Przeciwutleniające i przeciwzakrzepowe działanie glikozydów fenylopropanoidowych

więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Bartosz Skalski i in

Abstrakcyjny

Rośliny holopasożytnicze z rodziny Orobanchaceae, w tym Cistanche, Orobanche i Phelipanche spp, znane są z bogactwafenylopropanoidglikozydy(PPG). Stwierdzono, że wiele związków PPG posiada szerokie spektrum działania, takie jak działanie przeciwdrobnoustrojowe, przeciwzapalne, przeciwutleniające i wzmacniające pamięć. Aby lepiej zbadać potencjał bioaktywności europejskich broomrapes (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) oraz dziesięciu pojedynczych izolowanych składników fenylopropanoidowych, zbadaliśmy ich działanie przeciwrodnikowe, ochronne przed utlenianiem w osoczu w układzie in vitro oraz wpływ na parametry krzepnięcia. Testowane ekstrakty wykazały aktywność oczyszczającą 50-70 procent mocy Troloxu. Ekstrakt OC, bogaty w akteozyd, miał ponad 20 procent lepszy potencjał przeciwrodnikowy niż ekstrakt PR, który jako jedyny zawierał PPG bez ugrupowania katecholowego pierścienia B w jednostce acylowej. Ponadto stwierdzono, że tylko osiem przetestowanych PPG(phenylopropanoidglikozydy)wykazał potencjał antyoksydacyjny w ludzkim osoczu poddanym działaniu H2O2/Fe; jednak trzy testowane PPG(phenylopropanoidglikozydy)posiadał potencjał antykoagulacyjny oprócz właściwości przeciwutleniających. Wydaje się, że budowa PPG, a zwłaszcza obecność ugrupowań acylowych i katecholowych, związana jest głównie z ich właściwościami antyoksydacyjnymi. Potencjał antykoagulacyjny tych związków jest również związany z ich budową chemiczną. Wybrane PPG wykazują potencjał w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych związanych z:utleniającystres.

Słowa kluczowe:Broomrape, glikozydy fenylopropanoidowe, stres oksydacyjny, hemostaza osocza

CistanchemaFenylopropanoidglikozydy

Kliknij, aby produkty Cistanche

1. Wstęp

Utleniającystresjest powszechnie znany ze swojego negatywnego wpływu na zdrowie organizmów żywych, w tym przyspieszonego starzenia i niektórych nowotworów. Występowanieutleniającystreswiąże się z zaburzeniem równowagi między mechanizmami oksydacyjnymi i antyoksydacyjnymi (m.in. enzymatyczną (katalaza, peroksydaza glutationowa) i nieenzymatyczną (glutation) w komórkach organizmu [1]. Nadprodukcja reaktywnych form tlenu (ROS), w tym rodników utleniających i form o zamkniętej powłoce, jest jednym z głównych mechanizmów powstawania stresu oksydacyjnego. Jednak efekt biologiczny wywołany przez ROS zależy w dużej mierze od stężenia, czasu ekspozycji i lokalizacji. W normalnych warunkach (niskie stężenie) rodniki tlenowo-azotowe mogą pełnić rolę przekaźników wtórnych, ale na wyższym poziomie mogą zacząć reagować ze strukturami biologicznymi, np. błonami komórkowymi [2]. Spośród wszystkich gatunków ROS rodnik hydroksylowy (HO.) powodujeUtleniającystresujewiadomo, że odgrywa ważną rolę w wielu chorobach, w tym sercowo-naczyniowych. Zaburzenia układu krwionośnego były skorelowane i/lub poprzedzone zmianami różnych parametrów hemostazy i biomarkerów osocza [1,3].

Z drugiej strony, wiele naturalnych substancji, takich jak polifenole i wielonienasycone kwasy tłuszczowe, zidentyfikowano jako silne przeciwutleniacze zdolne do zapobiegania tworzeniu się i/lub zmniejszania reaktywnych form tlenu. Związki o takich właściwościach znajdują się w wielu produktach spożywczych i preparatach farmaceutycznych pochodzenia roślinnego. Dieta wzbogacona świeżymi warzywami i owocami oraz terapie antyoksydacyjne oparte na naturalnych antyoksydantach są zatem szeroko polecane, ponieważ mogą obniżyć poziomutleniającystresi zapobiegać różnym procesom patofizjologicznym [4,5]. Polifenole roślinne to zróżnicowana grupa metabolitów wtórnych, wśród których ważne miejsce zajmują kwasy fenolowe, ponieważ są szeroko rozpowszechnione i wykazują różnorodne działanie biologiczne, takie jak działanie przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutleniające i przeciwzapalne.Fenylopropanoidglikozydy(PPG) są pochodnymi estrowymi kwasu hydroksycynamonowego i stanowią główną/jedyną klasę metabolitów wtórnych obecnych w holopasożytniczych roślinach Orobanchaceae, w tym Cistanche, Orobanche i Phelipanche spp. Kilka gatunków z tej rodziny to poważne szkodniki upraw, których rolnicy chcą pozbyć się na polach (przykład Phelipanche ramosa), niewiele jest wykorzystywanych w farmakologii, a większość ma niewielkie znaczenie dla człowieka. Herba Cistanche jest szeroko stosowana w tradycyjnej medycynie azjatyckiej w leczeniu niewydolności nerek oraz jako środek wzmacniający odporność i pamięć, przeciwstarzeniowy i przeciwzmęczeniowy [6]. Analizy fitochemiczne różnych grup badawczych wykazały, żefenylopropanoidglikozydy, takie jak akteozyd, echinakozyd i podium, są jednymi z głównych składników aktywnych Herba Cistanche [7]. Ostatnie badania kilku gatunków drapieżników znalezionych w Polsce przez Jędrejka i in. [8] wykazali, że ten materiał roślinny ma podobny skład jakościowy (dominacja PPG)(phenylopropanoidglikozydy)co więcej, jest równa lub nawet przewyższa Cistanche spp. pod względem zawartości substancji czynnych [8]

Niniejsze badanie miało na celu ocenę potencjału przeciwrodnikowego i antyoksydacyjnego oraz wpływu na parametry hemostazy trzech ekstraktów broomrape (Orobanche caryophyllacea – OC, Phelipanche Arenaria – PA i P. ramosa – PR) bogatych w różne fenylopropanoidy, jak jak również ich pojedyncze składniki PPG. Zdolność przeciwrodnikową mierzono stosując 2,2′-azynobis-3-etylobenztiazolinę-6-kwas sulfonowy/równoważnik troloksu (ABTS/TE) i 2,2-difenyl-1-pikrylohydrazyl (DPPH ) testy. Theutleniającystresw układzie testowym osocza indukowano za pomocą rodnika hydroksylowego (H2O2/Fe), a następnie mierzono peroksydację lipidów (test z reaktywnymi formami kwasu tiobarbiturowego (TBARS)) i poziom grup karbonylowych i tiolowych białka. Wśród oznaczanych parametrów hemostazy były: czas częściowej tromboplastyny ​​po aktywacji (APTT), czas protrombinowy (PT) i czas trombinowy (TT).

CistanchemaFenylopropanoidglikozydy

2. Materiały i metody

2.1. Chemikalia

rodnik 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylowy (DPPH), kwas 2,2′-azynobis-3-etylobenztiazolina-6-sulfonowy (ABTS), nadsiarczan potasu, 6- kwas hydroksy{{9},5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy (Trolox), dimetylosulfotlenek (DMSO), kwas tiobarbiturowy (TBA), kwas mrówkowy (klasa LC-MS) i H2O2 zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Metanol (klasa gradientu HPLC) i acetonitryl (klasa LC-MS) nabyto od Merck (Darmstadt, Niemcy). Dziesięć związków fenylopropanoidowych testowanych w tej pracy, w tym 2′-O-acetyloakteozyd (97 proc.), 2′-O-acetylopoliumozyd (98 proc.), 3-O-metylopoliumozyd (96 proc.), akteozyd (99 proc.), arena w środku (97 proc.), krenatozyd (98 proc.), tenipozyd (99 proc.), poliumozyd (99 proc.), tubulozyd A (96 proc.) i wiede manniosyd D (96 proc.) zostały wcześniej wyizolowane przez nas z podanej poniżej rośliny materiał [8]. Czystość związków oceniano za pomocą analizy UHPLC-PDA-MS. Woda ultraczysta została przygotowana we własnym zakresie przy użyciu systemu oczyszczania wody Milli-Q (Millipore Co.). Inne odczynniki miały czystość analityczną i zostały dostarczone przez krajowych dostawców komercyjnych.

2.2. Materiał roślinny

Rośliny kwitnące trzech gatunków broomrape, w tym Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel i P. ramosa (L.) Pomel zostały zidentyfikowane przez prof. Renata Piwowarczyk (Uniwersytet Jana Kochanowskiego, Kielce, Polska) i zebrana ze źródła naturalnego w Polsce. okazy bonów (O. Caryophyllaceae – Chomentówek ´ (50,3349◦N, 20.4000◦E), murawy kserotermiczne, pasożytujące Galium boreale, maj 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), murawy napiaskowe i ugory, pasożytują Artemisia campestris, czerwiec 2014; P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), polne, pasożytujące Solanum Lycopersicum, wrzesień 2014) są zdeponowane w Zielniku Uniwersytetu Jana Kochanowskiego w Kielcach (KTC). Materiał roślinny liofilizowano i drobno zmielono przed ekstrakcją.

2.3. Przygotowanie ekstraktów z broomrape

Sproszkowany materiał roślinny (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g i P. ramosa (PR) – 3 g) wyekstrahowano 80% MeOH w 40 ◦C i 1500 psi (ciśnienie rozpuszczalnika ) przy użyciu przyspieszonego ekstraktora rozpuszczalnikowego ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Ekstrakty odparowano i liofilizowano (liofilizator Gamma 2-16 LSC, Christ, Niemcy). Wydajność ekstrakcji dla OC, PA i PR wynosiła odpowiednio 55 procent, 37 procent i 43 procent masy materiału roślinnego. Ze względu na wysoką zawartość węglowodanów (dane nie pokazane), surowe ekstrakty dalej oczyszczano przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE) na mikrokolumnie Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Cukry usunięto 1% MeOH, następnie interesujące związki eluowano 80% MeOH. Po usunięciu rozpuszczalnika ekstrakty OC, PA i PR liofilizowano (liofilizator Gamma 2-16 LSC), a wydajności oczyszczania SPE wynosiły 53 procent (OC), 67 procent (PA) i 51 procent (PR). .

2.4. Charakterystyka fitochemiczna ekstraktów z broomrapes

Analizy jakościowe i ilościowe ekstraktów z broomrape przeprowadzono przy użyciu systemu ACQUITY UPLC (Waters) połączonego z detektorem z matrycą fotodiodową (PDA) i tandemowym kwadrupolowym spektrometrem masowym (TQD-MS/MS). Liofilizowane ekstrakty OC, PA i PR rozpuszczono w 50 procentach metanolu o stężeniu 00,50 mg/mL, a następnie poddano chromatografii na kolumnie BEH C18 (1{ {21}}0 × 2,1 mm, 1,7 µm, woda). Warunki chromatograficzne były następujące: temperatura pieca – 25 ◦C, gradient liniowy 10→25% fazy ruchomej B (0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu) w fazie ruchomej A (0,1% kwas mrówkowy w H2O) przez 12 min, szybkość przepływu – 0,4 mL/min, objętość wtrysku – 2 μL, zakres UV – 190–490 nm (rozdzielczość 3,6 nm). Analizę MS przeprowadzono w trybie jonów ujemnych z jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI), przy następujących ustawieniach: zakres skanowania 100–1200 m/z; napięcie kapilarne 2,8 kV; napięcie stożka 35 V; temperatura źródła 150 ◦C; temperatura desolwatacji 450 C; przepływ gazu desolwatacyjnego 900 l/h i przepływ gazu stożkowego 100 l/h. Akwizycję i przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Waters MassLynx 4.1.

Piki glikozydu fenylopropanoidowego (PPG) zidentyfikowano porównując otrzymane dane LC-MS z danymi dla wcześniej izolowanych związków [8]. Obliczanie ilościowe PPG(phenylopropanoidglikozydy)w ekstraktach broomrape oparto na metodzie UPLC-UV z detekcją przy 330 nm i kalibracją wzorca zewnętrznego przy użyciu akteozydu (Sigma-Aldrich, większy lub równy 99 procent, HPLC) jako standardu grupy. Liniowa krzywa kalibracyjna została przygotowana w sześciu stężeniach w zakresie 1–200 ug/ml i wykazała dobrą liniowość (R2 większe lub równe 0,999). Wyniki ilościowe reprezentują średnią ± SD wartość z trzech wstrzyknięć i zostały wyrażone jako miligramy równoważników akteozydów (eq) na gram ekstraktu (mg równoważników akteozydów/g).

CistanchemaFenylopropanoidglikozydy

2.5. Działanie przeciwrodnikowe in vitro

2.5.1. Test na wychwytywanie rodników ABTS

Test przeciwrodnikowy ABTS przeprowadzono metodą opisaną przez Kontek i in. [9], z niewielkimi modyfikacjami, jak następuje: 20 procent MeOH użyto do przygotowania odczynników (7 mM ABTS i 4,9 mM nadsiarczan potasu); roztwory ekstraktów OC, PA i PR, o czterech poziomach stężeń w zakresie 100-400 ug/mL, oraz roztwory Trolox, o sześciu poziomach stężeń w zakresie 10-250 ug/mL, przygotowano z 50% MeOH. Proporcja próbki do ABTS plus roztwór roboczy wynosił 1:25 (obj./obj.). Absorbancję przy 734 nm mierzono po 30 min inkubacji w ciemności za pomocą spektrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

Inhibicję absorbancji (w procentach) obliczono w następujący sposób: [(kontrola Abs-Próbka Abs)/Kontrola Abs] x100.

Równoważniki Trolox (TE) ekstraktów broomrapes obliczono stosując wzór TE {{0}} próbka/wzorzec, gdzie m jest nachyleniem krzywych linii prostej (inhibicja absorbancji w funkcji stężenia). Wartość TE próbki opisuje jej znormalizowaną aktywność przeciwko Troloxowi (TEstandard =1.0). Wartości IC50 dla ekstraktów OC, PA i PR i Troloxu osiągnięto doświadczalnie, a następnie obliczono z ich krzywych prostych (hamowanie absorbancji względem stężenia) i wyrażono w ug/ml.

Test przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (SD).

2.5.2. Test wychwytywania rodników DPPH

Test przeciwrodnikowy DPPH przeprowadzono metodą opisaną przez Jędrejka i in. [8] oraz Brand-Williams i in. [10] z niewielkimi modyfikacjami: roztwory ekstraktów OC, PA i PR o czterech poziomach stężeń w zakresie 50–250 ug/mL oraz roztwory Trolox o sześciu poziomach stężeń w zakresie 10– 250 ug/ml, przygotowano z 50% MeOH. Proporcja próbki do DPPH wynosiła 1:19 (v/v). Absorbancję przy 517 nm mierzono po 30 min inkubacji w ciemności za pomocą spektrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio).

Inhibicję absorbancji (w procentach) obliczono w następujący sposób: [(kontrola Abs-Próbka Abs)/Kontrola Abs] x100.

Równoważnik Trolox (TE) i wartości IC50 próbek testowych obliczono w taki sam sposób, jak w teście ABTS (rozdział 2.5.1). Test przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnie ± SD.

2.6. Roztwory podstawowe badanych związków roślinnych i ekstraktów do eksperymentów z ludzkim osoczem

Roztwory podstawowe badanych związków i ekstrakty roślinne przygotowano w 50 procentowym DMSO. Stężenie końcowe DMSO w badanych próbkach było niższe niż 0,05%, a jego efekty określono we wszystkich eksperymentach.

2.7. Izolacja ludzkiego osocza

Krew ludzką lub osocze pobrano od sześciu stałych dawców (niepalących mężczyzn i kobiet) do banku krwi (Łódź, Polska) i ośrodka medycznego (Łódź, Polska). Krew zbierano jako roztwór CPD (cytrynian/fosforan/dekstroza; 9:1; obj./obj. krew/CPD) lub roztwór CPDA (cytrynian/fosforan/dekstroza/adenina; 8,5:1; obj./obj.; krew/CPDA). Dawcy nie przyjmowali żadnych leków ani substancji uzależniających (w tym tytoniu, alkoholu i suplementacji antyoksydantami) przez co najmniej dwa tygodnie przed oddaniem. Nasza analiza próbek krwi została wykonana zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej w sprawie badań na ludziach i zatwierdzona przez Komisję Etyki Badań w Eksperymentach na Ludziach Uniwersytetu Łódzkiego. Osocze przygotowano przez odwirowanie świeżej ludzkiej krwi przy 4500 x g przez 25 min w temperaturze pokojowej. Stężenie białka obliczono mierząc absorbancję badanych próbek przy długości fali 280 nm, zgodnie z procedurą Whitakera i Granum [11].

CistanchemaFenylopropanoidglikozydy

2.8. Markery stresu oksydacyjnego w ludzkim osoczu

2.8.1. Pomiar peroksydacji lipidów

Peroksydację lipidów w osoczu oznaczono ilościowo, mierząc stężenie substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS). Stężenie TBARS obliczono przy użyciu molowego współczynnika ekstynkcji (ε =156,000 M− 1cm− 1). Metoda została dokładniej opisana w innym miejscu [12,13].

2.8.2. Pomiar grup karbonylowych

Poziom grup karbonylowych obliczono za pomocą molowego współczynnika ekstynkcji (ε=22,000 M− 1 cm− 1) i wyrażono jako nmol grup karbonylowych/mg białka osocza, według Bartosza [13 ] oraz Levine i in. [14].

2.8.3. Oznaczanie grup tiolowych

Zawartość grup tiolowych w białkach osocza mierzono spektrofotometrycznie przy użyciu czytnika SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Niemcy) przez absorbancję przy 412 nm z 5,5'-ditiolo-bis-(2-kwasem nitrobenzoesowym). Metoda jest opisana bardziej szczegółowo w innym miejscu [15–17].

2.9. Parametry hemostazy

2.9.1. Pomiar czasu protrombinowego (PT)

PT oznaczano koagulometrycznie za pomocą optycznego analizatora koagulacji (model K-3002, Kselmed, Grudziądz, Polska) według Malinowskiej i in. [18].

2.9.2. Pomiar czasu trombinowego (TT)

TT wyznaczono koagulometrycznie za pomocą optycznego analizatora koagulacji (model K-3002, Kselmed, Grudziądz, Polska), zgodnie z metodą opisaną przez Malinowską i in. [18].

2.9.3. Pomiar czasu częściowej tromboplastyny ​​po aktywacji (APTT)

APTT określono koagulometrycznie za pomocą optycznego analizatora koagulacji K-3002 (Kselmed, Grudziądz, Polska) według Malinowskiej i in. [18].

2.10. Analiza danych

Test Q-Dixona przeprowadzono w celu wyeliminowania niepewnych danych. Dane testowano pod kątem rozkładu normalnego testem Shapiro-Wilka i równości wariancji testem Levene'a. Statystycznie istotne różnice zidentyfikowano stosując ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya lub test Kruskala-Wallisa. Porównania uznano za istotne przy p < 0.05.="" wartości="" przedstawiono="" jako="" średnie="">

3. Wyniki i dyskusja

Dziesięć wcześniej izolowanych przez nasfenylopropanoidglikozydy[8], w tym 2′-O-acetyloakteozyd, 2′-O-acetylopoliumozyd, 3-O-metylopoliumozyd, akteozyd, arena inside, crenatoside, felipozyd, podium, tubulozyd A i wiedemannioside D, wraz z trzema ekstrakty z broomrape (Orobanche Caryophyllaceae (OC), Phelipanche are naria (PA) i P. ramosa (PR)) były obecnie badane pod kątem łagodzeniautleniającystresoraz właściwości przeciwzakrzepowe w ludzkim systemie osocza. Struktury chemiczne badanych fenylopropanoidów przedstawiono na rys. 1 i, jak widać, wszystkie zbudowane są według podobnego wzoru, z tymi samymi/podobnymi podjednostkami: hydroksytyrozol, monosacharydy (glukoza, ramnoza i/lub ksyloza) i kwas hydroksycynamonowy. Większość badanych związków PPG jest podstawiona kwasem kawowym, ale można go zastąpić kwasem kumarowym lub ferulowym.

Oprócz pojedynczych związków PPG trzy ekstrakty broomrape – OC, PA i PR, które są mieszaniną kilku PPG(phenylopropanoidglikozydy)i służyły wcześniej jako materiał wyjściowy do izolacji związku, zostały również włączone do badania biologicznego. Innym powodem wyboru trzech różnych gatunków była duża różnica w profilu fitochemicznym między nimi, co widać na ryc. 2. Bardziej szczegółowe porównanie ekstraktów OC, PA i PR, w tym dane ilościowe, przedstawiono w tabeli 1. Akteozyd był głównym składnikiem ekstraktu z O. Caryophyllaceae (690 mg/g), tenipozydem i areną zdominowaną przez P. Arenaria (łącznie 550 mg/g), natomiast poliumozyd i jego acetylowana pochodna były najważniejszymi metabolitami Ekstrakt z P. ramosa (razem 640 mg/g). Badane ekstrakty różniły się również ogólną zawartością fenylopropanoidów, najwięcej w OC (810 mg/g), nieco mniej w PR (795 mg/g), a mniej w PA (685 mg/g). Ponadto warto zauważyć, że obecność PPG z ugrupowaniami innymi niż caffeoil, takimi jak kumaroil lub feruloil, została wykryta tylko w ekstrakcie P. ramosa, gdzie związki te stanowiły około jednej szóstej wszystkich PPG (około 120 mg/ g) (tabela 1).

Dotychczasowe badania aktywności przeciwrodnikowejfenylopropanoidglikozydyprzez Heilmanna i in. [19] oraz Jędrejek i in. [8], w tym około 30 różnych PPG(phenylopropanoidglikozydy)takie jak akteozyd, izoakteozyd i krenatozyd, wykazały jego silny związek ze strukturą ugrupowań acylowych (kwasu fenolowego i tyrozolu). Ogólnie rzecz biorąc, modyfikacja lub substytucja ugrupowania katecholowego jednostki acylowej skutkowała znacznym zmniejszeniem aktywności zmiatania wobec reaktywnych form tlenu (ROS) i rodnika DPPH. W niniejszym badaniu potencjał przeciwrodnikowy in vitro trzech ekstraktów broomrape (OC, PA i PR) zbadano testami ABTS i DPPH, a wyniki porównano zarówno ze sobą, jak i z aktywnością poszczególnych składników fenylopropanoidowych mierzonych w nasze poprzednie badanie [8]. Wyniki wyrażono jako ekwiwalenty Trolox (TE) i wartości IC50 (Tabela 2). Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie trzy ekstrakty były dobrymi zmiataczami zarówno rodników ABTS, jak i DPPH, ale również zaobserwowano różnice pomiędzy badanymi próbkami (szacowany TE mieścił się w zakresie 0,5–0,7; 1,0 był odpowiednik Troloxa). Aktywność przeciwrodnikowa próbek była w następującej kolejności: Trolox > OC > PA > PR. Ekstrakt z Orobanche Caryophyllaceae (IC50=155-275 µg/ml) miał ponad 20 procent większą aktywność niż ekstrakt z Phelipanche ramosa (IC50=200-320 µg/ml).

Zgłaszaną najwyższą aktywność wyciągu z OC zmiatania rodników można wytłumaczyć najwyższymi PPG(phenylopropanoidglikozydy)zawartość w tej próbce, a także wkład akteozydu, jego dominującego składnika, który według wcześniejszych badań [8,19] jest jednym z najsilniejszych zmiataczy wolnych rodników wśród metabolitów z tej grupy (TEDPPH=0 0,87; [4]). Biorąc jednak pod uwagę wzajemny związek działania przeciwrodnikowego z zawartością fenylopropanoidów w ekstraktach OC, PA i PR, nie stwierdzono prostej korelacji między tymi dwoma czynnikami (r < 0.5),="" co="" wskazuje="" na="" istotny="" wkład="" profil="" jakościowy.="" jest="" to="" związane="" głównie="" z="" ekstraktem="" z="" p.="" ramosa,="" który="" pomimo="" wysokiego="" poziomu="">(phenylopropanoidglikozydy)({{0}}.8 g/g) charakteryzował się najniższą aktywnością biologiczną wśród badanych próbek (TE ~ 0.5). Ekstrakt PR, jak wspomniano powyżej, był jedyną próbką, która zawierała fenylopropanoidy z kwasami kumarowymi lub ferulowymi, substancjami pozbawionymi ugrupowania katecholowego pierścienia B, o których doniesiono, że mają obniżony potencjał antyoksydacyjny. Cztery badane przez nas związki PPG zawierające modyfikowany kwas kawowy, w tym 3-O-metylopoliumozyd, ramoza A i wiedemanniosyd D, miały TEDPPH około 0,3 [8]. Tak więc obecne wyniki są zgodne i potwierdzają wyniki poprzednich eksperymentów przeciwrodnikowych in vitro na fenylopropanoidach.

Jak Chen i in. [20] wiąże się z większą zdolnością H-donora lub stabilizacją rodnika przez różne grupy funkcyjne mieszaniny związków. Zidentyfikowano kilka elementów strukturalnych jako wzmacniających bezpośrednią aktywność przeciwutleniającą polifenoli, zwłaszcza tych związanych z liczbą i położeniem grup hydroksylowych. Uważa się, że aktywność zmiatania wolnych rodników wzrasta wraz ze wzrostem liczby grup –OH. Jednak pozycja tych grup w cząsteczce ma jeszcze większy wpływ na wywieraną aktywność. Względnie stabilnymi silnymi związkami są te, które posiadają w swojej strukturze ugrupowanie 3,4-dihydroksylowe, a także te, które posiadają więcej niż dwie grupy hydroksylowe [21]. Struktura chemiczna substancji przeciwutleniającej pozwala zrozumieć mechanizm reakcji przeciwutleniającej. Lopez-Munguía i in. [22] na podstawie obliczeń teorii funkcjonału gęstości (DFT) ustalili, że PPG(phenylopropanoidglikozydy)mechanizm antyoksydacyjny przebiega poprzez sekwencyjny transfer pojedynczego elektronu utraty protonów (SPLET). Jednak Li i in. [23] próba zbadania mechanizmów działania antyoksydantów fenolowych, fenylopropanoidowych, doszła do wniosku, że PPG (akteozyd, forsytozyd B i poliumozyd) mogą brać udział w wielu szlakach wywierania działania przeciwutleniającego, wzmacniając rolę reszt cukrowych.

Badania wykazały, że przeciwutleniacze pochodzenia roślinnego są skutecznymi modulatorami hemostazy w chorobach układu krążenia [24–26]. Różne rośliny stosowane w medycynie tradycyjnej zawierają znaczne ilości PPG [27,28]. Ponadto PPG(phenylopropanoidglikozydy)wiadomo, że mają szereg działań biologicznych, w tym właściwości przeciwzapalne, przeciwnerkowe i przeciwhepatotoksyczne [29–33].

W swoim ostatnim badaniu Jędrejek i in. [8] opisali izolację PPG(phenylopropanoidglikozydy)z trzech polskich broomrapów i ocenił ich aktywność antyoksydacyjną testem DPPH. Na tej podstawie niniejsze badanie ocenia, czy dziesięć wybranych PPG wyizolowanych z tych roślin może zmniejszyćutleniającystresw ludzkim osoczu poddawany działaniu silnego biologicznego utleniacza, tj. donora rodników hydroksylowych H2O2/Fe i modulujących właściwości koagulacyjne osocza in vitro. Właściwości przeciwutleniające dziesięciu izolowanych PPG określono zgodnie z wybranymi parametramiutleniającystres: poziom TBARS jako marker peroksydacji lipidów, wraz z poziomem grup karbonylowych i tiolowych jako markery oksydacyjnego uszkodzenia białek.

Zarówno poziom peroksydacji lipidów w osoczu, jak i karbonylacji białek w osoczu indukowany przez H2O2/Fe uległy znacznemu obniżeniu w obecności ośmiu testowanych związków, mianowicie. akteozyd, krenatozyd, 2′-O-acetyloakteozyd, felipozyd, arena inside, tubulozyd A, poliumozyd i 3- O-metylopolimuozyd, we wszystkich badanych stężeniach (1, 5 i 50 µg/ mL); jednakże nie zaobserwowano żadnego efektu dla dwóch z testowanych związków, mianowicie. 2′-O-acetylopoliumozyd i wiedemanniosyd D lub dowolny z badanych ekstraktów w dowolnym stężeniu (1, 5 i 50 µg/ml). Ponadto żaden z badanych związków ani badanych ekstraktów nie chronił osocza przed utlenianiem grup tiolowych indukowanym przez H2O2/Fe w białkach (ryc. 3–5). Badane ekstrakty mogą być jednak źródłem związków o różnych właściwościach biologicznych.

Po raz pierwszy wyniki niniejszego badania wskazują, że osiem z przebadanych PPG(phenylopropanoidglikozydy)wykazują potencjał antyoksydacyjny w ludzkim osoczu w obecności egzogennych reaktywnych form tlenu poprzez hamowanie peroksydacji lipidów i karbonylowania białek w osoczu poddanym działaniu H2O2/Fe. Ponadto 2′-O-acetylopoliumozyd i wiedemanniosyd D nie wykazywały takiego działania. Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia są zgodne z wcześniejszymi eksperymentami in vitro na PPG. Heilmann i in. [19] oraz Jędrejek i in. [8] donoszą o korelacji między budową chemiczną PPG a ich aktywnością. Właściwości przeciwutleniające PPG(phenylopropanoidglikozydy)wydają się być przede wszystkim związane ze strukturą ich ugrupowań acylowych, tj. jednostki kwasu fenolowego i fenylopropanoidu, w tym obecności i/lub modyfikacji ugrupowania katecholowego. Na przykład stwierdzono, że wiedemanniosyd D traci swój potencjał antyoksydacyjny w stosunku do osocza poddanego działaniu H2O2/Fe po zastąpieniu jego ugrupowania kawoilowego ugrupowaniem feruloilowym.

Zmiany w procesie krzepnięcia często wynikają z:utleniającystres; zmiany te mogą modulować funkcje układu sercowo-naczyniowego i prowadzić do rozwoju chorób sercowo-naczyniowych [1]. Spośród dziesięciu związków roślinnych i trzech ekstraktów roślinnych testowanych w niniejszym badaniu tubulozyd, strona podium i 3-O-metylopoliumozyd oraz wszystkie testowane ekstrakty wykazały znaczne wydłużenie czasu trombinowego we wszystkich testowanych stężeniach, a mianowicie. 1, 5 i 50 µg/ml (ryc. 6B). Jednak żaden z tych ekstraktów, ani żaden z badanych związków nie zmienił PT ani APTT (ryc. 6A i C).

Rys. 6. Działanie badanych związków (akteozyd, krenatozyd, 2′-O-acetyloakteozyd, felipozyd, arenariozyd, tubulozyd A, poliumozyd, 3-O-metylopoliumozyd, 2′-O-cetylpolimuozyd, wiedemanniosyd D) ekstrakty (ekstrakt z P. arenaria – PA, ekstrakt z P. ramosa – PR i ekstrakt z O. caryophyllacea – OC) (1–50 µg/mL) na wybrane parametry hemostatyczne osocza: PT (A), TTn (B) i APTT (C). Dane reprezentują średnie ± SEM z sześciu niezależnych eksperymentów.n* p < 00,05="" (w="" porównaniu="" z="" kontrolą),="" ns="" –="" p=""> 0,05 (w porównaniu z kontrolą).

W tabeli 3 porównano wpływ PPG (5 µg/ml) na biomarkeryutleniającystresw plazmie poddanej działaniu H2O2/Fe i ich wpływ na koagulację. Osiem testowanych PPG(phenylopropanoidglikozydy)wykazał potencjał antyoksydacyjny tylko w leczonym ludzkim osoczu; jednak stwierdzono, że trzy testowane PPG mają zarówno właściwości przeciwutleniające, jak i potencjał antykoagulacyjny. Co ciekawe, wyniki testu DPPH nie pokrywały się z wynikami uzyskanymi w modelu biologicznym z użyciem ludzkiego osocza poddanego działaniu H2O2/Fe: potencjał antyoksydacyjny badanych ekstraktów może być blokowany przez niektóre związki obecne w osoczu.

Podsumowując, nasze obecne odkrycia rzucają nowe światło na potencjał antyoksydacyjny i właściwości przeciwzakrzepowe PPG(phenylopropanoidglikozydy). Wydaje się, że struktura PPG(phenylopropanoidglikozydy), zwłaszcza obecność ugrupowań acylowych i katecholowych, jest głównie związana z ich właściwościami przeciwutleniającymi i przeciwzakrzepowymi. Wybrane PPG mogą mieć potencjał w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych związanych z:utleniającystres. Jednak potrzebne są dalsze eksperymenty w celu określenia stężeń tych związków potrzebnych do modeli in vivo.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy deklarują, że nie znają sprzecznych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Bibliografia

[1] A. Daiber, S. Chłopicki, Powracając do farmakologiiutleniającystresi dysfunkcja śródbłonka w chorobie sercowo-naczyniowej: dowody na terapie oparte na redoks, Free Radic. Biol. Med. 157 (2020) 15–37.
[2] J.-J. Sauvain, A. Setyan, P. Wild, P. Tacchini, G. Lagger, F. Storti, S. Deslarzes, MJ Guillemin, M. Rossi, M. Riediker, Biomarkeryutleniającystresi jego związek z redukcją zdolności oddawania moczu u pracowników konserwacji autobusów, J. Occupat. Med. Toksykol. 6 (2011) 18-23.
[3] P. Nowak, B. Olas, B. Wachowicz,Utleniającystresi hemostaza, Post. Biochem. 56 (2010) 239-247.
[4] M. Martinez-Huelamo, J. Rodriguez-Morato, A. Boronat, R. de la Torre, Modulacja Nrf2 przez polifenole z oliwy z oliwek i wina oraz neuroprotekcja, Przeciwutleniacze 6 (2017) 73.
[5] S. Amor, P. Chalons, V. Aires, D. Delmas, Ekstrakty polifenolowe z czerwonego wina i winorośli: potencjalny wpływ na nowotwory, Choroby 6 (2018) 1–12.
[6] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): jeden z najlepszych darów farmaceutycznych tradycyjnej medycyny chińskiej, Front. Pharmacol. 7 (2016) 41-49.
[7] Y. Jiang, P.-F. Tu, Przegląd: analiza składników chemicznych gatunków Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970-1979.
[8] D. Jędrejek, S. Pawelec, R. Piwowarczyk, L. Precio, A. Stochmal, Identyfikacja i występowanie glikozydów fenyloetanoidowych i irydoidowych w sześciu polskich broomrapes (Orobanche spp. i Phelipanche spp., Orobanchaceae), Fitochemia 170 ( 2020), 112189.
[9] B. Kontek, D. Jędrejek, W. Oleszek, B. Olas, Działanie przeciwrodnikowe i antyoksydacyjne in vitro ekstraktów chmielowych bogatych w kwasy gorzkie i ksantohumol, Ind. Crops Prod. 161 (2021) 1-9.
[10] W. Brand-Williams, ME Cuvelier, C. Berset, Zastosowanie metody wolnych rodników do oceny aktywności przeciwutleniającej, Lebensm. Wiss. Technol. 28 (1995) 25-30.
[11] JR Whitaker, PE Granum, Absolutna metoda oznaczania białka oparta na różnicy absorbancji przy 235 i 280 nm, Anal. Biochem. 109 (1980) 156-159.
[12] B. Wachowicz, Adeninowe nukleotydy w trombocytach ptaków, Cell Biochem. Funkcja. 2 (1984) 167–170.
[13] Bartosz, Druga G. twarz, Warsz. PWN 1 (2008) 7.
[14] RL Levine, D. Garland, CN Oliver, A. Amici, I. Climent, AG Lenz, BW Ahu, S. Shaltier, ER Stadtman, Oznaczanie zawartości karbonylowej w białkach modyfikowanych oksydacyjnie, Methods Enzym. 186 (1990) 464-478.
[15] DM Joel, J. Gressel, LJ (red.), Musselman, Parasitic Orobanchaceae: Parasitic Mechanisms and Control Strategies, Springer, Heidelberg, Niemcy, 2013, s. 1–10.
[16] Y. Ando, ​​M. Steiner, Grupy sulfidylowe i dwusiarczkowe błon płytkowych: oznaczanie grup dwusiarczkowych, Biochim. Biofizyka. Acta 311 (1973) 26-37.
[17] Y. Ando, ​​M. Steiner, Grupy sulfidylowe i dwusiarczkowe błon płytkowych: oznaczanie grup sulfydrylowych, Biochim. Biofizyka. Acta 311 (1973) 38-44.
[18] J. Malinowska, J. Kołodziejczyk-Czepas, M. Moniuszko-Szajwaj, I. Kowalska, W. Oleszek, A. Stochmal, B. Olas, Frakcje fenolowe z Trifolium pallidum i Trifolium scabrum części napowietrzne w ludzkim osoczu chronią przed zmiany wywołane hiperhomocysteinemią, Food Chem. Toksykol. 50 (2012) 4023-4027.
[19] J. Heilmann, I. Calis, H. Kirmizibekmez, W. Schuhly, S. Harput, O. Stiher, Radical scavenger activity offenylopropanoidglikozydyw stymulowanych FMLP leukocytach wielojądrzastych: zależności struktura-aktywność, Planta Med. 66 (2000) 746-748.
[20] H. Chen, Y. Zhou, Y. Shao, F. Chen, Wolne kwasy fenolowe w occie starzonym z Shanxi: zmiany podczas starzenia i synergiczne działanie przeciwutleniające, Int. J. Food Prop. 19 (2015) 1183-1193.
[21] CA Rice-Evans, NJ Miller, G. Paganga, Zależności między strukturą a aktywnością przeciwutleniającą flawonoidów i kwasów fenolowych, Wolny rodnik. Biol. Med. 20 (1996) 933-956.
[22] A. Lopez-Munguía, ´ Y. Hernandez-Romero, ´ J. Pedraza-Chaverri, A. MirandaMolina, I. Regla, A. Martínez, E. Castillo, Analogi glikozydów fenylopropanoidowych: synteza enzymatyczna, aktywność przeciwutleniająca i teoretyczna badanie mechanizmu wymiatania wolnych rodników, PloS One 6 (2011) 20115.
[23] X. Li, Y. Xie, K. Li, A. Wu, H. Xie, Q. Guo, P. Xue, Y. Maleshibek, W. Zhao, J. Guo, D. Chen, Antyoksydacja i cytoprotekcja akteozydu i jego pochodnych: porównanie i chemia mechanistyczna, Molecules 23 (2018) 498.
[24] SE Kulling, HM Rawel, Aronia (Aronia melanocarpa) – przegląd charakterystycznych składników i potencjalnych skutków zdrowotnych, Planta Med. 74 (2008) 1625-1634.
[25] BJ Mc Even, Wpływ diety i składników odżywczych na czynność płytek krwi, Semin. Zakrzep. Hemost. 40 (2008) 214-226.
[26] B. Olas, Wielofunkcyjność jagód wobec płytek krwi i rola fenoli z jagód w zaburzeniach sercowo-naczyniowych, Platelets 5 (2016) 1–10.
[27] UB Ismailoglu, I. Saracoglu, US Harput, I. Sahin-Eredemli, Wpływ glikozydów fenylopropanoidowych i irydoidowych na wywołane przez wolne rodniki upośledzenie relaksacji zależnej od śródbłonka w pierścieniach aorty szczura, J. Ethnopharmacol. 79 (2002) 193-197.
[28] ZF Bai, Y. Liu, XQ Wang, Badanie etnicznych roślin leczniczych Orobanche, Cistanche i Boschniakia, Zhongguo Zhong Yao Zhi 93 (2014) 4548–4552.
[29] K. Hayashi, T. Nagamatsu, M. Ito, H. Yagita, Y. Suzuki, Acteoside, składnik Stachys sieboldii MIQ, mogą być obiecującym środkiem przeciwnerczycowym (3): wpływ acetonidu na ekspresję na powierzchni międzykomórkowej cząsteczka adhezyjna-1 w eksperymentalnych kłębuszkach nerkowych u szczurów i hodowanych komórkach śródbłonka, Jpn. J. Pharmacol. 70 (1996) 157-168.
[30] Q. Xiong, K. Hase, Y. Tezuka, T. Tani, T. Namba, S. Kadota, Hepatoprotekcyjne działanie fenylopropanoidów z Cistanche deserticola, Planta Med. 64 (1998) 120–125.
[31] WF Chiou, LC Lin, CF Chen, Acteoside chroni komórki śródbłonka przed indukowanymi przez wolne rodnikiutleniającystres, J. Pharm. Farmacja 56 (2004) 743-748.
[32] S. Sahpaz, N. Garbacki, M. Tits, F. Bailleul, Izolacja i aktywność farmakologiczna estrów fenylopropanoidowych z Marrubium vulgare, J. Ethnopharmacol. 79 (2002) 389–392.
[33] L. Lie-Chwen, W. Yea-Hwey, H. Yu-Chang, Ch Shiou, L. Kuo-Tong, Ch Yueh-Ching, W. Wen-Yen, S. Yoh-Chiang, Efekt hamujący zfenylopropanoidglikozydyi irydoidowe glikozydy na wytwarzanie wolnych rodników i ekspresję 2 integryny w ludzkich leukocytach, J. Pharm. Pharmacol. 58 (2006) 129-135.