserticola i C. tubulosa z trzema kodami kreskowymi. Wyświetlane są wyniki ładowania początkowego (1000 powtórzeń) (Większe lub równe 50 procent) dla każdej gałęzi. C. deserticola i C.tubulosa były wyraźnie skupione w dwóch kladach.

Dyskusja i wnioski

CistanchesHerba jest ważnym materiałem leczniczym powszechnie używanym do odżywiania społeczności azjatyckiej [38]. Jednak dwa źródła Cistanches Herba, C. deserticola i C.tubulosa, mają odpowiednio różny skład chemiczny i działanie farmakologiczne. Jednocześnie te dwa źródła różnią się pod względem zastosowania klinicznego i rynku towarowego. KlasyfikacjaCistanchejest zdezorientowany, a masowe substytuty i podróbki zalewają rynek z powodu braku zasobów i specjalnego środowiska uprawy dla Cistanches Herba. Przyjmuje się, że rodzaj Cistanche obejmuje cztery gatunki i jedną odmianę: C. deserticola, C.tubulosa, C.Sinensis, C. salsa i C. salsa var. albiflora [39]. Naukowcy w Japonii uznali pochodzenie Cistanches Herba za C. salsa [40]–[43], podczas gdy Tu [44]–[46] zidentyfikował ją jako C. deserticola. W związku z tym jest mylony w klasyfikacji Cistanche i trudno odróżnić dwa pochodzenie Cistanches Herba.

Tradycyjne metody kontroli jakościCistanchesHerba to identyfikacja morfologiczna [47], [48], identyfikacja mikroskopowa [49] oraz TLC (chromatografia cienkowarstwowa) [50], [51], FTIR (spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera) [14], HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa ) [52], [53]. Metody morfologiczne i mikroskopowe mogą z łatwością odróżnić gatunki z różnych rodzajów lub rodzin, które mają duże różnice w cechach morfologicznych i mikroskopowych, podczas gdy trudno jest odróżnić gatunki rodzeństwa. TLC i FTIR mogą wyraźnie rozróżniać gatunki, które mają różne rodzaje składu chemicznego, podczas gdy trudno jest je określićchemicznykomponent i treść. HPLC służy głównie do różnicowania gatunków o różnychchemicznyzawartości pierwiastków, niemniej jednak czas analizy jest dłuższy, a czułość relatywnie niższa w porównaniu z UPLC. W związku z tym technologia UPLC-QTOF/MS była szybsza i dokładniejsza w określaniu składu chemicznego niż inne metody chemiczne. Metody identyfikacji molekularnej dobrze sprawdzają się w rozróżnianiu na podstawiegenetycznytakie jak SDS-PAGE (elektroforeza w żelu siarczanu dodecylu sodu-poliakryloamidu) [54], AFLP (polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów) [55], [56]. Jednak te metody molekularne nie są łatwe w obsłudze i nie są uniwersalne. Odpowiednio, kodowanie kreskowe DNA może rozróżniać gatunki bardziej uniwersalnie, szybciej i dokładniej niż inne metody molekularne. Dla gatunków z tego samego rodzaju i bliskichgenetycznyzwiązku, te metody same w sobie mogą nie sprawdzać się dobrze w identyfikacji. Tutaj połączyliśmy UPLC-QTOF/MS i kodowanie kreskowe DNA w identyfikacji C. deserticola i C.tubulosa i oceniliśmy chemiczne i molekularne markery, które pozwoliłyby na ich dyskryminację. Wykryto 23 zakwalifikowane piki masowe, a 16 zidentyfikowano za pomocą UPLC-QTOF/MS, a trzy potencjalne związki markerowe zostały po raz pierwszy odkryte w celu ułatwienia rozróżnienia dwóch źródeł za pomocą analizy PCA i OPLS-DA. Ponadto cztery wskaźniki zostały ocenione za pomocą technologii kodów kreskowych DNA pod kątem ich zdolności do rozróżnienia dwóch źródeł: wydajności identyfikacji, wydajności genetycznej, luki w kodach kreskowych i analizy drzewa NJ. Region psbA-trnH był wspierany jako odpowiedni kod kreskowy DNA do rozróżniania C. deserticola i C.tubulosa.

Podsumowując, najpierw ustaliliśmy nową cząsteczkę ichemicznyanaliza-połączona metoda rozróżniania i kontroli jakości w dwóch źródłachCistanchesHerba. Kod kreskowy DNA może rozróżniać dwa źródła wgenetycznyzmienność i autentyczność gatunków uniwersalnie i dokładnie; Technologia UPLC-QTOF/MS może analizować skład chemiczny w celu szybkiej i dokładnej oceny jakości materiałów medycznych. Połączona metoda kodowania kreskowego DNA i technologii UPLC-QTOF/MS gwarantuje dokładniejszą i naukową identyfikację wielu źródeł materiałów medycznych i może służyć jako metoda identyfikacji innych mylących gatunków lub rodzajów w klasyfikacji.

Oświadczenie o finansowaniu

Badanie zostało wsparte grantami z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych w Chinach (nr 81274013, strona internetowa: www.nsfc.gov.cn). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji czy przygotowaniu rękopisu.

Bibliografia

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY i in. (1996) Porównanie odżywiania nerek i yang wzmacniające skuteczność trzech różnych gatunków ziółodległości. Journal of Chinese Medical Materials 19: 420-421. [Google Scholar]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Porównanie funkcji odżywiania nerek i wzmacniania yang trzech różnych gatunków ziela cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169-171. [PubMed] [Google Scholar]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Postępy w badaniach nadchemicznyskładniki w roślinachCistancheHoffinga. et Link. Chińskie tradycyjne i ziołowe leki 34: 473–476. [Google Scholar]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S i in. (2006) Fenyletanoidowe oligoglikozydy i acylowane oligocukry o działaniu rozluźniającym naczynia z Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468-7475. [PubMed] [Google Scholar]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ i in. (2009) Hipocholesterolemiczne działanie ekstraktu z Cistanche tubulosa, tradycyjnej chińskiej surowej medycyny, u myszy. Am J Chin Med 37: 1125-1138. [PubMed] [Google Scholar]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S i in. (2010) Działanie hamujące akteozydu wyizolowanego zCistanchetubulosa włączonachemicznyuwalnianie mediatora i wytwarzanie zapalnych cytokin przez komórki RBL-2H3 i KU812. Planta Med, 1512–1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H i in. (2010) Acylowane oligoglikozydy fenyloetanoidowe o działaniu hepatoprotekcyjnym z rośliny pustynnejCistanchekanaliki. Bioorg Med Chem 18: 1882-1890. [PubMed] [Google Scholar]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Irydoidalne i acykliczne glikozydy monoterpenowe, kankanozydy L, M, N, O i P z Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403-1407. [PubMed] [Google Scholar]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identyfikacja i badanie komercyjnego surowego leku herba cistanchis. Journal of Chinese Medical Materials 20: 117–122. [PubMed] [Google Scholar]

10. Zhu SY (2001) Farmakognostyczna identyfikacja Cistanche tubulosa, mylonego gatunkuCistanchedeserticola. Dziennik chińskich materiałów leczniczych 24: 24–25. [PubMed] [Google Scholar]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, i in. (2013) Mikroskopowa identyfikacja trzech herba cistanches w Xin Jiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881-883. [Google Scholar]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Mikroskopowa identyfikacja komercyjnych Herba Cistanches za pomocą cyfrowej techniki obrazowania. Journal of Chinese Medical Materials 27: 400-402. [PubMed] [Google Scholar]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Badanie identyfikacji ziółcistanchesi domieszki. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318. [Google Scholar]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) Badania spektroskopowe FTIR i 2D-IR na różnych źródłach ziółcistanches. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900. [PubMed] [Google Scholar]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) Identyfikacja Cistanche deserticola z Boschniakla rossica i Cynomorium songaricum przy użyciu FTIR i dwuwymiarowej spektroskopii korelacyjnej w podczerwieni. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Scholar]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Badanie odcisku palca HPLC zCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257. [Google Scholar]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Chromatograficzne odciski palców Cistanche deserticola metodą HPLC. Chińskie tradycyjne i ziołowe leki 36: 268-271. [Google Scholar]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) IdentyfikacjaCistanchegatunek (Orobanchaceae) na podstawie sekwencji regionu międzygenowego plastydu psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130. [PubMed] [Google Scholar]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identyfikacja gatunków Cistanche przezChemicznyi Inter-proste powtarzanie linii papilarnych. Biol. Farmacja Byk. 32: 142–146. [PubMed] [Google Scholar]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W i in. (2012) Charakterystyka strukturalna i identyfikacja glikozydów fenyloetanoidowych zCistanchesdeserticola YC Ma przez UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Analiza fitochemiczna 23: 668-676. [PubMed] [Google Scholar]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) Analiza UPLC-QTOF/MS alkaloidów w tradycyjnych przetworzonych Coptis Chinensis Franch. Dopełniacz oparty na Evid Alternatywny Med 2012: 942384. [artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Google Scholar]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Badanie technologii przetwarzania liścia Loquat (Eriobotrya japonica) za pomocą ultrawydajnej chromatografii cieczowej - spektrometria masowa kwadrupolowa czasu przelotu w połączeniu z chemometrią. PLoS ONE 8: e64178. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Barkodowanie życia zwierząt: rozbieżność podjednostki 1 oksydazy cytochromu c wśród blisko spokrewnionych gatunków. Proc. R. Soc. Londyn. B. 270 Suplement 1S96-99. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

24. Hebert PD, Cywińska A, Ball SL, Waard JR (2003) Identyfikacja biologiczna za pomocą kodów kreskowych DNA. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Wykorzystanie kodów kreskowych DNA do identyfikacji roślin kwitnących. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369–8374. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J i in. (2010) Walidacja regionu ITS2 jako nowego kodu kreskowego DNA do identyfikacji gatunków roślin leczniczych. PLoS One 5: e8613. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M i in. (2011) MEGA5: Molekularna ewolucjaGenetykaAnaliza przy użyciu metod maksymalnego prawdopodobieństwa, odległości ewolucyjnej i maksymalnej oszczędności. Mol Biol Evol 28: 2731–2739. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) Kody kreskowe DNA: poziomy błędów na podstawie kompleksowego pobierania próbek. PLoS Biol 3: e422. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed] [Google Scholar]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Badania nad składnikami Cistanchis Herba. IV. Izolacja i struktury dwóch nowych glikozydów fenylopropanoidowych, cystanozydów C i D. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885. [Google Scholar]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Badania nad składnikami Cistanchis Herba. VI. Izolacja i struktury nowego glikozydu irydowego, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google Scholar]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Różnicowanie ziółCistanchesza pomocą odcisku palca z wysokosprawną chromatografią cieczową – detekcją diodową – spektrometrią mas. Journal of Chromatography A 1216: 2156-2162. [PubMed] [Google Scholar]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W i in. (2012) Charakterystyka strukturalna i identyfikacja glikozydów fenyloetanoidowych z Cistanches deserticola YC Ma metodą UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Fitochemiczny Anal 23: 668–676. [PubMed] [Google Scholar]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC i in. (2008) Izolacja i oczyszczanie glikozydów fenyloetanoidowych z Cistanche deserticola metodą szybkiej chromatografii przeciwprądowej. Chemia żywności 108: 702-710. [PubMed] [Google Scholar]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S i in. (2013) Analiza ilościowaCistanchesHerba wykorzystująca wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z detekcją diodową i spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z metodami chemometrycznymi. J września Sci 26: 1945-1952. [PubMed] [Google Scholar]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Badania nad składnikami Cistanchis Herba. V. Izolacja i struktury dwóch nowych glikozydów fenylopropanoidowych, Cistanoside E i F. Chem Pharm Bull 33: 1452-1457. [Google Scholar]

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analizachemicznyskładniki w gatunkach Cistanche. J Chromatogr A 1216: 1970-1979. [PubMed] [Google Scholar]

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Przetwarzanie danych w nauce i technologii. Chemometria: podręcznik.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) EkotypyCistanchedeserticola na podstawiechemicznyskład i cechy molekularne. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328. [Google Scholar]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) badania i rozwój przemysłu herba cistanches. Journal of Chinese Pharmaceutical 46: 882-887. [Google Scholar]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A i in. (1987) Nowe glikozydy fenyloetanoidowe odCistanchetubulosa (SCHRENK) Hak. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309-3314. [Google Scholar]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Badania nad składnikami Cistanchis herba III. Chem Pharm Bull 32: 3009-3014. [Google Scholar]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Badania nad składnikami Cistanchis herba IV. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885. [Google Scholar]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Badania nad składnikami Cistanchis herba VI. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google Scholar]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T i in. (1995) Badania farmakognostyczne Cistanchis Herba (I). Nat Med 49: 383-393. [Google Scholar]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T i in. (1995) Badania farmakognostyczne Cistanchis Herba (II). Nat Med 49: 394-400. [Google Scholar]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011) BadaniechemicznyskładnikiCistanchedeserticola. Chin Pharm J 46: 1053-1058. [Google Scholar]

47. Gu XY, Wang X (2013) Identyfikacja między oryginalnymi roślinami RouCongRong a odmianami mieszanymi. Western Journal of Traditional Chinese Medicine 26: 17-18. [Google Scholar]

48. Zhang HJ, Ding XF Identyfikacja Cistanche deserticola i domieszek. Shizhen Medicine and Materia Research, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG i in. (2013) mikroskopowe badania identyfikacyjne trzech rodzajów Cistanche pochodzą z prowincji Xinjiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881-883. [Google Scholar]

50. Huang M, Liu G (2004) Badania identyfikacyjneCistanchedeserticola i Cynomorium songaricum. Dziennik HuBei tradycyjnej medycyny chińskiej. 26: 54–55. [Google Scholar]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) Postęp badań nad kontrolą jakości i oceną Cistanche deserticola YC Ma. Światowa Nauka i Technologia - Modernizacja Tradycyjnej Medycyny Chińskiej. 11: 439–444. [Google Scholar]

52. Ma ZG (2011) Różnicowanie przetworzonych Cistanche Sinensis G.Beck i Herba Cistanches za pomocą odcisków palców HPLC. Podbródek. Pharm J. 46: 899-902. [Google Scholar]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X i in. (2011) Badanie odcisków palców HPLC zCistanchekanaliki. Xinjiang dziennik tradycyjnej medycyny chińskiej. 29: 54–56. [Google Scholar]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) SDS-PAGE rozpuszczalnych białek w czterech roślinach Cistanche Hoffing. Et Link. Tradycyjne chińskie i ziołowe leki 37: 1399–1402. [Google Scholar]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) Analiza AFLP na różnorodność zasobów plazmy zarodkowej w uprawnych i dzikich Cistanche deserticola. Chińskie tradycyjne i ziołowe leki 38: 1703-1707. [Google Scholar]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011) Badanie zmienności wewnątrzgatunkowejCistanchedeserticola YCMa przy użyciu markerów molekularnych AFLP. Ogrodnictwo Północnej, 141-143.

Artykuły z PLoS ONE są udostępniane tutaj dzięki uprzejmości Biblioteki Publicznej Nauki

PLoS Jeden. 2014; 9(5): e98061.

Opublikowano online 2014 22 maja. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031