Działanie przeciwstarzeniowe ekstraktu z kultury kalusa Leontopodium Alpinum (Edelweiss) poprzez profilowanie transkryptomu

Proszę kliknąćoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

Abstrakcyjny:Szarotka alpejska (Leontopodium Alpinum) z rodziny Asteraceae to dziki kwiat, który rośnie w skalistych miejscach wapiennych. Tutaj zbadaliśmy skuteczność ekstraktu z kultury kalusa szarotki alpejskiej (ekstrakt z kultury kalusa Leontopodium Alpinum; LACCE) przy użyciu wielu testów od in vitro do in vivo, a także profilowania transkryptomu. Kilka wyników testów in vitro wykazało silną aktywność przeciwutleniającą LACCE w odpowiedzi na terapię UVB. Ponadto LCCE tłumił stany zapalne i zmarszczki; jednak aktywność nawilżająca została zwiększona przez LACCE. Test kliniczny in vivo wykazał, że stałe stosowanie LACCE na twarzy i tkankach skóry poprawia zmarszczki przeciwoczodołowe, elastyczność skóry, gęstość skóry i grubość skóry w porównaniu z placebo. Wyniki sekwencjonowania RNA wykazały, że co najmniej 16,56 procent ludzkich genów ulegało ekspresji w komórkach keratynocytów. geny regulowane w górę przez LACCE, kodujące kilka białek KRT; DDIT4, BNIP3 i IGFBP3 brały udział w pozytywnej regulacji procesu rozwojowego, programowanej śmierci komórek, keratynizacji i rogowaceniu tworzącym bariery skórne, które zapewniają wiele korzyści dla ludzkiej skóry. Natomiast geny o obniżonej regulacji były genami reagującymi na stres, w tym metalem, utlenianiem, ranami, niedotlenieniem i infekcją wirusową, co sugeruje, że LACCE nie powodowało żadnego szkodliwego stresu na skórze. Nasze kompleksowe badanie wykazało, że LACCE jest obiecującym środkiem w kosmetykach przeciwstarzeniowych.

Słowa kluczowe:przeciw starzeniu; kostnina; szarotka;komórki skóry; transkryptom

1. Wstęp

Edelweiss (Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) z rodziny Asteraceae to dziki kwiat, który rośnie w skalistych, wapiennych miejscach na dużych wysokościach, takich jak Alpy Szwajcarskie [1,2]. Ze względu na rzadkość występowania białych, krótkotrwałych kwiatów, szarotka reprezentuje piękno i czystość nawiązującą do Alp i Karpat. Ponadto wiele krajów, w tym Austria, Bułgaria, Rumunia, Słowenia i Szwajcaria, uważa szarotkę za symbol narodowy.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Od dawna szarotka jest stosowana jako tradycyjny lek przeciw bólom brzucha, zapaleniu oskrzeli, biegunce, czerwonce i gorączce [3, A]. Ostatnio kilka badań wykazało skuteczność ekstraktów z szarotki alpejskiej w zwalczaniu stanów zapalnych u myszy i szczurów [3] oraz ludzkich keratynocytów i komórek śródbłonka [4]. Ponadto ekstrakty z korzenia szarotki alpejskiej zawierają składniki, które wzmagają neuroprzekaźnictwo cholinergiczne, co wskazuje na jej potencjał dla środków przeciwotępiennych [5] i przeciwutleniaczy, takich jak

kwas leontopodowy A i kwas 35-kafeoilochinowy, które mogą być stosowane jako środki przeciwstarzeniowe [6]. Ponadto ekstrakty z szarotki wykazywały działanie przeciwbakteryjne na Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia i Streptococcus pyogenes, co sugeruje możliwość ich zastosowania etnomedycznego w chorobach układu oddechowego i jamy brzusznej [7].

W kilku wcześniejszych badaniach analizowano związki zawarte w ekstraktach z szarotki alpejskiej. Na przykład metoda chromatografii kapilarnej ujawniła 12 ważnych farmakologicznie związków, w tym flawonoidy, kwasy kawowe i kwas leontopodowy, z nadziemnych części szarotki [8]. Do ekstrakcji przeciwutleniaczy z roślin szarotki alpejskiej opracowano metody odśrodkowej chromatografii rozdzielającej (CPC) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) [6]. Wiadomo, że związki aktywne ekstraktów z szarotki alpejskiej między nadziemnymi częściami a korzeniami są zróżnicowane[3]. Na przykład włochate korzenie szarotki produkują farmakologicznie aktywne lignany, takie jak login i 5-metoksy-login, które mogą być stymulowane przez kilka innych składników, takich jak azotan srebra, sacharoza, jasmonian metylu i ekstrakt z drożdży [ 9].korzyści z ekstraktu z cistancheCo więcej, wzorce metaboliczne 11 różnych gatunków Leontopodium zostały ujawnione za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (1H NMR) i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) w ich zależności taksonomicznej [10].

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Kalus roślinny można zdefiniować jako niezorganizowane lub niezróżnicowane masy komórkowe, które są łatwo indukowane przez zranienie w celu pokrycia rany rośliny lub sztuczne przeprowadzenie systemu in vitro. Kalus roślinny jest sztucznie hodowany przez dodanie składników odżywczych i regulatorów wzrostu roślin w antyseptycznych warunkach wzrostu. Obecnie w bioreaktorze można wyprodukować dużą liczbę specyficznych komórek roślinnych o jednakowej jakości. Ponadto komórka roślinna posiada zdolność określaną jako totipotencja, czyli potencjał genetyczny komórki roślinnej do wytwarzania całej dojrzałej rośliny [11]. W ten sposób możliwe jest wytworzenie dojrzałej rośliny ze specyficznego kalusa roślinnego. Ponadto kalus może być szeroko stosowany do regeneracji roślin w celu zachowania rzadkich i zagrożonych roślin [12,13].

Podobnie jak komórki zwierzęce, komórki roślinne mają zdolność ułatwiania stymulacji i regeneracji roślin po uszkodzeniu [14]. Chociaż roślinne komórki macierzyste są uważane za nowe materiały w przemyśle kosmetycznym, dostępne materiały są ograniczone. Ważna jest identyfikacja nowych źródeł roślinnych i ocena ich składników funkcjonalnych związanych z kosmetykami.

Ekstrakty szarotki są dobrze znane ze swojego zastosowania w środkach farmaceutycznych; jednak rzadko odnotowuje się działanie ekstraktu z szarotki alpejskiej jako naturalnego źródła kosmetyków. Tutaj zbadaliśmy skuteczność ekstraktu kalusa szarotki (ekstrakt z kultury kalusa Leontopodium Alpinum; LACCE) pochodzącego z liści szarotki przy użyciu wielu testów od in vitro do in vivo i ujawniliśmy mechanizm molekularny wywołany przez LACCE przy użyciu profilowania transkryptomu.

2. Materiały i metody

2.1. Produkcja kalusa szarotki

Nasiona szarotki alpejskiej zakupiono komercyjnie. Nasiona szarotki moczy się w 70 procentach etanolu przez 30s, a następnie przemywa wodą destylowaną. Ponownie nasiona wstrząsano w 0.3% podchlorynie sodu (Waco, Osaka, Japonia) przez 20 min i przemywano wodą destylowaną. Wysterylizowane nasiona kiełkowano na podstawowym podłożu Murashige i Skoog(MS) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Holandia). Liście szarotki w stanie aseptycznym pocięto na małe kawałki (0,5 do 1 cm). Zaindukowaliśmy wczesny etap komórek roślinnych na pożywce MS zawierającej 0.5-3 mg/ml 6-Benzyloaminopuryny (6-BAP)(Duchefa Biochemie) i 0.3-1 mg/mL kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D)(Duchefa Biochemie) w ciemności przy 25±2 stopniach [15]. pH pożywki MS doprowadzono do 5,8 przy użyciu 1N NaOH (Duchefa Biochemie). Indukowany kalus rozmnażano na szalce Petriego. Wybraną linię kalusa hodowano w bioreaktorze w Anti-Aging Research Institute of BIO-FD&C Co., Ltd., Incheon, Korea. Hodowany kalus zebrano i przemyto trzy razy wodą destylowaną.cistanche Czyngis-chanKalus odwodniono przy użyciu liofilizatora (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korea) zgodnie z instrukcjami producenta. Wysuszony kalus z szarotki alpejskiej mieszano w wodzie destylowanej w temperaturze 50 stopni przez 8 godzin. Ekstrakty kalusa uzyskano przez ekstrakcję cieplną w temperaturze 98 stopni przez 10 min.

2.2. Kultura ludzkich komórek skóry

Oceniany wpływ ekstraktów szarotki na ludzkie komórki skóry, komórki keratynocytów (HaCaT) i normalne ludzkie fibroblasty Detroit 551 (ATCC, Manassas, VA, USA) były hodowane na podłożu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Welgene, Gyeongsan-si, Korea). ) uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i 1% antybiotykiem przeciwgrzybiczym (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) w 37 stopniach z 5% CO2.

2.3. Ocena aktywności metabolicznej komórek za pomocą testu MTT

Aby ocenić cytotoksyczność LACCE na wzrost komórkowy, propagację i przeżycie ludzkich komórek skóry, MTT({{0}}(45-dimetylotiazol-2-il){{3} },5-bromek difenylotetrazoliowy) przeprowadzono jak opisano wcześniej [16,17]. W skrócie, komórki HaCaT i Detroit 551 przy gęstości odpowiednio 5×10* komórek na dołek inkubowano w płytce z dołkami 96-przez 24 godziny. Następnie końcowe stężenia wynoszące 0,1% , 0,5 procent i 1 procent LACCE były leczone przez 24 godziny. Jako kontrolę zastosowano wodę destylowaną. Po potraktowaniu LACCE pożywkę usunięto, a następnie dodano 4 µLof 5 mg/ml MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA i inkubowano przez 4 godziny. Po usunięciu pożywki dodano 100 µl dimetylosulfotlenku (DMSO)(Sigma) i rozpuszczono przez 10 min.przedłużenie życia cistancheAbsorbancję długości fali mierzono przy 570 nm stosując spektrofotometr Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finlandia). Żywotność komórek uzyskano stosując następujący wzór. Żywotność komórek ( procent )=(ilość absorbancji traktowanych komórek/ilość absorbancji komórek kontrolnych)× 100.

2.4. Ocena aktywności przeciwutleniającej za pomocą testu DPPH

Aktywność przeciwutleniającą LACCE zmierzono w oznaczeniu DPH (2,2-difenylo-1-hydrazyno-pikrylohydrazyny), jak opisano wcześniej [18]. W skrócie, 0,1 ml końcowe stężenia 0,1 procent , {{10}},5 procent i 1 procent LACCE leczono w 0,1 ml 0,1 mM DPPH (Sigma-Aldrich) w obecności 0.4 ml etanolu. Jako kontrolę pozytywną użyliśmy 0,001% kwasu askorbinowego (witamina C) (Sigma-Aldrich). Próbki dobrze mieszano przez 10 sekund i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach przez 30 minut. Absorbancję długości fali mierzono przy 517 nm przy użyciu spektrofotometru Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aktywność zmiatania rodników obliczono z następującego wzoru. Aktywność oczyszczająca (%)=[1-(absorbancja próbki testowej/absorbcja kontroli)]×100.

2.5. Ocena aktywności przeciwutleniającej za pomocą testu nadtlenku wodoru (H2O2)

Nadtlenek wodoru wytwarza w komórkach wolne rodniki tlenowe, co prowadzi do śmierci komórki. Przetestowaliśmy śmiertelność komórek spowodowaną nadtlenkiem wodoru w próbkach poddanych działaniu LACCE. Komórki HaCaT przy gęstości 5x105 komórek na studzienkę inkubowano na płytce 24-studzienkowej przez 24 godziny. Następnie końcowe stężenia 0,1 procent, 0,5 procent i 1% LACCE były traktowane w obecności 1 mM H, O, przez 8 godzin. Jako kontrolę pozytywną zastosowano 0,033% NAC (Sigma-Aldrich). Do pomiaru współczynnika przeżycia komórek w próbkach traktowanych LACCE, spowodowanych przez HO2, zastosowano test MTT. Ponadto obserwowaliśmy morfologię komórek poprzez barwienie błękitem metylenowym (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2.6. Odwrotna transkrypcja w czasie rzeczywistym (RT)-PCR

Aby zbadać wpływ LACCE na działanie przeciwzmarszczkowe, nawilżające i przeciwzapalne, przeprowadziliśmy RT-PCR w czasie rzeczywistym ze znanymi starterami wzmacniającymi geny markerowe przy użyciu testów QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki Detroit 551 przy gęstości 5x104 komórek na studzienkę inkubowano w płytce 96-studzienkowej przez 24 godziny. Następnie końcowe stężenia 0,1 procent, 0,5 procent i 1 procent LACCE były leczone przez 24 godziny. cDNA zsyntetyzowano z odpowiednich komórek Detroit 551 traktowanych różnymi stężeniami LACCE przy użyciu zestawu SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Toyobo, Osaka, Japonia) zawierającego odczynniki do lizy i odczynniki RT zgodnie z instrukcjami producenta. Dla efektu przeciwzmarszczkowego po leczeniu LACCE, ekspresję genu kodującego metaloproteinazę Matrix -2(MMP-2) określono ilościowo za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zestawu Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) na podstawie instrukcji producenta. W celu oceny nawilżenia przez traktowanie LACCE, ekspresję genu kodującego Akwaporynę 3(AOP3) zbadano metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. W przypadku testu przeciwzapalnego komórki HaCaT przy gęstości 5×104 komórek na studzienkę inkubowano w płytce 96-studzienkowej przez 24 godziny. Po usunięciu pożywki, UVB napromieniowano na komórki HaCaT. Do napromieniowania UVB zastosowano 5 mJ/cm' przez CL-1000 UV box (Analytik Jena AG, Jena, Niemcy). Następnie końcowe stężenia 0,1%, 0,5% i 1% LACCE były traktowane przez 4h. Jako kontrolę pozytywną użyliśmy deksametazonu(Dex)(Sigma-Aldrich). Dla przeciwzapalnego efektu leczenia LACCE, ekspresję genów kodujących odpowiednio COX2 i iNOS oznaczono ilościowo za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresję poszczególnych genów znormalizowano do ekspresji genu GAPDH. 2.7. Ocena kliniczna LACCE jako środka do kosmetyków in Vioo

Badanie kliniczne oceniające skuteczność LACCE w liftingu twarzy i poprawie zmarszczek okołooczodołowych, elastyczności skóry, gęstości skóry i grubości skóry zostało przeprowadzone przez firmę Ellead po zatwierdzeniu w oparciu o standardowe procedury operacyjne (wer. 3.{{1} }) (Ellead, Seongnam, Korea) Ellead IRB zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrych praktyk klinicznych w Korei (B1-2015-4-002) opisanymi przez Ministerstwo Bezpieczeństwa Żywności i Leków (MFDS) oraz Standardowymi Procedurami Operacyjnymi Ellead (EL-P{ {4}}).

Aby zbadać wpływ LACCE in vivo, przeprowadziliśmy ocenę kliniczną LACCE pod kątem czterech różnych czynników: liftingu twarzy i poprawy zmarszczek okołooczodołowych, elastyczności skóry, gęstości skóry i grubości skóry. W tym celu w ocenie klinicznej trwającej cztery tygodnie wzięło udział w sumie 21 ochotniczek w wieku średnio 48,04 ± 4,28 lat, które następnie podzielono na 12 ochotniczek w wieku 40 lat i 9 ochotniczek w wieku 50 lat.

Test kliniczny przeprowadzono w trzech różnych punktach czasowych, linia bazowa, 2 tygodnie i 4 tygodnie, dla wszystkich ochotników. Od tygodnia przed rozpoczęciem badania do końca wszyscy ochotnicy nie poddawali się dodatkowym zabiegom poprawiającym stan skóry, kosmetyki i pomocy sanitarnej, co mogło wpłynąć na wyniki. Po umyciu twarzy ochotników pianką oczyszczającą, ochotnicy stanęli przez co najmniej 30 minut w kontrolowanym pomieszczeniu o stałej temperaturze (20-24 stopni) i wilgotności (40 procent -60 procent wilgotności względnej) . Pomiaru wykonywaliśmy losowo po lewej lub prawej stronie twarzy ochotników. Nasz test był testem podwójnie ślepej próby, w którym ani badani, ani badacze nie wiedzieli, który produkt jest próbką testową. Formuły do ​​obliczenia dawek obniżonych i podwyższonych opisano w tabeli 1.

2.8. Pomiar liftingu twarzy i poprawy zmarszczek okołooczodołowych

Na początku u wszystkich ochotników mierzono zmarszczki okołooczodołowe, elastyczność skóry, gęstość skóry, grubość skóry na policzku i lifting twarzy w kącikach ust. Następnie dwie różne próbki, LACCE i placebo (kontrola), nakładano na wyznaczony obszar twarzy dwa razy dziennie (rano i wieczorem). Ochotników podzielono na dwie różne grupy, grupę I (LACCE zastosowano na lewą okolicę twarzy, podczas gdy placebo na prawy obszar twarzy) i grupę II (placebo zastosowano na lewą okolicę twarzy, a LACCE na lewą twarz). prawego obszaru twarzy). Dwa i cztery tygodnie po leczeniu przeprowadzono te same pomiary w celu oceny wpływu LACCE w porównaniu z placebo.

Zmarszczki okołooczodołowe analizowano za pomocą optycznego systemu pomiaru skóry 3D(wymiar) PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, USA), który jest idealny do badania mikrostruktury skóry i zmarszczek. Dwa różne parametry chropowatości, Ra(średnia chropowatość), która jest średnią wartości bezwzględnych wysokości profilu profilu chropowatości, oraz Rg(pierwotna średnia kwadratowa chropowatości), która jest średnią kwadratową wysokości profilu profil chropowatości, zostały zmierzone.

Ten artykuł pochodzi z Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes