Przeciwutleniające i antymelanogenne działanie ekstraktu z lukrecji poddanej obróbce cieplnej (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2* i Hyung Don Kim 1,*

Abstrakcyjny:Melanina to brązowy lub czarny pigment, który chroni skórę przed promieniowaniem ultrafioletowym i reaktywnymi formami tlenu (ROS). Jednak nadprodukcja melaniny wiąże się z plamami soczewicowatymi, melasma, piegami i rakiem skóry.Lukrecjapokazałprzeciwutleniacz, działa przeciwnowotworowo, przeciwpłytkowo, przeciwzapalnie, immunomodulująco i jest stosowany jako naturalna kuracja dla skórybielenie.Naszym celem było potwierdzenie potencjału Wongam, nowej odmiany lukrecji opracowanej przez RuralDevelopment Administration (RDA), jakobielenieśrodek w kosmetykach. Ponadto zweryfikowaliśmy wpływ obróbki cieplnej na bioaktywność lukrecji porównującprzeciwutleniaczorazantymelanogennyaktywność ekstraktu z lukrecji przed i po podgrzaniu (130◦C). Ekstrakt z lukrecji poddany obróbce cieplnej (WH-130) wykazał wyższą aktywność wychwytywania rodników w ABTS plus (2,20-azyno-bis-(3-etylobenzotiazolina-6-sulfonian kwas) sól diamonowa) i DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl). Ponadto WH-130 skuteczniej hamował melanogenezę ze względu na obniżenie poziomu tyrozynazy w komórkach czerniaka B16F10 niż nieogrzewanelukrecjawyciąg. Ponadto obróbka cieplna zwiększyła całkowitą zawartość fenoli. W szczególności izolikwirytygenina, anprzeciwutleniaczorazantymelanogennyzwiązek lukrecji, został wyprodukowany przez obróbkę cieplną. Podsumowując, WH-130, ze zwiększonymi poziomami bioaktywnych związków fenolowych, takich jak izolikwirytygenina, może rozwinąć się w nową skórębieleniemateriał do zastosowań w kosmetyce.

Słowa kluczowe: antymelanogennydziałalność; obróbka cieplna;lukrecja; mysie komórki czerniaka (B16F10)

Cistanche to przeciwutleniacz

1. Wstęp

Lukrecja(Glycyrrhiza gatunek), wieloletnie zioło o leczniczych zastosowaniach z rodziny Leguminosae, jest szeroko rozpowszechnione w Azji Środkowej, Chinach, Rosji, Mandżurii, Mongolii i Europie [1]. Od dawna jest używany jako środek aromatyzujący i słodzący. Suszone korzenie i rozłogi lukrecji były stosowane w leczeniu przeziębienia, kaszlu, astmy, zmęczenia i infekcji dróg oddechowych, ze względu na biologiczne działanie lukrecji, w tymprzeciwutleniacz, przeciwdrobnoustrojowe, przeciwnowotworowe, przeciwpłytkowe, przeciwzapalne i immunomodulujące [2,3]. Rodzaj Glycyrrhiza składa się z około 22 gatunków lukrecji, w tym G. uralensisFisch, G. glabra L. i G. inflata Batal.

Wongam, nowa międzygatunkowa hybrydowa odmiana lukrecji, została opracowana przez Administrację Rozwoju Obszarów Wiejskich jako hybryda Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam ma wyższe plony i lepszą odporność na choroby niż G. uralensis. Przeprowadzono liczne badania nad biologiczną aktywnością G. uralensis, natomiast dotychczasowe badania nad nową odmianą Wongam ograniczają się do jej działania przeciwalergicznego, immunomodulującego i przeciwwrzodowego [1,2]. Dlatego konieczne jest zbadanie szerokiej bioaktywności Wongam.

Główne składniki bioaktywne wlukrecjakorzeniem są flawonoidy i saponiny triterpenowe, w tym liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) i glicyryzyna (lub kwas glicyryzykowy) [4,5]. ISL to flawonoid znajdujący się w lukrecji, który wykazuje różne właściwości farmaceutyczne, w tym przeciwpłytkowe, przeciwalergiczne, przeciwnowotworowe, przeciwzapalne iprzeciwutleniaczdziałalność [6–8]. ISL to produkt hydrolizy z izolikwirytyny w korzeniu lukrecji. Może hamować melanogenezę poprzez degradację czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (MITF) poprzez aktywację szlaku sygnałowego kinazy białkowej regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK). W konsekwencji degradacja MITF tłumiła ekspresję genów tyrozynazy (TYR) i białek związanych z tyrozynazą (TRP-1 i TRP-2) w komórkach SK-MEL-2 [9,10].ISL może hamować aktywność mono- i difenolazy grzybowego TYR, a także melanogenezę w melanocytach [11].

Melanina, główny pigment nadający kolor skóry, jest syntetyzowana w melanocytach naskórka i przechowywana w organellach wewnątrzkomórkowych zwanych melanosomami [12]. Pigmenty melaninowe składają się z dwóch typów: brązowej lub czarnej eumelaniny oraz czerwonej lub żółtej feomelaniny [12]. Melanogeneza może być indukowana przez bodźce zewnętrzne, w tym promieniowanie ultrafioletowe (UV), reaktywne gatunki tlenu (ROS) i substancje chemiczne, takie jak hormon stymulujący melanocyty (-MSH) i izobutylometyloksantyna (IBMX), która podnosi poziom cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP). Melanina chroni skórę przed tymi bodźcami, a jej nadprodukcja powoduje hiperpigmentację skóry, co może prowadzić do chorób takich jak rak skóry [13–17]. Skórabielenieśrodki, takie jak kwas kojowy, hydrochinon, arbutyna i kwas askorbinowy, które są inhibitorami TYR, zostały wykorzystane w leczeniu przebarwień w kilku produktach kosmetycznych [13,18]. Melanogeneza jest regulowana przez różne szlaki sygnałowe, a sygnały te są powiązane z regulacją w górę MITF. Aktywacja MITF promuje ekspresję TYR i TRP (TRP-1, TRP-2). Następnie TYR katalizuje utlenianie L-tyrozyny do 3,4-dihydroksy-L-fenyloalaniny (L-DOPA), która jest następnie utleniana do DOPAchinonu. TRP-2 przekształca dopachrom w 5,6-dihydroksyindol-2-kwas karboksylowy (DHICA) lub 5,6-dihydroksyindol (DHI). Ostatecznie DHICA i DHI są utleniane przez TRP-1, co prowadzi do melanogenezy [19].

Procesy termiczne wpływają na właściwości fizykochemiczne i biologiczne ekstraktów roślinnych. Niszczą ściany komórkowe i rozszczepiają wiązania kowalencyjne, w wyniku czego uwalniają się związki bioaktywne [20,21]. Obróbka cieplna ekstraktów młóta browarnianego powyżej 130 Zwiększa całkowitą zawartość fenoli (TPC) i całkowitą zawartość flawonoidów (TFC), z odpowiednim wzrostem aktywności przeciwutleniającej [16,20,21]. Ogrzewanie skórek cytrusowych może prowadzić do uwalniania związków fenolowych i zwiększonegoprzeciwutleniaczdziałalność [17].

Naszym głównym celem jest potwierdzenie potencjału Wongam jako skóry naturalnejbieleniemateriał w kosmetyce. Ponadto badanie to ma również na celu udowodnienie, czy obróbka cieplna może poprawić działanie przeciwutleniające i przeciwmelanogennelukrecja. Zbadaliśmyprzeciwutleniaczdziałania, wraz z TPC ekstraktów Wongam.AntymelanogennyEfekty ekstraktów Wongam zostały zweryfikowane przez aktywność hamowania TYR i zawartość melaniny w komórkach czerniaka.

Cistanche jest naturalnymskórabielenie ziele

2. Materiały i metody

2.1. Przygotowanie próbki

Próbki przygotowano zgodnie z wcześniej opisaną metodą [22].Lukrecja(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, zidentyfikowany przez Yun Ji Lee z NIHHS, RDA i zarejestrowany w Korea Medicinal Resources Herbarium z numerem kuponu MPS006326) był uprawiany i zbierany w Departamencie Badań Roślin Ziołowych (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Korea ) w 2018 r. i suszono w 60◦C przez 20 godz. 10 kglukrecjazebrano i zmielono 1 kg. Po ich wymieszaniu otrzymano odpowiednio 3 próbki WC lub WH. Zmielona lukrecja (5 g) została umieszczona w szklanym pojemniku z 1 ml wody destylowanej i traktowana w autoklawie (Jisico, Seoul, Korea) przez 1 godzinę w 130◦C (WH-130). Nietraktowana lukrecja kontrolna (WC , 5 g) i WH-130 oddzielnie ekstrahowano przy użyciu 70% etanolu (próbka:rozpuszczalnik, 1:50, obj.:obj.) przez 24 hw temperaturze pokojowej (RT). Po filtracji ekstrakty odparowano pod próżnią, liofilizowano i przechowywano w -80◦C. Wszystkie ekstrakty rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) i metanolu (Sigma, St. Louis, MO, USA).

2.2. Oznaczanie Browninga

Wskaźnik brązowienialukrecjaekstrakty (WC i WH-130) rejestrowano na podstawie ich wartości absorbancji przy 420 nm (A420) mierzonej za pomocą czytnika mikropłytek (BioTek,Winooski, VT, USA). Wyższe wartości absorbancji przy 420 nm odpowiadają wyższemu indeksowi brązowienia [23,24].

2.3. Całkowita zawartość fenoli (TPC)

Zgodnie z wcześniej opisaną metodą [25], TPC mierzono w oparciu o zasadę, że odczynnik Folina–Ciocalteu redukuje się do niebieskiego chromoforu złożonego z kompleksu afosfowolframowo-fosfomolibdenowego w zależności od warunków alkalicznych i stężenia związków fenolowych. Każdą próbkę (10 µl) zmieszano z 2 procentowym węglanem sodu (200 µl), a następnie odczynnikiem Folina-Ciocalteu (10 µl). Mieszaninę aktywowano przez 30 min w RT. Następnie zmierzono absorbancję przy 750 nm za pomocą czytnika mikropłytek (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC obliczono z krzywej standardowej kwasu galusowego, a wyniki wyrażono jako wartości równoważnika kwasu galusowego, mg ekstraktu GAE g-1.

2.4. Oznaczanie zdolności przeciwutleniającej

Aktywność zmiatania rodników mierzono przy użyciu soli diamonowej 2,20-azyno-bis-(3-etylobenzotiazolino6-sulfonowego) (ABTS) zgodnie z wcześniej opisaną metodą z niewielką modyfikacją [19, 26]. Roztwór kationu rodnikowego ABTS wytworzono przez zmieszanie 2,6 mM nadsiarczanu potasu i 7,4 mM ABTS i pozostawienie ich do reakcji przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór ABTS następnie rozcieńczono wodą destylowaną w celu dostosowania absorbancji do zakresu 1.000–1.500. Następnie 20 µl próbki poddano reakcji ze 180 µl roztworu ABTS plus, chronionego przed światłem i mieszaninę próbki i roztworu inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Absorbancję mierzono przy użyciu czytnika mikropłytek (BioTek, Winooski, VT, USA) przy 735 nm. Z krzywej standardowej Trolox, odpowiednik Troloxprzeciwutleniaczpojemność (TEAC) obliczono i wyrażono w mg ekwiwalentu troloxu (TE) na g suchej próbki.

Roztwór rodnika 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH) wytworzono przez rozpuszczenie 0,2 mM DPPH w 99% etanolu. Roztwór DPPH rozcieńczono wodą destylowaną do anabsorbancji przy 520 nm 1000-1500. Następnie 50 µl próbki zmieszano z 200 µl roztworu DPPH i poddano reakcji przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po reakcji określono absorbancję mieszaniny przy 520 nm. Z krzywej standardowej Trolox obliczono TEAC i wyrażono w mg TE na g suchej próbki.

2.5. Analiza wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

Zastosowano zmodyfikowaną metodę HPLC [22]. Zawartość ISLlukrecjaekstrakty analizowano metodą HPLC z detektorem UV-visible (HPLC: seria 1200, Agilent Technologies,Santa Clara, CA, USA; kolumna: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Faza ruchoma składała się z rozpuszczalnika A (0,1% kwasu mrówkowego w wodzie) i rozpuszczalnika B (0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu). Program gradientowy dla fazy ruchomej działał w następującym gradiencie: 0–8 min (20–20 proc. B), 8–30 min (20–38 proc. B), 30–42 min (38–50 proc. B), 42–47 min (50–90% B), 47–53 min (90–90% B), 53–54 min (90–20% B) i 54–60 min (20–20% B) . Szybkość przepływu, długość fali detekcji i objętość wstrzykiwania ustawiono odpowiednio na 1,0 ml/min, 360 nm i 10 µl. Roztwory standardowe ISL analizowano w czterech różnych stężeniach (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/ml). Krzywa kalibracji (y=ax plus b) została wykorzystana do określenia zawartości ISL. W równaniu regresji x odnosi się do stężenia ISL (mg mL−1), a y oznacza powierzchnię piku.

2.6. Test aktywności hamującej tyrozynazę grzybową

Test aktywności hamującej TYR przeprowadzono przy użyciu zestawu przesiewowego inhibitora TYR (BioVision, Milpitas, CA, USA). Każdy ekstrakt (WC i WH-130) rozpuszczono w DMSO do końcowego stężenia 250 µg/ml. Kwas kojowy, stosowany jako kontrola pozytywna, również rozcieńczono do 250 µg/ml w DMSO. W skrócie, 20 µl ekstraktu lub kwasu kojowego połączono z 50 µl roztworu enzymu TYR. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 min, do każdego dołka dodano 30 µl roztworu substratu TYR. Stężenie końcowe ekstraktów i kwasu kojowego wynosiło 50 µg/ml. Gęstość optyczną studzienek mierzono następnie przy 510 nm w trybie kinetycznym przez 1 h czytnikiem mikropłytek (BioTek, Winooski, VT, USA).

proszek cistanche: przeciwutleniający

2.7. Hodowlę komórkową

Komórki mysiego czerniaka B16F10 uzyskano z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Komórki B16F10 hodowano w pożywce Dulbecco Modified Eagle's (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny (Gibco, Grand Island, NY, USA) w wilgotnej atmosferze zawierającej 5 procent CO2 w 37 C.

2.8. Test żywotności komórek

Cytotoksycznośćlukrecjaekstrakty (WC i WH-130) do komórek B16F10 określono za pomocą MTT [3-(4,5-dimetylotiazol-2-il)-2,{{8 }}bromek difenylotetrazoliowy]. Następnie do komórek dodawano ekstrakty w stężeniach 50, 100 i 200 µg/ml i inkubowano w 37°C przez 48 godzin. Następnie do każdego dołka dodano roztwór MTT (500 µg/ml) i płytkę inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Pożywkę w każdej studzience odrzucono i dodano 100 µl DMSO. Po wytrząsaniu przez 30 min zmierzono absorbancję przy 540 nm czytnikiem mikropłytek. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach.

2.9. Pomiar zawartości melaniny w komórkach

Zawartość melaniny wewnątrzkomórkowej mierzono za pomocą nieco zmodyfikowanej wersji metody opisanej wcześniej [27]. Komórki czerniaka B16F10 wysiano na 6-studzienkowych płytkach przy gęstości 8 x 104 komórek/studzienkę i inkubowano przez 24 godziny. Komórki eksponowano na ekstrakty (WC i WH-130, 100 µg/mL), kwas kojowy (100 µg/mL) lub ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Stany Zjednoczone) przez 48 godzin w obecność 100 µM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX). Po potraktowaniu komórki przemyto solanką Dulbecco buforowaną fosforanem (DPBS) i rozpuszczono w 200 µl 1 N NaOH przez 2 hw 90°C. Absorbancję przy 405 nm mierzono za pomocą czytnika mikropłytek.

2.10. Test aktywności tyrozynazy komórkowej

Wewnątrzkomórkową aktywność TYR mierzono za pomocą nieco zmodyfikowanej wersji wcześniej opisanej metody [27]. Komórki czerniaka B16F10 (8 x 104 komórek/studzienkę) traktowano ekstraktami (100 µg/ml) lub kwasem kojowym (100 µg/ml) w obecności 100 µM IBMX przez 48 godzin, zbierano i przemywano DPBS. Próbki białka poddano lizie w 1% TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) z buforem fosforanu sodu (pH 6,8), a następnie odwirowano przy 15 000 obr./min przez 10 min. Zebrano frakcję supernatantu i oznaczono stężenie białka przy użyciu zestawu do oznaczania kwasu bicynchoninowego (BCA) (Waltham, MA, USA). Mieszaninę reakcyjną składającą się z 30 ?g białka (dostosowanego do 100 ?l za pomocą 1% Trionu X-100) i 100 ?l 10 mM L-DOPA dodano do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Po inkubacji w 37°C przez 1 h, dopachrom monitorowano mierząc absorbancję przy 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Aktywność TYR obliczono według następującego wzoru:

Aktywność tyrozynazy ( procent )=(OD405 próbki/OD405 kontroli) × 100

2.11. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

Poziomy ekspresji mRNA genów związanych z melanogenezą, w tym MITF, TYR,TRP-1 i TRP-2, określono za pomocą zmodyfikowanego testu RT-PCR [28]. W skrócie, komórki B16F10 wysiano na płytkach 6-dołkowych z gęstością 8 x 104 komórek na dołek i hodowano przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano ekstraktami (100 µg/ml), kwasem kojowym (100 µg/ml) lub ISL (10 µM) przez 48 godzin. Całkowity RNA wyizolowano z komórek przy użyciu odczynnika TRIzol (Ambion, Austin, TX, USA), a następnie oznaczono ilościowo stężenie RNA przy użyciu czytnika mikropłytek. Po przygotowaniu cDNA (2 µg) przy użyciu zestawu Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) zgodnie z protokołami producenta, przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 i startery aktynowe (Tabela 1, Bioneer, Daejeon, Korea) z zestawem SYBR Green (ProGEN, Heidelberg, Niemcy) w aparacie CFX96 Real Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Wszystkie dane znormalizowano do poziomów p-aktyny mRNA jako referencyjnego genu porządkowego.

2.12. Przygotowanie lizatów komórkowych i analiza Western Blot

Komórki B16F10 wysiano w 6-dołkowych płytkach z gęstością 8 × 104 komórek na dołek, inkubowano przez 24 h, a następnie wystawiono na ekstrakty (100 µg/ml), kwas kojowy (100 µg/ml) ) lub ISL (10 uM) przez 48 godz. Po przemyciu DPBS, komórki zebrano i poddano lizie w buforze Triton X-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) zawierającym 1% proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy. Stężenia białka w lizatach całych komórek mierzono przy użyciu zestawu testowego aBCA (Waltham, MA, USA). Równe ilości białka (20 µg) naniesiono na 10% żele dodecylosiarczan sodu-poliakrylamid, które puszczano przez 4 godziny przy 70 V. Następnie białka przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF). Membranę przemyto trzykrotnie roztworem soli buforowanym Tris [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] zawierającym 0,1% Tween 20 (TBST) i blokowano 2% albuminą surowicy bydlęcej (GenDEPOT) przez 1 godzinę. Następnie błony inkubowano przez noc w 4◦C z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczenie 1:1000) przez 4 hw temperaturze pokojowej. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 i -aktynę wykrywano króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-MITF (Abcam, Cambridge, UK); kozie przeciwciało poliklonalne anty-TYR (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); oraz mysie przeciwciała monoklonalne przeciw TRP-1, przeciw TRP-2 i przeciw - -aktynie (Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Następnie błony płukano kilka razy TBST i inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczenie 1:2000) przez 1 godzinę, mianowicie króliczą anty-mysią IgG, mysią anty-kozią IgG i kozim anty-mysią IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), a następnie kilkakrotnie przemywano TBST. Białka docelowe wykrywano przy użyciu odczynnika wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) z systemem obrazowania ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kwantyfikację prążków białka przeprowadzono za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.52a dla Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].

2.13. Analiza statystyczna Dane analizowano przy użyciu programu Microsoft Excel 2016, a wszystkie wyniki eksperymentalne przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z trzech niezależnych pomiarów. Do oceny różnic między kontrolą a próbami zastosowano test t-Studenta dla dwóch prób. Jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) i test Duncana przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Rsoftware (wersja 3.6.3) w celu określenia istotności każdego porównania w poziomy p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" i="" p="">< 0,001="" (***).="" analizę="" korelacji="" przeprowadzono="" przy="" użyciu="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

3. Wyniki

3.1. Indeks brązowienia ekstraktów lukrecji

Stopień zrumienienialukrecjaekstrakty pokazano na rysunku 1a. Wyniki te potwierdziły, że ekstrakt poddany obróbce cieplnej (WH-130, 0,965 ± 0.025 AU [jednostki absorbancji]) ma znacznie wyższe wartości wskaźnika brązowienia niż nieogrzewany ekstrakt (WC, 0,758 ± 0,005 AU). Spodziewamy się, że obróbka termiczna zwiększa tworzenie melanoidyny w WH-130 i że zmiana ta może być powiązana z różnymi aktywnościami biologicznymi.

3.2. Całkowita zawartość fenoli (TPC) w ekstraktach z lukrecji

Rysunek 1b przedstawia TPClukrecjaekstrakty. Znaleźliśmy różnicę w TPC między WC a WH{{0}}, ponieważ WC miał TPC 12,093 ± 0,061 mg GAE/g ekstraktu, podczas gdy WH-130 miał TPC 14,098 ± 0,781 mg GAE/g ekstraktu. Obróbka cieplna zwiększyła TPC ekstraktów z lukrecji.

3.3. Aktywność wychwytywania rodników ekstraktów z lukrecji

Theprzeciwutleniaczdziałalnośćlukrecjaekstrakty przedstawiono na rysunku 1c,d. ABTS plus zdolność wymiatania rodników była wyższa dla ekstraktu WH-130 (6,086 ± 0,304 mg TEAC/ekstrakt) niż ekstraktu WC (3,542 ± 00,093 mg TEAC/g ekstraktu). W teście DPPH zaobserwowano podobną tendencję. Ekstrakt WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g ekstraktu) wykazywał większą aktywność zmiatania rodników DPPH niż ekstrakt WC (4,033 ± 0,160 mg TEAC/g ekstraktu). Wyniki te wskazują, że ogrzewanie może zwiększyć aktywność przeciwutleniającą ekstraktów.

3.4. Zawartość izolikwirytygeniny w ekstraktach z lukrecji

Wyniki wykazały, że zawartość ISL w WC znacznie wzrosła po obróbce cieplnej (Tabela 2, Rysunek 2), co wskazuje, że obróbka termiczna może wpływać na zawartość tegoprzeciwutleniaczorazantymelanogennymieszanina.

Cistanche tubolosa

3.5. Żywotność komórek

Jak pokazano na rysunku 3,lukrecjaEkstrakty nie wpływały na żywotność komórek przy 50 lub 100 µg/ml w porównaniu z kontrolą traktowaną IBMX. W przypadku traktowania wszystkich ekstraktów 50 i 100 µg/ml żywotność komórek pozostawała wyższa niż 100%. W związku z tym przeprowadzono dalsze eksperymenty przy stężeniach ekstraktu z lukrecji do 100 µg/ml.

3.6. Wpływ ekstraktów z lukrecji na produkcję melaniny w komórkach czerniaka B16F10

Pigmentację i zawartość melaniny w komórkach B16F10 pokazano na Figurze 4a,b. Zawartość melaniny w komórkach B16F10 wzrosła do 3,4-razy po traktowaniu IBMX w stosunku do nietraktowanej kontroli. WC i WH-130 wykazały znacznie zmniejszoną pigmentację i zawartość melaniny w porównaniu z grupą leczoną IBMX (Figura 4a,b). Zarówno WC, jak i WH{{10}} wykazywały niższą zawartość melaniny niż komórki traktowane KA. Hamujący wpływ syntezy melaniny w komórkach B16F10 traktowanych WH-130 był większy niż WC. Ilości melaniny obecne po traktowaniu 100 µg/ml WC i WH-130 zostały zmniejszone odpowiednio do około 0.59-krotnie i 0.51-krotnie w stosunku do poziomu w traktowanych IBMX group.ISL (10 µM) i KA (100 µg/ml) tłumiły wytwarzanie melaniny 0.59-krotnie i 0.67-krotnie, odpowiednio do poziomu w komórkach traktowanych IBMX.

Ten wynik pokazuje, że poddane obróbce cieplnejlukrecjaekstrakt (WH-130) może skuteczniej hamować produkcję melaniny niż ekstrakt niepodgrzewany (WC). Ponadto zaobserwowaliśmy, że traktowanie ekstraktem WH-130 przy 25, 50 i 100 µg/ml (Figura 4c) spowodowało zależny od stężenia spadek zawartości melaniny w komórkach czerniaka B16F10. Wszystkie te wyniki pokazują, że ogrzewanie poprawiłoantymelanogennyaktywność ekstraktu z lukrecji.

3.7. Wpływ ekstraktów z lukrecji na aktywność tyrozynazy

3.7.1. Aktywność tyrozynazy grzybowej

EfektlukrecjaEkstrakty na aktywność TYR grzybów pokazano na rycinie 5a. Potwierdziliśmy, że wpływ ekstraktów (WC i WH-130) na utlenianie substratów przez grzybowy TYR wystąpił w warunkach bezkomórkowych. Przy 50 µg/ml ekstrakt WC hamował aktywność enzymu do 81,33 procent, podczas gdy WH-130 tłumił aktywność TYR do 65,95 procent poziomu EC. Tymczasem kwas kojowy (KA), inhibitor TYR, spowodował zahamowanie aktywności enzymu do 47,09 procent poziomu EC. Hamowanie aktywności TYR było większe w lukrecji poddanej obróbce cieplnej (WH-130) niż w lukrecji niepodgrzewanej (WC).

3.7.2. Aktywność tyrozynazy komórkowej

Jak pokazano na Figurze 5b, aktywność TYR komórek traktowanych IBMX wzrosła do 233 procent w stosunku do nietraktowanej kontroli (100 procent). WC zmniejszył aktywność TYR do 82,17 procent w porównaniu z grupą leczoną IBMX. Ekstrakt WH-130 hamował aktywność komórkowego TYR do 59,88 procent w porównaniu z komórkami traktowanymi IBMX. KA zmniejszyła aktywność komórek TYR do 74,07 procent poziomu w komórkach traktowanych IBMX. Łącznie wyniki te pokazują, że ekstrakty z lukrecji (WC i WH-130) hamują aktywność TYR i że WH-130 ma silniejsze działanie hamujące TYR niż WC i KA.

Następnie zbadaliśmy korelacje między TPC, zawartością ISL,przeciwutleniaczaktywność i aktywność antymelanogenna (tab. 3). TPC było pozytywnie skorelowane z zawartością ISL (0.827), a także z aktywnościami wymiatania rodników ABTS plus i DPPH (odpowiednio 0.886 i 0.896), podczas gdy TPC było odwrotnie skorelowane z zawartością melaniny (-0.859). Zawartość ISL była dodatnio skorelowana z aktywnościami wymiatania rodników ABTS plus i DPPH (odpowiednio 0.977 i 0.985), podczas gdy zawartość ISL była odwrotnie skorelowana z aktywnością TYR (-{16}}. 834) i zawartość melaniny (–0,995). Aktywności przeciwutleniające (ABTS plus i DPPH) były odwrotnie skorelowane z aktywnością TYR (odpowiednio –{{20}}.879 i –0.856) i zawartością melaniny (–{26}}. 974 i –0,984). Wyniki te wskazują, że związki fenolowe, takie jak ISL w lukrecji, są ściśle związane z przeciwutleniaczem iantymelanogennydziałalność ekstraktów z lukrecji.

3.8. Wpływ ekstraktów z lukrecji na ekspresję mRNA genów związanych z melanogenezą

Zbadaliśmy ekspresję genów związanych z melanogenezą w komórkach B16F10, aby wyjaśnić wpływ ekstraktów z lukrecji na melanogenezę. Zarówno WC, jak i WH-130 tłumiły ekspresję mRNA MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 (Figura 6). WC hamował ekspresję mRNA MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 do poziomów 0.{{10}}krotnie, 0.{ {12}}krotnie, 0.71-krotnie i 0.65-krotnie, odpowiednio w stosunku do komórek traktowanych IBMX. WH-130 hamował ekspresję mRNA MITF, TYR, TRP-1 i TRP{{20}} do 0.43-krotnie, {{33 }}.60-krotność, 0.62-krotność i 0.49-krotność, odpowiednio, poziomów grup leczonych IBMX. Ekstrakt WH{{30} miał silniejszy wpływ hamujący na ekspresję mRNA niż ekstrakt WC. ISL tłumił również ekspresję MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 (0.42-krotnie, 0.59-krotnie, 0.68-krotnie i odpowiednio 0.44-krotnie w stosunku do komórek traktowanych IBMX). W grupie leczonej WH-130-, zakres spadku ekspresji mRNA genów związanych z melanogenezą był większy niż w grupie leczonej WC, co wskazuje, żelukrecjaekstrakty hamują melanogenezę poprzez tłumienie transkrypcji genów związanych z melanogenezą, a obróbka cieplna poprawiaantymelanogennyaktywność ekstraktu z lukrecji.

3.9. Wpływ ekstraktów z lukrecji na ekspresję białek genów związanych z melanogenezą

Jak pokazano na Figurze 7b, traktowanie WC i WH-130 znacząco zmniejszyło poziomy ekspresji białka MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2. Poziomy ekspresji MITF, TYR,TRP-1 i TRP-2 były tłumione w komórkach traktowanych WC (0.79-krotnie, 0.{{9 }}krotnie, {{10}}.89-krotnie i 0.67-krotnie, odpowiednio w stosunku do komórek traktowanych IBMX). WH-130 wykazał obniżone poziomy ekspresji białek MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 ({{20}}.74-krotnie, {{24 }}.73-krotnie, 0.80-krotnie i {{30}}.48-krotnie, odpowiednio w stosunku do komórek traktowanych IBMX) . ISL obniżył poziomy ekspresji białek MITF, TYR i TRP-2 (0,76-krotnie, 0,83-krotnie i 0,41-krotnie, odpowiednio, w stosunku do traktowanych IBMX komórki). WH-130 tłumił ekspresję białek genów związanych z melanogenezą silniej niż WC, pokazując, żelukrecjaekstrakty hamują melanogenezę poprzez supresję translacji genów związanych z melanogenezą, a obróbka cieplna poprawiaantymelanogennyaktywność ekstraktu z lukrecji.

Cistanche wybielający skórę w proszku

4. Dyskusja

Wyniki tego badania pokazują, że obróbka cieplnalukrecjawpływa na TPC, aktywność antyoksydacyjną iantymelanogennydziałalność. WH-130 miał wyższy wskaźnik brązowienia i wartości TPC niż WC. Warunki przetwarzania, w tym temperatura i ciśnienie, mają wpływ na składniki próbek. [29]. Ogrzewanie może promować reakcje Maillarda, które są związane z produkcją melanoidyny [23]. Melanoidyny mają pewne efekty biologiczne, w tymprzeciwutleniacz, działanie przeciwnowotworowe i hipotensyjne, a także modulacja poziomu cukru we krwi [30]. Związki te są polimerowymi makrocząsteczkami koloru brązowego, powstałymi w wyniku reakcji Maillarda z interakcji między cukrami i aminokwasami w wysokich temperaturach [21]. Zatem im więcej melanoidyn w podgrzanym ekstrakcie, tym wyższy wskaźnik brązowienia. Kolor nieogrzewanego ekstraktu z lukrecji (WC) był jasnobrązowy, ale kolor stopniowo ciemniał wraz z wysoką temperaturą (130 stopni). Proces ogrzewania może również wywoływać pewne zmiany w strukturze chemicznej związków fenolowych i powodować rozbijanie ścian komórkowych roślin, uwalnianie związków fenolowych, co prowadzi do aktywności antyoksydacyjnej [31]. Tak więc zawartość fenoli w ekstraktach z lukrecji może wzrosnąć wraz z obróbką cieplną [21]. Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że obróbka cieplna miodu zwiększyła tworzenie melanoidyny, a stopień brązowienia zbiegł się ze wzrostem aktywności antyoksydacyjnej [24]. Dlatego WH-130 wykazywał wyższą zdolność antyoksydacyjną niż WC w testach ABTS plus i DPPH zmiatania rodników, które były szeroko stosowane do określania aktywności przeciwrodnikowej próbek na podstawie zdolności do przenoszenia elektronów lub atomów wodoru [32].

Najczęstszy naturalnyprzeciwutleniacza związki antymelanogenne to fenole. Tricyna i kwas 9-hydroksyoktadekadienowy zostały zidentyfikowane jako główne związki fenolowe w Sorgo dwukolorowym. Ponadto składniki te wykazywały działanie antyoksydacyjne i antymelanogenne poprzez hamowanie aktywności tyrozynazy [19]. Dodatkowo udowodniono, że kwas p-kumarowy, związek aktywny z Sasa quelpaertensis Nakai, silnie hamował aktywność tyrozynazy i zmniejszał produkcję melaniny w komórkach czerniaka [27]. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, ISL, dobrze znany związek flawonoidowy w produkcie hydrolizy korzenia lukrecji [6–8], wykazuje działanie przeciwutleniające i przeciwmelanogenne poprzez hamowanie aktywności TYR, transport melanosomów i indukcję degradacji melaniny [10,31]. Skupiliśmy się więc na zawartości ekstraktów ISL i działaniu ISL w mechanizmach związanych z melanogenezą. ISL jest stosowany jako środek leczniczy w wielu chorobach ze względu na liczne działania biologiczne, w tym działanie przeciwzapalne, przeciwbakteryjne, antyoksydacyjne, przeciwnowotworowe, immunoregulacyjne, hepatoprotekcyjne i kardioprotekcyjne [33]. W tym badaniu wyższą zawartość ISL zmierzono w WH-130 niż w WC. Przebarwienia skóry są związane ze stresem oksydacyjnym. Stwierdzono, że zmiatacze wolnych rodników odgrywają ważną rolę w tłumieniu przebarwień [17, 34]. Łącznie wyniki te pokazują, że obróbka cieplna lukrecji może poprawić jej działanie antyrodnikowe iantymelanogennydziałania poprzez zwiększenie poziomu przeciwutleniających związków fenolowych, takich jak ISL. Według dotychczasowej literatury w lukrecji (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) występują glabrene, glabrydyna, glabrol, liquiritygenina, wykazujące hamowanie tyrozynazy. Zatem związki te mogą mieć również wpływ na działanie przeciwmelanogenne [10,11,15,35]. Dalsze badania nad nimi są ważne dla wyjaśnienia antymelanogennego działania lukrecji.

Synteza melaniny jest regulowana przez TYR, TRP-1, TRP-2 (tautomeraza dopachromowa) i MITF (Rysunek 8). TYR, glikoproteina zawierająca miedź, działa jako enzym ograniczający szybkość i odgrywa kluczową rolę w produkcji melaniny. TYR katalizuje hydroksylację tyrozyny do 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA). TYR katalizuje również utlenianie DOPA do dopachinonu i konwersję dopachinonu do dopachromu. Następnie dopachrom jest przekształcany w dihydroindolizynę (DHI) lub indol-5,6-chinon-2-kwas karboksylowy (DHICA) [36–38]. W tym szlaku TRP-2 katalizuje konwersję dopachromu do DHICA, który jest utleniany przez TRP-1 z wytworzeniem eumelaniny. MITF jest specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, który odgrywa kluczową rolę w melanogenezie jako główny regulator ekspresji TYR, TRP-1 i TRP-2 (Rysunek 8) [28,37]. Chemicznym induktorem melanogenezy jest 3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX), która zwiększa aktywność TYR poprzez szlak sygnalizacji cAMP [13]. IBMX zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP poprzez hamowanie fosfodiesterazy cAMP. Wzrost poziomu cAMP aktywuje kinazę białkową A (PKA), a aktywowana PKA poprawia aktywność i ekspresję białka wiążącego związanego z cAMP (CREB) [39]. CREB wiąże się z promotorem MITF, prowadząc do regulacji w górę ekspresji genów MITF. Aktywacja MITF promuje ekspresję TYR i TRP [13,19]. Dlatego obniżenie poziomu MITF powoduje hipopigmentację.

Podgrzewany ekstrakt z lukrecji (WH-130) hamował aktywność TYR grzybów i komórkową aktywność TYR skuteczniej niż niepodgrzewany ekstrakt z lukrecji (WC). Hamowanie komórkowej aktywności TYR w ekstraktach z lukrecji może być spowodowane obniżoną regulacją TYR. Wyniki te są powiązane z zawartością melaniny w komórkach czerniaka B16F10. W komórkach B16F10 leczenie WH-130 hamowało wytwarzanie melaniny indukowane przez IBMX lepiej niż leczenie WC. Co więcej, WH 130 obniżyła transkrypcję i translację markerów związanych z melanogenezą (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) w komórkach B16F10 w większym stopniu niż WC. Te markery mogą łącznie przyczynić się do ogólnegoantymelanogennyaktywność [40].

Ogrzewanielukrecjaekstrakt zwiększał bogactwo antyoksydacyjnych związków fenolowych, takich jak ISL, a wzrost ten wiązał się ze wzrostemprzeciwutleniaczdziałalność (ABTS plus i DPPH). Podgrzewany ekstrakt z lukrecji (WH-130) również wykazywał zwiększoną aktywność hamującą TYR i zmniejszoną syntezę melaniny. Istnieje nowy trend w rozwoju materiałów naturalnych ze względu na potencjał bezpieczeństwa. Lukrecję stosowano w kremach kosmeceutycznych na przebarwienia [41]. Zademonstrowaliśmy potencjał Wongam jako nowegoWybielanie skóryśrodek do stosowania w kosmetyce i zweryfikował, że obróbka cieplna może poprawić jego potencjał.

Glycyrrhiza uralensis Fischer (lukrecja) wykazuje działanie antyoksydacyjne i fotoochronne przed promieniowaniem UV w ludzkich fibroblastach skóry [22]. Jednak badania porównawcze między Wongam (lukrecja) a innymi rodzimymi gatunkami muszą zostać przeprowadzone później. Ponadto należy przeprowadzić dalsze badania nad niezidentyfikowanymi składnikami, takimi jak glabrene, glabridin, Wongam, związanymi z jego działaniem przeciwmelanogennym, odpowiednimi metodami. Niezbędne jest zbadanie synergistycznego lub antagonistycznego działania związków fenolowych po analizie składników ekstraktu z lukrecji [40]. Aby zbadać, jak te substancje działają naprzeciwutleniaczoraz mechanizmy antymelanogeniczne, systemy przenoszenia atomów wodoru lub przenoszenia pojedynczych elektronów oraz szlaki sygnałowe kinaz białkowych aktywowanych mitogenami [32,37].

5. Wnioski

W tym badaniu zbadaliśmy potencjał ekstraktów Wongam, nowej odmianylukrecja, jakbielenieśrodek do stosowania w kosmetykach oraz wpływ obróbki cieplnej na ich bioaktywność. Ekstrakty Wongam (WC i WH-130) wykazywały wysoką aktywność wychwytywania rodników i hamowały syntezę melaniny w melanocytach indukowanych IBMX poprzez tłumienie aktywności TYR. Obróbka cieplna zwiększyłaprzeciwutleniaczi antymelanogenne działania Wongama. W rezultacie WH-130 wykazywał lepsze właściwości przeciwutleniające iantymelanogennyzajęcia niż WC. Nasze wyniki sugerują, że poddany obróbce cieplnej ekstrakt z Wongam (WH-130) jest silnym środkiem redukującym pigment, z możliwym zastosowaniem w różnych dermatologicznych zaburzeniach przebarwień, w tym brązowych plamach, piegach i melasmie, i pokazują, że obróbka termiczna może być stosowana do poprawy antymelanogenne działanie lukrecji.

korzyści cistanche tubolosa: wybielanie skóry