Przeciwutleniająca nanowstążka tlenku grafenu jako nowy środek wybielający hamuje mechanizm melanogenezy

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang i Chia-Liang Sun*

ABSTRAKCYJNY:W procesie syntezy melaniny istotną rolę odgrywają reakcje oksydacyjne, a dobrą strategią jest hamowanie produkcji melaniny poprzez redukcję stresu oksydacyjnego. Fuleren i jego pochodne lub kompleksy były uważane za silne wymiatacze wolnych rodników, a następnie zastosowaliśmy wielowarstwowe nanowęgle sp2 w celu odkryciamelaninamechanizmy hamujące syntezę. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy nowe nanomateriały, takie jak wielościenne nanorurki węglowe (MWCNT), krótkie MWCNT, nanowstążki tlenku grafenu (GONR) i krótkie GONR jako środki przeciwutleniające do regulacji produkcji melaniny. Wyniki wykazały, że GONR mają lepsze właściwości antyoksydacyjne w platformach analizy wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego stresu oksydacyjnego niż inne. Zaproponowaliśmy, aby GONR miały grupy funkcyjne zawierające tlen. W teście dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny odkryliśmy, że GONR może chelatować jony metali w celu wymiatania reaktywnych form tlenu. Z punktu widzenia wglądu molekularnego zaobserwowaliśmy, że te nanomateriały obniżyły poziom syntezy melaniny poprzez zmniejszenie ekspresji genów związanych z czynnikami transkrypcyjnymi związanymi z mikroftalmią, i wystąpiły podobne konsekwencje w ekspresji białek. Podsumowując, GONR są potencjalnym środkiem jako nowy antyoksydacyjny i wybielający skórę materiał kosmetologiczny.

Cistanche też jestpotencjalny agent jako powieśćprzeciwutleniaczi wybielanie skórymateriał kosmetyczny.

1. WSTĘP

Skóra jest organem pokrywającym zewnętrzną powierzchnię ludzkiego ciała. Ponieważ interfejs styka się ze środowiskiem, warstwa skóry odgrywa ważną rolę w ochronie organizmu przed patogenami, unikaniu nadmiernej utraty wody, regulacji temperatury ciała i tak dalej. Melanocyty rosną w błonie podstawnej naskórka skóry i stanowią od 5 do 10 procent zawartości komórek. Zostały one scharakteryzowane jako jednokomórkowe "gruczoły" posiadające cienkie, długie, przypominające wstęgi dendryty i rozgałęzienia. Melanocyty przemieszczają się przez znajdujące się w ich bezpośrednim sąsiedztwie komórki naskórka, tworząc konstelację komórek naskórka wokół każdego melanocytu. Istnieje wiele wewnętrznych i zewnętrznych przyczyn starzenia się skóry, a jednym z takich czynników jest promieniowanie ultrafioletowe (UV) pochodzące ze światła słonecznego.1 Podczas ekspozycji na promieniowanie UV poziom reaktywnych form tlenu (ROS) w skórze gwałtownie wzrasta, co jest znane jako stres oksydacyjny. Kilka czynników toksyczności środowiskowej również zwiększa stres oksydacyjny skóry, takich jak pestycydy, czterochlorek węgla, metale ciężkie, aminy aromatyczne i pył zawieszony 2,5 (PM2,5).2 W mechanizmie biochemicznym wewnątrzkomórkowe utleniacze są generowane z substancji nie- układ enzymatyczny, przekształcając je w ROS, aby uruchomić szlak melanogenezy.3

Oprócz ROS istnieje wiele czynników, które wpływają na:produkcja melaniny, w tym ekspresję genów, zapalenie, zmiany endokrynologiczne i wychwyt pigmentu.1 Na pierwszych etapach produkcji melaniny tyrozynaza odgrywa rolę w katalizowaniu tyrozyny do fenomelaniny i eumelaniny. Mechanizmy wytwarzania obu pigmentów są podobne i obejmują hydroksylację L-tyrozyny do 3,4-dihydroksy-L-fenyloalaniny (L-DOPA) oraz utlenianie L-DOPA do dopachinonu. W kolejnym kroku dopamina jest utleniana przez białko 1 związane z tyrozynazą (TRP-1) i białko związane z tyrozynazą 2 (TRP-2) w melanosomie, które jest regulowane przez czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią ( MITF) z wytworzeniem melaniny. W końcu melanina dojrzewa i wytrąca się w warstwie rogowej naskórka.4,5 Przenikają one do sąsiednich keratynocytów warstwy podstawnej i chronią ich DNA przed wszelkimi mutacjami lub modyfikacjami wywołanymi przez promieniowanie UV. Dojrzała melanina w melanosomach jest przenoszona do keratynocytów6−9 i ostatecznie prowadzi do długotrwałej pigmentacji. Plamy soczewicowate, piegi i brązowe/czarne plamy czasami powodują problemy społeczne u mężczyzn i kobiet. Blokowanie stresu oksydacyjnego lub tłumienie aktywności tyrozynazy jest jedną ze strategii zmniejszania zespołu hiperpigmentacji i zaburzeń dermatologicznych. Przeciwutleniacze leczą hiperpigmentacje i uszkodzenia komórek wywołane przez ROS.10,11 Z tego względu zsyntetyzowane związki antyoksydacyjne mają wiele biofunkcjonalnych zastosowań w pielęgnacji skóry.

Fuleren (C60), nanorurka węglowa (CNT), grafen i nanowstążka grafenowa (GNR) to cztery rodzaje nanowęgla sp2 szeroko badane na całym świecie.12 Fuleren i jego pochodne lub kompleksy są uważane za silnezmiatacze wolnych rodnikówprzez długi czas. Yodh i in. zastosował rozpuszczalny w wodzie C60 jako środek ochronny przed zwyrodnieniem wywołanym stresem katabolicznym. Wstrzyknij i in. stwierdził, że C60(OH)24 jest silnym związkiem antyoksydacyjnym, gdy stres oksydacyjny jest zbyt wysoki. Okuda i in. zasugerowali, że kompleksy C60 mogą zapobiegać uszkodzeniom komórek, w których pośredniczy NO.13,14 Tong et al. wykazali, że kompleksy C60 mogą być obiecującymi kandydatami do leczenia chorób związanych z mózgiem spowodowanych podwyższonym poziomem ponadtlenku. W rzeczywistości japońska firma zidentyfikowała w 2006 roku fulereny o silnym działaniu przeciwutleniającym w kosmetyce. Lucente-Schultz et al. wykazali, że zdolność wymiatania rodników tlenowych przez funkcjonalizowane jednościenne CNT (SWCNT) jest prawie 40 razy większa niż w przypadku dendrytycznych C60.15-19 Fenoglio et al. zaobserwowali, że wielościenne CNT (MWCNT) mają niezwykłą zdolność wymiatania rodników w kontakcie z zewnętrznym źródłem rodników hydroksylowych lub ponadtlenkowych.20 Obliczenia teorii funkcjonału gęstości ujawniły również model SWCNT jako wymiataczy wolnych rodników. W 2004 roku Novoselov i in. po raz pierwszy wykazali, że grafen wykazuje silny ambipolarny efekt elektryczny i może być obiecujący w zastosowaniach elektronicznych.21 Następnie nadal wykazali, że grafen ma właściwości elektronowe, które są charakterystyczne dla dwuwymiarowego gazu cząstek opisanych równaniem Diraca.22,23 W tych dwóch przełomowych artykułach coraz więcej uwagi poświęca się badaniom nad grafenem.24-30 Na przykład Qiu i in. w 2014 roku wykazali, że tlenek grafenu i grafen kilkuwarstwowy wykazują znaczną aktywność przeciwutleniającą i mogą chronić różne cząsteczki biomolekularne przed utlenianiem.31 Han i in. eksperymentalnie zademonstrowano w 2007 r., że lukę energetyczną GNR można kontrolować podczas procesu litografii poprzez zmianę szerokości wstęgi.32 Spośród czterech nanowęglów, GNR zwróciły najmniej uwagi. Zgodnie z naszą wiedzą niewiele jest badań dotyczących właściwości przeciwutleniających nanowstążek tlenku grafenu (GONR).31,33 Dlatego w tym badaniu starannie przygotowaliśmy MWCNT, krótkie MWCNT, GONR i krótkie GONR i mieliśmy na celu porównanie ich właściwości przeciwutleniających i związanych z tym wyników systematycznie.

2. WYNIKI I DYSKUSJA

2.1. Morfologia MWCNT i GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm do 2−3 μm. Jednocześnie zaobserwowano, że obróbka kwasem azotowym powoduje szorstkość gładkich powierzchni rur. Na obrazie w dużym powiększeniu widoczne są wcięcia i nieregularne kształty. Ponadto, stosując MWCNT i krótkie MWCNT w reakcjach mikrofalowych uzyskuje się odpowiednio GONR i krótki GONR. Zilustrowaliśmy również obrazy TEM w małym i dużym powiększeniu GONR i krótkiej GONR. Wydaje się, że ze względu na duże rozpinanie wzdłużne i niewielkie cięcie poziome GONR były krótsze niż MWCNT. Z drugiej strony, zdjęcia w dużym powiększeniu wykazały większe średnice, tj. 0.11−0,18 μm, GONR niż te z MWCNT, co wskazuje, że proces rozpakowywania się powiódł. Podobnie krótkie GONR wykazywały krótszą długość i większą średnicę niż krótkie MWCNT. W sprężarce powietrza naszego nowego procesu rozpakowywania cienkowarstwowe struktury GONR były mniejsze niż te, które uzyskaliśmy we wczesnym raporcie dla tej samej mocy mikrofal 250 W przy zachowaniu grubszych centralnych MWCNT.12 Oznaczało to rdzeń-powłoka MWCNT W nowym procesie heterostruktura /GONR byłaby bardziej prawdopodobna zamiast całkowicie rozpakowanej struktury nanowstążek we wszystkich mocach mikrofalowych. W porównaniu z krótkim GONR w naszych poprzednich badaniach34, wyższa moc mikrofal generowała więcej nacięć na bokach wstęg i nie tworzyła ładnych, gładkich krawędzi wstęgi. Zauważ, że na rysunku 1a użyliśmy dwóch różnych rodzajów siatek Cu. Dla MWCNT i GONR o wystarczającej długości zastosowano siatkę Gu z koronkowym formvarem stabilizowanym węglem (nr produktu 01881-F, Ted Pella, Inc., USA). Otwarte otwory w koronkowej folii węglowej zapobiegały nakładaniu się obrazu transmisji między nanowęglami a folią węglową. Ciemnoszare sieci należą do Lacey Carbon Film. Jednak siatka Gu z formvarem stabilizowanym węglem (nr produktu 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) była potrzebna dla krótkiego MWCNT i krótkiego GONR. To dlatego, że duże dziury w koronkowej folii węglowej powodowały problemy z efektywnym utrzymywaniem krótkiego MWCNT i krótkiego GONR. Jak pokazano na rysunku 1, jasnoszary kontrast pod krótkimi MWCNT i krótkimi GONR to lekka warstwa węgla. Ta warstwa węgla stabilizowała folię formvaru wystawioną na działanie wiązki elektronów dzięki jej właściwościom przewodnictwa cieplnego i elektrycznego.

2.2. Konfiguracje wiązania MWCNT i GONR.

Widma Ramana czterech nanowęglów przedstawiono na rysunku 1b; pasmo D GONR było wyższe niż MWCNT po procesie rozpakowywania. Przypisano to wyższemu poziomowi utlenienia i większej liczbie struktur krawędziowych GONR w porównaniu z MWCNT. Zjawisko to jest również podobne do tego, co zaobserwowaliśmy w 2011.12. Ze względu na wysoki poziom grafityzacji, pasmo G MWCNT miało najniższą liczbę w pełnej szerokości przy połowie maksymalnej liczby. Stosunki ID/IG czterech nanowęglów wynosiły odpowiednio {{10}}.076, 00,502, 0,483 i 0,700. W skrócie, zmniejszona długość i utlenienie powierzchni zwiększyły poziom defektów, a tym samym zwiększyły stosunki ID/IG. Pik D′ występuje we wszystkich wadliwych grafenach i jest postrzegany jako miara jakości.35 Jak pokazano na rysunku 1b, piki D′ w czterech widmach stają się bardziej widoczne po procesie cięcia lub rozpakowywania, co sugeruje, że są one niszczące. procesy, które wprowadzają wiele defektów. Rysunek 1c,d przedstawia widma rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów czterech nanowęgli. Najwyraźniej pik D′ jest najczystszy dla krótkich GONR. Jak pokazano na rysunku 1c, poziom O znacznie wzrósł z 7,6 procent (MWCNT) do 19,9 procent (GONR) z powodu silnej zdolności utleniania KMnO4 w środowisku kwaśnym. Z drugiej strony, poziom O nieznacznie wzrósł o 0,8 procent z MWCNT do krótkich MWCNT. Co ważne, najwyższy poziom O wynosi 38,3 procent dla krótkiego GONR, co oznacza, że ​​końce nanowstążek byłyby łatwiejsze do przyłączenia grup funkcyjnych tlenu niż płaskie powierzchnie sp2. Większa liczba o pełnej szerokości przy połowie maksymalnej liczby i przesunięcie do wysokiej energii wiązania pików C1s po procesie rozpakowywania zarówno MWCNT, jak i krótkich MWCNT są zilustrowane na Figurze 1d. W przypadku tlenków grafenu rozłożone piki po stronie o wysokiej energii wiązania można przypisać wiązaniom C−C(CC), C−O, CO i COOH.36 W 2013 r. scharakteryzowaliśmy GONR (200 W). ,37 a wyniki były podobne do wyników tego badania. Badanie to zakończyło zjawisko widm Ramana, co oznacza, że ​​więcej grup funkcyjnych zawierających tlen zostało wygenerowanych podczas transformacji rura-wstążka (ryc. 2).

2.3. Właściwości antyoksydacyjne MWCNT i GONR.

2.3.1. Oznaczanie aktywności zmiatania wolnych rodników 1,1-difenylu-2-pikrylohydrazylu.

1,1- Difenyl-2-pikrylohydrazyl (DPPH) jest zmiataczem wolnych rodników jest platformą antyoksydacyjną stosowaną do wykrywania zdolności antyoksydacyjnych; wyniki dla czterech nanowęglów opisano w Tabeli 2. W teście DPPH jako kontrolę pozytywną zastosowano witaminę C w stężeniu 100 μM. W celu zbadania aktywności przeciwutleniającej MWCNT, krótkich MWCNT, GONR i krótkich GONR, dawki 1, 5 i 10 mg/L inkubowano w roztworze reakcyjnym w celu pomiaru właściwości. MWCNT, krótkie MWCNT, GONR i krótkie GONR miały umiarkowane zdolności hamujące przy 10 mg/l (19,2 ± 0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 i 30,0 ± 0,4 proc.), podczas gdy witamina C miała podobny stan przy 100 μM (93,4 ± 0,1 proc.) dla supresji.

2.3.2. Test aktywności chelatującej jony.

W sytuacji stresu oksydacyjnego, ferrozyna może tworzyć kompleks z Fe2plus, który można zmierzyć ilościowo. W obecności mediatorów chelatujących kompleks ulega rozerwaniu, powodując redukcję jonów żelazawych z ciemnoczerwonego koloru kompleksu Fe2 plus. Jako kontrolę pozytywną użyliśmy EDTA. Tabela 2 pokazuje, że MWCNT, krótkie MWCNT, GONR i krótkie GONR miały aktywność chelatującą przy 10 mg/l (29,2 ± {{10}},8, 28,7 ± 0 0,7, 69,7 ± 0,6 i 68,9 ± 0,3 procent), podczas gdy kontrola pozytywna miała podobny stan przy 100 μM (93,4 ± 0,1 procent).

2.3.3. Pomiar mocy przeciwutleniacza redukującego żelazo.

Test potencjału redukującego żelazo jest prostym i wiarygodnym testem stosowanym do ilościowego określenia syntezy kompleksu Fe(III)-żelazicyjanek. W tym teście siła redukująca czterech nanowęgli wytwarzających kompleks żelaza(III)-TPTZ została wykryta przez zmiany barwy roztworu z żółtej na zieloną i niebieską. Tabela 2 pokazuje, że mocami redukcyjnymi MWCNT, krótkiego MWCNT, GONR i krótkiego GONR były gęstość optyczna (OD) 1,11, 1,13, 1,15 i 1,11 przy 10 mg/l.

2.3.4. MWCNT i GONR hamują wewnątrzkomórkową akumulację ROS.

Wiele doniesień wykazało, że ROS niszczy integralność strukturalną błon komórkowych, w tym błon komórkowych i błon jądrowych, prowadząc do uszkodzenia komórek i utraty normalnej funkcji.38-40 Ponadto ROS jest również jednym z ważnych czynników katalizujących tworzenie tyrozynazy. melaniny, a hamowanie produkcji ROS jest dobrą strategią obniżania syntezy melaniny. W tym badaniu zastosowaliśmy test barwienia dioctanem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFDA) do analizy poziomu wewnątrzkomórkowego stresu oksydacyjnego w komórkach traktowanych MWCNT i GONR. 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) indukował stymulację oksydacyjną w grupach MWCNT i GONR i był stosowany jako kontrola negatywna.41 Gdy stężenie PMA wynosiło 20 ng/ml, wywoływało stres oksydacyjny, zwiększając wartość do 38 procent ; po leczeniu GONR i MWCNT poziomy ROS zostały obniżone do normalnego poziomu. Dane wykazały, że oba materiały hamowały poziomy stresu oksydacyjnego, a działanie antyoksydacyjne GONR było wyższe niż MWCNT (Rysunek 3). Tabela 1 przedstawia podobną listę konsekwencji. Utrzymywaliśmy, że istnieją trzy powody naszych nowych odkryć: po pierwsze, kolejność rozpuszczalności tych materiałów była następująca: krótkie GONR > GONR > krótkie MWCNT > MWCNT, co oznacza, że ​​powierzchnia styku krótkich GONR była największa, więc lepszy do usuwania ROS. Po drugie, GONR i MWCNT były strukturami węglowymi sp2-, które mogą niszczyć elektryczność ROS poprzez tworzenie adduktów lub przenoszenie elektronów.42 Odkryliśmy, że działanie antyoksydacyjne struktur nanowstążek było lepsze niż struktur nanorurek, więc nanowstążki to umożliwiają łatwiej przenosić elektrony niż nanorurki. Wreszcie na rysunku 1b obserwujemy, że miejsce węglowe GONR sp2- zawierało więcej funkcyjnych grup tlenowych niż MWCNT, grupy kwasu karboksylowego mogły chelatować jony metali, a grupy hydroksylowe mogły być donorami H do zmiatania ROS i hamują produkcję melaniny.

2.4. Cytotoksyczność MWCNT i GONR leczonych w ludzkich komórkach fibroblastów skóry.

Do oceny właściwości cytotoksyczne GONR na komórkach Hs68 (Figura 3), a komórki hodowano w różnych dawkach 1, 5 i 10 ug/ml. Zbadaliśmy, że żywotność komórek MWCNT wynosiła 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 i 94,1 ± 4,7 procent przy stężeniach odpowiednio 1, 5 i 10 mg/l; żywotność dla krótkiego MWCNT obliczono w tej samej kolejności i stwierdzono, że wynosi ona 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 i 98,9 ± 2,1 procent. Zaobserwowaliśmy, że komórki B16-F10 były inkubowane w wysokich stężeniach, a przeżywalność komórek Hs68 wynosiła ponad 80 procent, co sugeruje, że MWCNT i krótki MWCNT nie miały toksycznego wpływu na ludzkie komórki fibroblastów skóry. Żywotność komórek GONR i krótkiego GONR wynosiła 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 i 90,64 ± 2,5 procent. Wskazano również na Figurze 4a, że ​​GONR i krótki GONR nie miały dostrzegalnego działania cytotoksycznego na komórki HS68. We wcześniejszych doniesieniach wykorzystanie nieprzetestowanych nanomateriałów do celów kosmetycznych można było uznać za wątpliwe,43,44 i było to zwykle spowodowane atakiem DNA po wniknięciu nanocząstek do komórek. Po teście cytotoksyczności stwierdziliśmy, że nasze materiały nie powodują toksyczności dla normalnych komórek skóry. Doszliśmy do wniosku, że po wejściu nanomateriałów do komórek, nanomateriały po prostu hamują produkcję melaniny poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego i chelatowanie jonów metali i nie uszkadzają mitochondriów ani DNA, co oznacza, że ​​MWCNT i GONR były bezpieczne w użyciu.

2.5. Dwa typy MWCNT i GONR w aktywności tyrozynazy komórkowej B16-F10 i zawartości melaniny.

W szlaku syntezy melaniny tyrozynaza odgrywa kluczową rolę. Tyrozynaza utlenia się i tworzy eumelaninę i feomelaninę poprzez szereg reakcji biochemicznych. W celu określenia, czy GONR i MWCNT hamują aktywność tyrozynazy i powodują zmniejszenie produkcji melaniny, przeanalizowaliśmy aktywność tyrozynazy w komórkach B16-F10. Odkryliśmy, że MWCNT i krótkie MWCNT hamowały aktywność tyrozynazy o około 17,1 procent i 23 procent przy 10 mg/l. GONR i krótkie GONR miały lepsze efekty w tłumieniu aktywności tyrozynazy przy tych samych stężeniach w porównaniu z innym GONR. Były one również w sposób zależny od dawki i hamowały 49,8 procent i 44,7 procent aktywności tyrozynazy, jak pokazano na rysunku 4b.

Melanina jest niezbędnym pigmentem w ludzkim ciele, ale nadekspresja melaniny często wywołuje szereg chorób. W poprzednich badaniach Xiao i in. użył podobnego materiału, Radical Sponge, nanocząsteczki fulerenu, jako środka przeciw melaninie.45 Osiągnięto dobre wyniki; około 20 procent produkcji melaniny może zostać zahamowane. Aby poprawić jego wydajność, dodatkowo ulepszyliśmy materiał testowy, aby zmierzyć szybkość hamowania melaniny i jej mechanizm molekularny, jak pokazano na rysunkach 4c i 5. MWCNT i krótkie MWCNT zmniejszyły zawartość melaniny o 17,6 ± 5,5 i 13,2 ± {{ 16}},2 procent przy 10 mg/l iw sposób zależny od dawki. GONR i krótkie GONR silnie obniżyły wartości do 32,0 ± 2,3 i 35,3 ± 3,4 procent przy 10 mg / l. Wyniki eksperymentalne sugerują, że wszystkie cztery typy mogą hamować syntezę melaniny, a GONR miały silniejszy efekt. Z drugiej strony zaobserwowaliśmy również, że krótki GONR ma lepszy efekt w hamowaniu produkcji melaniny. Doszliśmy do wniosku, że krótkie GONR mają więcej grup funkcyjnych i mogą skutecznie zapobiegać tyrozynazie katalizowanej jonami metali, dodatkowo hamując produkcję melaniny (ryc. 2). W tabeli 1 obserwujemy, że wysiłek typu krótkiego chelatującego jony metali jest wyższy niż typu normalnego; oznacza to, że te krótkie GONR mogą być potencjalnie stosowane w kosmetyce jako środki do pielęgnacji skóry.

2.6. Mechanizm MWCNT i GONR hamował zawartość melaniny komórkowej B16-F10.

Komórki reagują na zewnętrzny stres oksydacyjny regulując ekspresję białek. Komórki B16−F10 wzmacniają ekspresję genu c-myc i podwyższają poziom AMPK w celu obniżenia poziomu oksydacji,46 a w tej pracy MITF jest specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym tyrozynazy, regulującym szlak molekularnej syntezy melaniny.47−49 Na rycinie 5a, MWCNT i GONR regulują w dół czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego, a następnie niższe poziomy TRP-1 i TRP-2 są również w dół. W przypadku poziomu białka stwierdzono podobne zjawisko, w którym MWCNT i GONR regulowały w dół szlak melanogenezy związany z MITF, a następnie ostatecznie zmniejszały zawartość melaniny (Rysunek 5b).

3. MATERIAŁY I METODY DOŚWIADCZALNE

3.1. Przygotowanie MWCNT i GONR.

Odpowiedni proces wytwarzania GONR opisano w poprzednim artykule.12 MWCNT (0.05 g) zawieszono w 9:1 H2SO4/H3PO4 i poddano obróbce w reaktorze mikrofalowym (CEM-Discover) z mocą ustawioną na 250 W przez 2 min. Po dodaniu KMnO4 (0,25 g) do roztworów, roztwory poddano działaniu tej samej mocy mikrofal przy 65 stopniach przez 4 min12 Następnie zmodyfikowaliśmy ten proces, stosując krótszy czas mikrofal drugiego etapu wynoszący 8 min, stosując kompresor powietrza. Tutaj sprężarka powietrza służy do kontrolowania temperatury reaktora mikrofalowego podczas procesu. W badaniach wstępnych moc mikrofal została ustawiona na 250 W.

3.2. Przygotowanie krótkich MWCNT i krótkich GONR.

Odpowiedni proces tworzenia krótkich GONR został opisany w naszym poprzednim artykule.34 Czas obróbki kwasowej został wybrany jako 8 godzin. Moc mikrofal została ustawiona na 250 W, czyli tyle samo, co przy uzyskiwaniu GONR.

3.3. DPPH Wymiatanie radykałów.

DPPH był często używany do decydowania o zdolności zmiatania próbek i właściwościach antyoksydacyjnych.50 DPPH jest fioletowym odczynnikiem, który zmienia kolor z fioletowego na żółty, jeśli wolny rodnik zostanie przeniesiony do analitu. Do roztworu dodano próbki o pozytywnych właściwościach antyoksydacyjnych o odpowiednich stężeniach i próbki analizowano przy 517 nm przez 30 min. Wykorzystaliśmy procenty pozostałego DPPH oprócz próbek testowych, aby zmierzyć ilość przeciwutleniacza wymaganego do redukcji poprzednich rodników DPPH. Jako kontrolę pozytywną zastosowano witaminę C w stężeniu 100 μM. Aktywność oczyszczającą ( procent ) zmierzono jako

Wydajność oczyszczania ( procent )=(Próbka − Ślepa próba) / (Akontrola − Ślepa próba) × 100 procent (1)

3.4. Aktywność chelatująca metale.

Jon metalu jest czynnikiem, który powoduje nadmierne utlenianie lipidów, a Fe2 plus jest jednym z najbardziej wpływających jonów.50 Różne stężenia nanobiomateriału (1 μl) załadowano do płytki 96-dołkowej, która zawierała 2 mM FeCl2·4H2O (10 μl), a następnie załadowany do ferrozyny (5 mM, 20 μl). Mieszankę całkowicie zmieszano z 69 µl mentolu i utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Następnie próbkę roztworu reakcyjnego obserwowano przy 562 nm. EDTA zastosowano jako kontrolę pozytywną w stężeniu 100 μM, a wzór obliczania aktywności chelatującej metale oparto na równaniu 1.

3.5. Zmniejszenie mocy.

Obliczenie mocy redukującej opiera się na poprzednim badaniu.50 Najpierw 2,5 μl materiałów grafenowych zmieszano z buforem PBS (67 mM, pH 6,8) i K3Fe(CN)6 (2,5 μl, 20 procent), a następnie inkubowano w temperaturze 50 stopni przez 20 min. Następnie 10% kwas trichlorooctowy (160 μl) zmieszano z odczynnikami przy 300 g wirowanych przez 20 min. Długość absorpcji określono przy 700 nm po zmieszaniu z 25 µl FeCl3 (2 procent). Butylowany hydroksyanizol (BHA) zastosowano w stężeniu 100 μM.

3.6. Badania proliferacji komórek.

Do analizy stosunku proliferacji komórek zastosowano linię komórkową ludzkich fibroblastów skóry HS68. HS68 inkubowano w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (DMEM), zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% zmieszanej penicyliny i streptomycyny.50,51 Po potraktowaniu różnymi stężeniami próbek, zastosowaliśmy MTT w celu wykrycia współczynnika proliferacji komórek. 8000 komórek wysiano na 96-płytkach ze studzienkami i traktowano próbkami przez 24 godziny. Roztwór supernatantu usunięto i użyliśmy roztworu MTT do hodowli przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji usunęliśmy pożywkę zawierającą MTT i rozpuszczono ją w dimetylosulfotlenku (DMSO). Roztwór odczytano przy OD 590 nm, a szybkość obliczono za pomocą równ. 1.

3.7. Ocena zawartości melaniny w komórkach.

Zastosowaliśmy metodę z niewielkimi modyfikacjami opartą na poprzednim teście.52,53 Osady komórkowe B16-F10 z Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) rozpuszczono w mieszaninie 2,0 N NaOH i 10% DMSO. Próbkę następnie ogrzewano przez 1 godzinę w 90 stopniach i odwirowywano przy 10,{11}g przez kolejne 10 minut w celu uzyskania sklarowanego supernatantu. Liczbę melaniny określono przez monitorowanie OD supernatantu przy 475 nm.

3.8. Aktywność tyrozynazy komórkowej B16-F10.

W przypadku aktywności tyrozynazy komórkowej B16-F10 odwołaliśmy się do poprzedniej pracy z pewnymi modyfikacjami.50 Komórki hodowano na płytkach 12-dołkowych po 105 komórek na dołek. Po traktowaniu próbkami komórki poddano lizie w 1% Triton X-100/PBS i 2 mM L-tyrozynie (50 μl) przez 3 godziny. Po inkubacji usunięto pożywkę i odczytaliśmy absorbancję przy OD 590 nm. Wzór na aktywność tyrozynazy obliczono z równania 1.

Cistanche jest inhibitorem tyrozynazy.

3.9. Wykrywanie ROS przez barwienie DCFDA.

Odnosząc się do poprzedniego badania, 54 1.2 1.105 komórek B16-F10 wysiano na 6-dołkowych płytkach i potraktowano różnymi stężeniami próbek. Komórki zawieszono w PBS, a następnie załadowano DCFDA (5 μM) w DMEM z czerwienią niefenolową przez 30 min w 37°C. Do wykrywania sygnału fluorescencyjnego DCFDA zastosowano cytometr przepływowy (Guava, Merck, Niemcy). Długości fali wzbudzenia i emisji DCFDA wynosiły odpowiednio 488 i 535 nm.

3.10. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym.

Postępowaliśmy zgodnie z metodami Lin et al. (2018).1 Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) składała się z wyłącznej sondy startera do generowania fluorescencji. Wykorzystano technikę wykrywania fluorescencji, która wykrywa każdy cykl przy użyciu systemu 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, USA). Wykrywał cykl na podstawie ilości uwolnionej fluorescencji, a następnie obliczał iloczyn każdego cyklu dla wygenerowanej zawartości, co skutkowało osiągnięciem celów ilościowych w czasie rzeczywistym. Trizol (Invitrogen, USA) został użyty do ekstrakcji pełnego RNA tkanki płucnej, zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Następnie do wygenerowania DNA zastosowano zestaw do odwrotnej transkrypcji (Takara, Japonia). W qRT-PCR z użyciem starterów wymienionych w Tabeli 1, najpierw próbkę ogrzewano w celu utworzenia pojedynczej nici DNA; następnie nastąpiło wiązanie startera z wytworzeniem dwuniciowego DNA (dsDNA), po czym połączono dsDNA SYBR Green, do którego zastosowano zestaw odczynników SYBR green plus (Roche, Basel, Swiss), co spowodowało uwolnienie fluorescencji. Otrzymany produkt przepuszczono przez system detekcji fluorescencji. Wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych odbywało się podczas fazy wydłużania lub hybrydyzacji każdego cyklu; po wykryciu zawartość próbki została cofnięta przez wykryte intensywności fluorescencji.55 Poziomy ekspresji docelowych genów normalizowano do poziomów β-tubuliny, stosując metodę 2-ΔΔCt.

mirycetyna

3.11. Test Western Blot.

Komórki B16-F10 poddano lizie w 4 stopniach przez noc w buforze do testu radioimmunoprecypitacyjnego (Thermo Scientific Co., USA), który zawiera inhibitory proteazy. Do ilościowego oznaczenia ilości białka zastosowano zestaw do oznaczania białka kwasu bicynchoninowego (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA). Próbki białek rozdzielono na 10% żelu dodecylosiarczan sodu-poliakrylamid i przeniesiono na membranę z difluorku winylidenu (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). Błonę PVDF zablokowano buforem blokującym (Thermo Scientific) przez 1 godzinę i inkubowano ze specyficznym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w 4 stopniach. Następnie membranę dwukrotnie przemywano buforowanym roztworem soli fizjologicznej Tris-Tween 20 i inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1,5 godziny. Następnie membranę zanurzono w odczynnikach do wykrywania chemiluminescencji (Thermo Scientific) i analizowano za pomocą urządzenia do obrazowania chemiluminescencji MiniChemi (Beijing Sage Creation Science, Chiny). Źródła przeciwciał obejmowały królicze anty-MITF, królicze anty-TRP-1, królicze anty-TRP-2 i -aktynę (Thermo Scientific).

3.12. Analiza materiałowa.

Do obserwacji morfologii nanowęglów wykorzystano TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV). Zastosowano mikrospektrometr Ramana (PTT, RAMaker) do sprawdzenia modów rezonansowych nanowęgli. Przeprowadzono również pomiary rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) w celu określenia analizy składu.12,34

3.13. Analiza statystyczna.

Wszystkie próbki i standardowe eksperymenty powtórzono co najmniej trzykrotnie. Do porównania i wyrażenia statystycznie średniej wartości średnich ± odchylenie standardowe zastosowano test t-Studenta.

4. WNIOSKI

Podsumowując, zaobserwowaliśmy, że krótki GONR był potencjalnym materiałem na produkty do pielęgnacji skóry ze względu na jego liczne właściwości biofunkcjonalne (Rysunek 6). Wyniki pokazały, że nanowęgle odgrywały rolę jako przeciwutleniacz zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy. Tymczasem nanowęgiel hamował aktywność tyrozynazy i zawartość melaniny oraz nie powodował poważnych uszkodzeń komórek barwnikowych. Ta praca ustaliła funkcje antymelanogenezy czterech typów nanowęglów; przyszłe badania będą dotyczyć mechanizmu działania tych związków na określone ekspresje genów i białek związane z dojrzewaniem, transportem i akumulacją melaniny.

Cistanche poprawia wybielanie.

Proszę kliknąć na zdjęcie i uzyskać więcej informacji.