Zastosowania aptamerów w neurologii, część 1

Abstrakcyjny:

Choroby neurologiczne, będące główną przyczyną niepełnosprawności, cieszą się dużym zainteresowaniem światowej społeczności zdrowotnej.

Układ nerwowy jest ważną częścią ludzkiego ciała. Odpowiada za ludzką percepcję, myślenie, ruch, psychologię i emocje. Jednak niektórzy ludzie mogą mieć problemy neurologiczne, które wpływają na ich pamięć. Choroby układu nerwowego to zmiany patologiczne w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, takie jak udar, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera itp. Choroby te wpływają na pamięć, ale wszyscy możemy je pokonać aktywnymi metodami. Popraw to.

Pierwszym z nich jest udar. Według statystyk każdego roku udar mózgu dotyka miliony ludzi, a jednym z najczęstszych objawów jest utrata pamięci. Udar jest bardzo szkodliwy dla organizmu, ponieważ wpływa na części mózgu dostarczające tlen i krew. Udarom mózgu możemy jednak zapobiec, ćwicząc i zmieniając nawyki żywieniowe. Na przykład odpowiednie ćwiczenia, utrzymanie prawidłowej wagi i zdrowa dieta mogą skutecznie zmniejszyć ryzyko udaru, a tym samym zachować lepszą pamięć.

Następna jest choroba Parkinsona. Jest to choroba polegająca na zaburzeniach ruchu spowodowana śmiercią neuronów. Oprócz ruchu choroba Parkinsona może również wpływać na pamięć. Badania pokazują, że u większości pacjentów rozwijają się zaburzenia funkcji poznawczych, w tym utrata pamięci. Pacjenci mogą jednak podejmować różne działania opóźniające postęp choroby, takie jak regularne, profesjonalne leczenie i szkolenia rehabilitacyjne. Posiadanie zainteresowań, takich jak słuchanie muzyki, czytanie i uczenie się nowych umiejętności, może również być korzystne w relaksowaniu mózgu i pomaganiu w odzyskiwaniu pamięci.

Wreszcie jest choroba Alzheimera. Jest to choroba powodująca upośledzenie funkcji poznawczych, a utrata pamięci jest jednym z najbardziej oczywistych i powszechnych objawów. Jednak choroba Alzheimera jest również chorobą, którą można ustąpić. Badania pokazują, że ćwiczenia, zdrowa dieta, nauka nowych umiejętności i wolontariat mogą pomóc spowolnić postęp choroby i poprawić pamięć.

Zawsze powinniśmy zachować pozytywne nastawienie i stosować aktywne metody zapobiegania i leczenia chorób neurologicznych, aby poprawić naszą pamięć. Nawet jeśli jesteśmy dotknięci chorobą, możemy podjąć różne działania, aby poprawić naszą odporność i zdolność do walki z chorobą. Tak długo jak będziemy wytrwali, znajdziemy lepszą, zdrowszą ścieżkę zapobiegania i leczenia utraty pamięci. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola to tradycyjny chiński materiał leczniczy, który ma wiele unikalnych efektów, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność Cistanche Deserticola wynika z wielu zawartych w niej składników aktywnych, w tym kwasu garbnikowego, polisacharydów, glikozydów flawonoidowych itp. Składniki te mogą promować zdrowie mózgu na różne sposoby.

Kliknij Wiedz, aby poprawić pamięć krótkotrwałą

Ponad miliard ludzi cierpi na jedno z następujących zaburzeń neurologicznych: demencja, epilepsja, udar, migrena, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne, choroba Huntingtona, choroba prionowa lub guzy mózgu. W przypadku wielu z tych chorób możliwości diagnostyki i leczenia są ograniczone.

Aptamery, będące małymi i nieimmunogennymi cząsteczkami kwasu nukleinowego, które można łatwo modyfikować chemicznie, oferują potencjalne zastosowania diagnostyczne i teragnostyczne, aby sprostać tym potrzebom.

W niniejszym przeglądzie przedstawiono pionierskie badania nad zastosowaniem aptamerów, które są obiecujące dla przyszłej diagnostyki i leczenia zaburzeń neurologicznych, które stanowią coraz poważniejsze wyzwania zdrowotne na całym świecie.

Słowa kluczowe: aptamer; neurologia; choroby neurologiczne; zaburzenia neurologiczne; neurotoksyny; rak.

1. Wprowadzenie

Aptamery to jednoniciowe cząsteczki DNA, RNA lub syntetycznego XNA, które mogą składać się w unikalne trójwymiarowe (3D) struktury, dzięki którym wiążą cząsteczki docelowe z dużą specyficznością i powinowactwem [1,2].

Podejście do wyboru aptamerów zostało opracowane w 1990 roku przez trzy odrębne grupy [3–5]. Metoda ta jest obecnie znana jako Systematyczna Ewolucja Ligandów poprzez Wzbogacanie Wykładnicze (SELEX). Od tego czasu wiele aptamerów zostało wybranych do stosowania w obszarach nauk podstawowych, a coraz większa liczba aptamerów jest w fazie niedopracowania pod kątem zastosowań w terapii, diagnostyce i obrazowaniu [6–10].

Metoda SELEX symuluje ewolucję darwinowską in vitro. Obejmuje kilka rund selekcji i po każdej rundzie przeprowadzana jest wykładnicza amplifikacja „najsilniej przystosowanych” oligonukleotydów (oligo).

Jedna runda tradycyjnego SELEX obejmuje trzy etapy w kolejności: (1) inkubacja pożądanej cząsteczki docelowej z pulą oligo z centralnym regionem o losowej sekwencji o długości 20–60 nukleotydów, otoczonym końcowymi regionami o stałej sekwencji, które będą matrycami dla późniejszych reakcji łańcuchowych polimerazy (PCR). ), (2) wychwytuje w puli oligo, które skutecznie wiąże się z celem i (3) amplifikuje wychwycone oligo metodą PCR lub PCR z odwrotną transkrypcją (rt-PCR), w zależności od rodzaju oligo, odpowiednio DNA lub RNA.

Uwzględniono także rundy przeciwselekcji, podczas których pulę kwasów nukleinowych przepuszcza się przez pustą matrycę nośną, bez pożądanego celu, lub przez matrycę nośną z jedną lub większą liczbą innych cząsteczek, które mogą być strukturalnie spokrewnione z cząsteczką docelową.

W przypadku przeciwselekcji oligo, które nie wiąże się z matrycą nośną lub cząsteczkami pokrewnymi strukturalnie, są wychwytywane i kontynuowane w kolejnych rundach SELEX.

Kontrselekcję przeprowadza się w wielu celach, takich jak eliminacja oligo oddziałujących z (1) matrycą nośną, (2) analogami lub cząsteczkami strukturalnie powiązanymi z celem lub (3) cząsteczkami obecnymi w wysokich stężeniach w matrycy biologicznej (takimi jak surowica lub ekstrakt tkankowy), w którym będzie działał wybrany aptamer.

Głównym celem przeciwselekcji jest zwiększenie specyficzności aptameru dla pożądanego celu w porównaniu z innymi potencjalnymi konkurentami molekularnymi. Oprócz konwencjonalnego SELEX-u, popularny staje się niedawno opracowany SELEX z przełączaniem struktur [11–13].

W tym podejściu oligo muszą zmienić swoją strukturę podczas interakcji z celem, aby oddzielić się od komplementarnej sekwencji wychwytu. Zapewnia to zmianę struktury wybranych aptamerów po związaniu ligandu. Opracowano inne alternatywne metody SELEX, w tym CE-SELEX, Cell-SELEX i SELEX in vivo, jak podsumowano w Tabeli 1.

Całkiem możliwe jest łączenie różnych procedur SELEX w celu opracowania jeszcze bardziej złożonych technik. Po wybraniu aptamerów przez SELEX są one dalej modyfikowane w celu poprawy ich specyficzności i powinowactwa za pomocą kilku podejść, które w sumie można określić jako dojrzewanie.

Przy wyborze i dojrzewaniu aptamerów należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, na struktury aptamerów i interakcje aptamer-cel wpływa temperatura i składniki buforu, w tym jony, siła jonowa i pH.

Zatem jednym z najważniejszych punktów projektu SELEX jest naśladowanie środowiska (matrycy biologicznej lub składu soli/buforu) podczas selekcji, w którym zostanie znaleziony cel molekularny aptameru i nastąpi interakcja pomiędzy aptamerem a celem.

Dobór odpowiednich składów buforów i temperatur inkubacji zapewni optymalne działanie wybranych aptamerów w warunkach, w jakich będą stosowane [4,30–32].

Po drugie, może zaistnieć potrzeba poprawy stabilności aptamerów, ponieważ aptamery DNA i RNA są potencjalnymi celami ataków nukleazowych. Dzieje się tak zwłaszcza w przypadku RNA, ze względu na grupę 20OH, która jest wykorzystywana przez rybonukleazy w elektrofilowym ataku na fosforan szkieletu kwasu nukleinowego w celu hydrolizy.

Zatem RNA jest bardziej niewrażliwy na wysokie temperatury i pH niż DNA. Aptamery można dojrzewać poprzez chemiczne modyfikacje po selekcji mające na celu przezwyciężenie tej podatności. Jednakże takie modyfikacje mogą spowodować utratę specyficzności i/lub powinowactwa aptameru.

Dlatego zazwyczaj lepiej jest uwzględnić zmodyfikowane nukleotydy podczas SELEX. Wiele możliwych modyfikacji aptamerów wymieniono w tabeli 2.

Można wybrać aptamery, które selektywnie wiążą większość wirusów, komórek, bakterii, białek, toksyn i peptydów z wysokim powinowactwem [45–48]. Można je stosować wielokrotnie bez zauważalnego zakłócenia działania. Innymi słowy, można je oddzielić od celów w celu dalszego wykorzystania.

Natomiast przeciwciała można wykorzystać tylko kilka razy, zanim stracą funkcjonalność. Aptamery kwasów nukleinowych można również dojrzewać, aby były bardziej stabilne niż przeciwciała i enzymy, szczególnie w wyższych temperaturach [2].

Co więcej, gdy znana jest sekwencja aptameru, jego synteza chemiczna i oczyszczanie do jednorodności są wysoce powtarzalne i niedrogie. Te właściwości dają aptamerom potencjał do zastępowania przeciwciał jako składników jednostek czujnikowych [49].

Elastyczność struktur aptamerów i ich zdolność do „maskowania” regionów sekwencji aptameru komplementarnymi oligo zapewnia opcje sygnalizacji, które umożliwiają włączenie aptamerów do platform wielu czujników, które nie dają się łatwo przystosować do przeciwciał. Właściwości te motywują do opracowania biosensorów opartych na aptamerach [50–52].

Opracowywanie nowych narzędzi diagnostycznych to jeden z najważniejszych obszarów w dziedzinie biosensorów, a wielu badaczy stara się stworzyć łatwe, wydajne i tańsze metody umożliwiające wczesną diagnostykę i medycynę precyzyjną.

Włączanie aptamerów do biosensorów (zwanych „aptasensorami”) zakorzeniło się w latach 90. XX wieku.

Wczesnym przykładem aptamerów jako elementów biorozpoznawania jest biosensor optyczny, w którym w jednorodnym teście zastosowano znakowane fluorescencyjnie aptamery przeciwko ludzkiej elastazie neutrofilowej [53].

Od tego czasu opisano wiele typów konstrukcji aptasensorów, większość z aptamerami na stałych nośnikach oraz z sygnałami elektrochemicznymi, optycznymi, mechanicznymi i akustycznymi [45,54–56]. Niektóre przykłady omówiono w dalszej części tego artykułu.

Aptamery znalazły także zastosowanie w lecznictwie. Modyfikacje skutkujące wydłużeniem okresu półtrwania i poprawą farmakokinetyki sprawiają, że niektóre aptamery są dobrymi opcjami do zastosowań klinicznych. W porównaniu z przeciwciałami aptamery są znacznie mniej immunogenne, a ich działanie może być hamowane przez odwrotne komplementarne oligonukleotydy (Munzar i in., 2019).

Te ważne cechy zalecają rozwój aptamerów jako środków terapeutycznych. Macugen (sól sodowa pegaptanibu), który selektywnie rozpoznaje czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), był pierwszym aptamerem zatwierdzonym jako środek terapeutyczny (Tobin, 2006).

Od tego czasu kilka aptamerów osiągnęło różne etapy badań klinicznych, w których testuje się je pod kątem leczenia schorzeń, takich jak drobnokomórkowy rak płuc, choroba związana z czynnikiem von Willebranda, naczyniaki i raki nerkowokomórkowe [51,57–60].

Inne potencjalne zastosowanie terapeutyczne aptamerów obejmuje systemy dostarczania [61,62]. Aby osiągnąć skuteczne wyniki w tych systemach, aptamery powinny rozpoznawać białka powierzchniowe komórki w ich natywnych postaciach.

Cell-SELEX opracowano w celu selekcji białek powierzchniowych komórek, które często są trudne do oczyszczenia w ich natywnych postaciach [63]. Aptamer rozpoznający białko powierzchniowe komórki może dokooptować receptor w celu internalizacji ładunku przyłączonego do aptameru. Dzięki tej metodzie można wybrać aptamery do receptorów wyrażanych głównie na pojedynczym typie komórek, które mogą być celem in vivo [57].

Na przykład opracowano aptamery anty-PSMA (antygen błonowy specyficzny dla prostaty) do dostarczania siRNA do nowotworów u myszy lub hodowanych komórek [62,64–66].

W neurobiologii zastosowanie aptamerów było jak dotąd ograniczone, choć miały one bardzo szeroki zakres potencjalnych zastosowań. Donoszono, że aptamery stanowią możliwą opcję leczenia chorób neurodegeneracyjnych, które powodują utratę struktury i funkcji ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Parkinsona (PD), choroby Creutzfeldta-Jakoba, chorób neuronów ruchowych i choroby Huntingtona. choroba (HD) (ryc. 1). Obecnie około 50 milionów ludzi na świecie cierpi na demencję, w przypadku której globalne koszty opieki zdrowotnej wynoszą blisko bilion dolarów amerykańskich rocznie.

Czyni to demencje jednym z największych problemów medycznych i ekonomicznych naszego społeczeństwa [67]. Ponadto według Organizacji Narodów Zjednoczonych i Światowej Organizacji Zdrowia szacuje się, że do roku 2050 liczba ludności na świecie w wieku powyżej 65 lat podwoi się.

Dlatego też choroby neurodegeneracyjne zależne od wieku będą wymagały coraz większych nakładów na diagnostykę i leczenie [67].

Te krytyczne wymagania dotyczące metod ułatwiających wczesną diagnostykę i nowe zastosowania terapeutyczne można spełnić za pomocą aptamerów, które mogłyby również stanowić rozwiązania w przypadku niektórych podstawowych powikłań [68,69].

Aptamery są opracowywane do zastosowań w technologiach obrazowania mózgu (MRI, PET itp.), wizualizacji neuroprzekaźników, diagnostyce i leczeniu guzów mózgu i innych chorób związanych z mózgiem. W wielu z tych podejść aptamery są znakowane radioznacznikami, takimi jak fluor,-18 do obrazowania PET [70]. W tym przeglądzie omówimy osiągnięcia i wyzwania związane ze stosowaniem aptamerów w obrazowaniu mózgu i chorobach nerwowych.

2. Detekcja molekularna

2.1. Wykrywanie neurotoksyn
Neurotoksyny stanowią zróżnicowaną chemicznie grupę związków farmakologicznie czynnych. Wywierają wyraźne działanie biologiczne na układ nerwowy organizmów, różnią się jednak budową chemiczną i mechanizmami działania.

Zmieniają potencjały czynnościowe i zakłócają przekazywanie impulsów nerwowych. Aby właściwie ocenić ich ryzyko dla zdrowia ludzkiego i wpływu na środowisko, konieczne jest zastosowanie wystarczająco czułych technik umożliwiających ich dokładną identyfikację.

Do potwierdzenia obecności tych toksyn w wodzie i próbkach biologicznych wykorzystano aptamery kwasów nukleinowych z dużą czułością i selektywnością [71]. Donoszono o badaniach, które wykazały dokładną identyfikację neurotoksyn botulinowych (botulina A, E), saksytoksyny, brewotoksyny, parakwatu i tetrodotoksyny za pomocą aptasensorów.

Neurotoksyny botulinowe (BoNT) należą do najbardziej śmiercionośnych neurotoksyn i mogą potencjalnie zostać wykorzystane jako czynniki bioterrorystyczne. Aby zaspokoić kluczowe zapotrzebowanie na czuły, skuteczny system wykrywania BoNT w czasie rzeczywistym, zastosowano SELEX na bazie zolu-żelu w celu wyizolowania aptamerów DNA przeciwko neurotoksynie botulinowej typu E (BoNT-E) [47].

Po piątej rundzie sekwencje aptamerkandydatów analizowano metodą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i scharakteryzowano aptamery o wysokiej częstotliwości. W tych rodzinach aptamerów aptamerBT5.6 wykazywał wysokie powinowactwo, wynoszące 53 nM Kd, do BoNT-E i został unieruchomiony na platformie tlenku grafenu. Ten czujnik wykazywał granicę wykrywalności (LoD) 0,83 nM dla BoNT-E.

Brewotoksyny (BTX) i saksytoksyny to neurotoksyny morskie, które powodują neurologiczne zatrucie skorupiaków (NSP). BTX charakteryzują się wysoką toksycznością i szybkim początkiem NSP. Trudności techniczne związane z ich analizą skłoniły badaczy do poszukiwania alternatywnych, skutecznych i tanich metod wykrywania tych silnych neurotoksyn.

W tym celu opracowano elektrochemiczny aptasensor do wykrywania BTX-2, dla którego wybrane aptamery DNA scharakteryzowano za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) i fluorescencji.

Aptamer BT10 o powinowactwie 42 nM dla BTX-2 włączono do niewymagającego etykiet konkurencyjnego biosensora impedymetrycznego, który wykazał granicę wykrywalności 95 pM BTX-2.

Ten aptasensor był w stanie wykryć BTX-2 w wzbogaconym ekstrakcie ze skorupiaków z wiarygodną reakcją w obecności matrycy ze skorupiaków [72]. Jako druga klasa neurotoksyn morskich, saksytoksyna została scharakteryzowana ze względu na znaczenie dla zdrowia publicznego.

Ze względu na techniczne i etyczne problemy obecnie stosowanych systemów konieczne było opracowanie nowatorskich badań jako odpowiednich alternatyw. Aby sprostać tej potrzebie, opracowano niewymagający etykiet konkurencyjny aptasensor z interferometrią optyczną i biowarstwą. Bioczujnik ma granicę wykrywalności saksytoksyny wynoszącą 1,66 nM, charakteryzuje się wysokim stopniem selektywności i czułości, stabilnością oraz możliwością szybkiego wykrywania [73].

Podobnie jak toksyny morskie, neurotoksyny uwalniane po ukąszeniu węża należą do najpotężniejszych i najbardziej śmiercionośnych toksyn. Niestety konwencjonalna diagnostyka ukąszeń węży oparta na badaniach krzepnięcia krwi i objawach klinicznych nie pozwala na postawienie dokładnej diagnozy. Ponadto zależne od partii różnice w działaniu przeciwciał komplikują ich zastosowanie w diagnostyce.

Skrócona wersja aptameru -Tox-FL o wysokim powinowactwie, pierwotnie wybrana przeciwko bungarotoksynie Bungarus multicinctus (-Tox-T2) z wyższym powinowactwem (Kd=2.8 nM) niż macierzysty -Tox-FL (18 nM) zastosowano w formacie testu aptameru połączonego z enzymem.

W tej konfiguracji aptamer -Tox-T2 mógł wykryć toksynę -w zaledwie 2 ng surowego jadu, co wykazało jego potencjał w wykrywaniu jadu Bungarus caeruleus [74].

2.2. Wykrywanie neuroprzekaźników

Aby zbadać złożoność funkcjonalną mózgu, można zastosować monitorowanie aktywności neuroprzekaźników i szlaków sygnalizacyjnych. Neuroprzekaźniki są niezbędne do przekazywania informacji między komórkami i odgrywają kluczową rolę w zaburzeniach neurologicznych, takich jak padaczka, choroba Parkinsona (PD) i choroba Alzheimera (AD).

W kilku badaniach aptamery specyficzne dla dopaminy, epinefryny lub serotoniny wykorzystano do opracowania biosensorów na bazie aptamerów do wykrywania neuroprzekaźników in vivo i in vitro [75].

Neuroprzekaźnik katecholaminowy, dopamina (DA), reguluje pewne aspekty metabolizmu człowieka oraz funkcje układu sercowo-naczyniowego i nerek. Wykazano, że kilka chorób neurodegeneracyjnych, zwłaszcza PD, jest bezpośrednio skorelowanych z nieprawidłowym metabolizmem DA [76].

Dlatego opracowanie wysoce czułych i selektywnych bioczujników do oznaczania DA jest ważnym systemem biologicznym. Pierwszy aptamer RNA przeciwko DA, dopa2, wiązał DA z powinowactwem reprezentowanym przez Kd=2,8 nM [77].

Wykorzystując ten aptamer, pozbawiony znaczników elektrochemiczny aptasensor oparty na warstwie kompozytowej grafen-polianilina z powodzeniem wykrył obecność nieludzkiej surowicy DA, z LoD wynoszącym 1,98 pM [78]. W nowszym badaniu opracowano inny aptasensor DA składający się z aptameru DNA jako czujnika i kompozytu tlenku grafenu ze skóry karpia trawiastego (GCSC-GO) jako przetwornika.

Kompozyt przygotowano metodą ultradźwięków i scharakteryzowano za pomocą spektroskopii w podczerwieni (IR) i Ramana, mikroskopii sił atomowych i EIS. System ten obejmował unieruchomienie aptameru na kolagenie, a następnie różnicową woltamperometrię pulsacyjną.

Chociaż aptasensor wykazywał wyższą LoD wynoszącą0,75 nM w porównaniu z wcześniejszym czujnikiem o 2 pM, wykazywał wysoką selektywność dla związków nadmiernie spokrewnionych z DA i dokładnie mierzył DA w obecności 10% surowicy [79].

Do analizy różnych cząsteczek o swobodnej etykiecie, wysokiej czułości i selektywności niedawno zgłoszono czujnik z matrycą mikrowsporników z aptamerami. Czujnik składa się z układu 12 mikrowsporników zmodyfikowanych tiolowanymi aptamerami DA i wykorzystuje nanocząsteczki złota (AuNP) sprzężone z odcinkiem DNA komplementarnym do DAaptameru na powierzchni mikrowspornika.

Początkowo hybrydyzowane z aptamerem DA, koniugaty AuNP-DNA są uwalniane, gdy aptamer wiąże się z DA, co zwiększa naprężenie powierzchniowe układu około 15 razy i zwiększa ugięcie.

System ma odpowiedź liniową w zakresie od 0,5 do 4 µM DA z LoD 77 nM. Jego specyficzność wykazano dla 12 analogów strukturalnych i funkcjonalnych, w tym L-DOPA, z których żaden nie inicjował ugięcia [80].

For more information:1950477648nn@gmail.com