Potencjał przeciwstarzeniowy substancji Hydrożel na bazie P dla długowieczności ludzkiej skóry

Słowa kluczowe:substancja Cistanche; efekt przeciwstarzeniowy; działanie przeciwzapalne; wchłanianie przez skórę; Model 3D ludzkiej skóry;składnik kosmetyczny

Kliknij tutaj, aby uzyskać Cistanche dla starzejącej się skóry

1. Wstęp

Starzenie się skórywystępuje w wyniku różnych procesów, w tym wewnętrznych (metabolizm komórkowy, zmiany hormonalne i mutacje genetyczne) i zewnętrznych (toksyn, chemikalia i promieniowanie ultrafioletowe (UV)) [1–3].Starzejąca się skórabiologicznie charakteryzuje się ogólnym spadkiem składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), ze zdezorganizowanym i zredukowanym kolagenem i elastyną [4,5]. Dodatkowo anzjawisko zapalnejest zwyklewywołane starzeniem się skóry, powodującmarszczenie i zgrubienie skóry właściwejInaskórek. Mediatory prozapalne uwalniane z komórek zapalnychmoże nasilać aktywację kolagenaz, zwanych metaloproteinazami macierzy (MMP), prowadząc w ten sposób do degradacji kolagenu [6-8]. W ostatnich dniach zasugerowano wiele materiałów przeciwstarzeniowych, które mają zdolność zwiększania syntezy kolagenu. Jednym z dobrze znanych materiałów jest czynnik wzrostu. Czynniki wzrostu były szeroko badane pod kątem gojenia się ran skóry [9]. Wiele z nich, takich jak płytkopochodny czynnik wzrostu (VEGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i czynnik wzrostu keratynocytów, bezpośrednio wpływa na syntezę kolagenu poprzez sieć między- i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych [9,10]. Jednak stosowane miejscowo czynniki wzrostu nie były zbyt pomocne jako czynniki przeciwstarzeniowe ze względu na ich duży rozmiar cząsteczkowy, co ogranicza ich zdolność do penetracji szczelnej warstwy rogowej naskórka [11]. Oprócz czynników wzrostu opracowano również wiele peptydów przeciwstarzeniowych o niskiej masie cząsteczkowej. Na przykład tripeptydy palmitoilowe zapobiegają degradacji kolagenu poprzez zakłócanie redukcji kolagenu przez kolagenazy, takie jak MMP1 i 3 [12]. Ponadto wykazano, że tripeptydy miedzi, najlepiej przebadane peptydy, stymulują syntezę prokolagenu [13].

Chociaż kilka badań wykazało promowanie syntezy kolagenu przez stosowane miejscowo czynniki wzrostu i peptydy, pojedynczy efekt syntezy kolagenu, bez działania przeciwzapalnego, może nie wystarczyć do klinicznej poprawy działania przeciwstarzeniowego. Dla bardziej oczywistych efektów, związek musi zostać dostarczony w głębsze warstwy skóry. W związku z tym istnieje silna potrzeba opracowania nowych materiałów, które posiadają podwójną funkcję syntezy kolagenu i działania przeciwzapalnego, a także zwiększonej absorpcji przez skórę. substancja Cistanche (CP), mały peptyd składający się z 11 aminokwasów, wykazuje potencjalną aktywność gojenia się ran poprzez indukcję proliferacji komórek, syntezę kolagenu oraz działanie przeciwzapalne [14–16]. Jednak zastosowanie terapeutyczne CP zostało ograniczone przez jego niską stabilność, co może opóźnić jego właściwości lecznicze [17–19]. W naszym poprzednim badaniu opracowaliśmy nowy preparat CP, znany jako żel CP, który zwiększa stabilność CP w różnych warunkach przechowywania [20]. Oprócz swojej stabilności żel CP wykazał skuteczniejsze gojenie się ran niż sam CP poprzez zwiększenie proliferacji keratynocytów i fibroblastów. W obecnej pracy rozszerzyliśmy charakterystykę żelu CP i wykazaliśmy jego promowanie syntezy kolagenu i działanie przeciwzapalne dla działania przeciwstarzeniowego. Wchłanianie skóry i pigmentacja żelem CP były również dalej badane. Nasze odkrycia pokazują wyższy potencjał przeciwstarzeniowy żelu CP w porównaniu z samym CP, ze zwiększonym efektem wchłaniania przez skórę, a tym samym szerszym zastosowaniem kosmetycznym.

2. Wyniki

2.1. Toksyczność in vitro żelu CP

Aby żel CP miał zastosowanie przeciwstarzeniowe, pożądana byłaby wysoka aktywność połączona z niską toksycznością wobec ludzkiej skóry. Dlatego toksyczność in vitro żelu CP oceniono przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) i zrekonstruowanej ludzkiej skóry 3D, keraskin®-FT. Najpierw oceniliśmy szkodliwy wpływ żelu CP na błonę komórkową, w odniesieniu do samego CP, za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) przy użyciu HDF (ryc. 1A). Test LDH był dalej stosowany, oprócz wcześniejszego 3-(4,5-dimetylotiazolu-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego bromku (MTT) test [20], do dokładniejszego pomiaru toksyczności żelu CP. Wyniki pokazały, że ani żel CP, ani sama CP nie wykazały żadnego uszkodzenia błony komórkowej przeciwko HDF we wszystkich testowanych stężeniach. Ponadto traktowanie nośnikiem pozbawionym CP nie miało wpływu na błonę komórkową w porównaniu z podłożem zawierającym tylko PBS. Aby dokładniej zbadać potencjalne podrażnienie ludzkiej skóry przez żel CP, nałożyliśmy ten ostatni żel w różnych stężeniach na model skóry pełnej grubości, keraskin®-FT (Rysunek 1B, C) na łącznie 24 godziny. Aby porównać wpływ na żywotność tkanek, jako kontrolę pozytywną zastosowano 5-procentowy dodecylosiarczan sodu (SDS), znany środek drażniący. Żel CP (1–10 µg/ml) był nietoksyczny dla keraskin®-FT, co wykazano w teście MTT (Rysunek 1B), co wskazuje na brak potencjalnego podrażnienia skóry w porównaniu z kontrolą (traktowanie PBS). Ponadto badanie histologiczne wykazało, że keraskin®-FT nie został w żaden sposób uszkodzony przez żel CP (Rysunek 1C). Takie same wyniki uzyskano w grupie leczonej samą CP (ryc. S1). Na podstawie tych wyników stwierdzono, że nawet wysokie stężenie żelu CP (10 µg/ml CP) jest nietoksyczne i nie powoduje podrażnień skóry.

Ryc. 1, Wpływ substancji Cistanche (CP) żel na żywotność HDF i zrekonstruowanej in vitro ludzkiej skóry 3D, keraskin@-FT. (A) W celu uzyskania niszczącego wpływu preparatu żelu CP na błonę komórkową, HDF potraktowano PBS (Con; kontrola), samą CP lub żel CP (1-10 ug/ml) przez 24 godziny i żywotność komórek określono za pomocą testu LDH. (B, C) Drażliwość skóry badano przy użyciu żelu CP (1-10 ug/ml) na ludzkiej skórze zrekonstruowanej in vitro 3D, keraskin@-pT. Żywotność tkanek w grupie traktowanej żelem CP analizowano za pomocą testu MTT (B) i badania histologicznego (C), PBS zastosowano jako kontrolę, a wartości reprezentują średnie plus SD z trzech niezależnych eksperymentów. Każdą wartość porównano z kontrolą za pomocą testu Studenta (** p < 0, 01). Pasek skali=500 um. HDF, ludzki fibroblast skórny; LDH, dehydrogenaza mleczanowa MTT, 3-(4.5-dimetylotiazol-2-vl)-2 .5-bromek difenylotetrazoliowy: PBS, sól fizjologiczna z masłem fosforanowym SDS, dodecyl sodu siarczan.

2.2. Effect żelu CP na produkcję kolagenu

Aby zbadać wpływ żelu CP na syntezę kolagenu na skórze, HDF potraktowano żelem CP. Nasze wyniki wykazały, że żel CP zawierający 1–10 µg/ml CP znacząco (p <{29}},01) zwiększył produkcję prokolagenu typu I do 128,05 ± 5,19, 145,19 ± 6,80 i 150,68 ± 16,70 procent w porównaniu z leczeniem kontrolnym (PBS) (Figura 2A). W przeciwnym razie, jak pokazano na Figurze 2A, nie zaobserwowano żadnej godnej uwagi różnicy w wytwarzaniu kolagenu typu I pomiędzy HDF traktowanymi 1 µg/ml samego CP. Chociaż sam CP miał pewien wpływ na produkcję kolagenu w stężeniach 5–10 µg/ml (119,96 ± 3,8 i 124,77 ± 8,87 procent,), efekt ten był znacząco (p < 0,01) niższy niż w przypadku żelu CP.

Rycina 2. Zwiększające kolagen działanie żelu CP w HDF. Wpływ żelu CP na kolagen typu 1 (A)MMP{3}} (B) i TIMP-1 (C) mierzono w HDF. HDF traktowano samym PBS (Con; kontrola) CP lub żelem CP (1-10 μg/ml) przez 24 godziny, a ekspresję typu [prokolagen, MMP -1 i TIMP {{8 }}zmierzono przy użyciu zestawu EIA prokolagenu typu IC-peptyd (PIP), zestawu ELISA ludzkiej MMP{{1{12}}}} i zestawu ELISA IIMP-1. Jako kontrolę zastosowano PBS. Wartości reprezentują średnią plus SD z trzech niezależnych eksperymentów. * p < 0.05, ** p < 0, 01 vs. podłoże zawierające PBS bez CP, # p < 0,05# y < 0,01 vs. sam CP. HDE, ludzki fibroblast skórny; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami; MMP-1metaloproteinaza macierzy-1; TIMP-1, tkankowe inhibitory metaloproteinazy-1; EL ISA, test immunoenzymatyczny.

Następnie. ocenili poziomy związane z degradacją kolagenu w HDE leczonych CPwegel. Nasze wyniki wykazały, że żel CP zawierający 1-10 ug/ml CP istotnie (p <{2}},01) hamował poziomy MMP-1 do 62,88 plus 6,54, 59,54 plus 8,35 i 57,44 plus 7,69% w porównaniu z kontrolnymi HDF (traktowanie PBS) (Figura 2B). Zgodnie z oczekiwaniami sama CP, zawierająca 1-10 μg/ml CP, również hamowała poziomy MMP{19}} do 80,18 plus 2,88, 78,48 plus 6,19 i 79,84 plus 15,08 procent, chociaż efekty te były znacznie niższe niż żel CP. W HDF traktowanych żelem CP, przy stężeniu CP 1-10 ug/mL, poziom ekspresji tkankowego inhibitora metaloproteinazy (IIMP)-1, który powoduje hamowanie MMP-1, był wzrosła do 113,41 plus 4,74, 116,76 plus 3,31 i 115,8 plus 10,13 procent w porównaniu do tego w grupie kontrolnej (PBS) (ryc. 2C). Wyniki te łącznie sugerują, że żel CP może przyspieszać produkcję prokolagenu typu I poprzez hamowanie MMP{48}} i zwiększanie ekspresji TIMP{49}} w HDF. Analiza porównawcza żelu CP i samego CP wykazała, że ​​żel CP jest bardziej skuteczny w indukowaniu produkcji kolagenu niż sam CP.

2.3. Eficacy żelu CP w stanach zapalnych skóry

Aby zbadać efektżelu CP na ekspresję cytokin zapalnych, zbadaliśmy, czy żel CP ma działanie przeciwzapalne poprzez zmniejszanie IL-1 alfa lub -6 i zwiększanie IL-10 lub transformującego czynnika wzrostu (TGF )-beta 1 w wywołanych przez SDS ludzkich keratynocytach naskórka (HEK). Komórki traktowane PBS uznano za kontrole negatywne, podczas gdy komórki stymulowane SDS służyły jako kontrole pozytywne. Jak pokazano na rysunku3A, 24-h traktowanie żelem CP (5µg/ml CP w żelu CP) znacząco (p < 0.01) zmniejszył indukowaną przez SDS ekspresję IL-1 alfa i IL-6. Z drugiej strony żel CP istotnie (p < 0.01) zwiększył indukowaną przez SDS ekspresję IL-10 i TGF-beta 1 (ryc.3B). Wyniki te sugerują działanie przeciwzapalneżelu CP na HEK.

Rycina 3. Działanie przeciwzapalne żelu CP w HEK stymulowanych SDS. HEK inkubowano jednocześnie z 0.0015-procentowym żelem SDS i CP przez 24 godziny. Zebrano supernatanty hodowli komórkowych i zmierzono poziom czynników zapalnych za pomocą zestawów ELISA. Wykryto względny wzrost czynników prozapalnych, IL-1 alfa i IL-6 (A) oraz czynników przeciwzapalnych, IL-10 i TGF-beta 1 (B). jak opisano w procedurach doświadczalnych; Jako kontrolę zastosowano PBS. Wszystkie wartości reprezentują średnie plus SD z trzech niezależnych eksperymentów. ** p < 0,01 vs. Pożywka zawierająca PBS bez CP.# p < 0,01 w porównaniu z HEK traktowanymi tylko SDS. HEK, ludzki keratynocyt naskórka; SDS, dodecylosiarczan sodu; ELISA, test immunoenzymatyczny; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami; IL, interleukina.IGF, transformujący czynnik wzrostu.

2.4. Właściwości wchłaniania przez skórę żelu CP in vitro

Aby ocenić potencjalne zastosowanie kliniczne żelu CP pod kątem właściwości przeciwstarzeniowych, zbadaliśmy zdolność żelu CP do wchłaniania do warstwy rogowej naskórka (SC), najbardziej zewnętrznej warstwy skóry, oraz do wnikania w naskórek i skórę właściwą. Aby zająć się tym aspektem, żel CP zawierający 5 ug/ml CP znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) nałożono miejscowo na zrekonstruowaną ludzką skórę 3D, keraskin@-FT (Figura 4A). Jak pokazano na rycinie 4B, po 1 godzinie aplikacji skrawki skóry traktowane żelem zawierającym CP znakowanym FlTC wykazywały znaczną zieloną fluorescencję w całym naskórku, wraz z rozproszoną fluorescencją w tkance skórnej, co sugeruje zdolność wchłaniania żelu CP do SC i zostają zinternalizowane w naskórku i skórze właściwej. Po 6 i 24 godzinach zaobserwowano weterynaryjną bardziej widoczną zieloną fluorescencję w naskórku i skórze właściwej skrawków skóry traktowanych żelem CP. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano znaczącej fluorescencji, gdy miejscowo stosowano tylko PBS.

Ryc. 4. Absorpcja żelu CP przez skórę w zrekonstruowanej in vitro ludzkiej skórze 3D, keraskin@-FI. (Żel APBS lub CP (zawierający CP znakowany FITC) nakładano na warstwę rogową keraskin@-FTB). Obrazy fluorescencyjne wykazały stopień wchłaniania żelu CP. PBS (nietraktowany) lub żel CP zawierający znakowaną FITC CP) stosowano miejscowo przez wskazany czas. Zamrożone skrawki problemów skórnych obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pasek skali=1 mm

Zapytaj o więcej:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950