Ścieżki zależne od receptora węglowodorów arylowych i niezależne pośredniczą w efektach przeciwstarzeniowych kurkuminy, część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

2.2.6. Uprawa pierwotnej ludzkiej EC

Ludzkie pierwotne EC (Lonza, Kolonia, Niemcy) hodowano w pełnej pożywce śródbłonkowej (EBM) (Lonza, Kolonia, Niemcy) uzupełnionej 1 ug/ml hydrokortyzonu, 12 ug/ml ekstraktu z mózgu bydlęcego, 50ug/ ml gentamycyny, 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu i 10% (o/v) płodowej surowicy cielęcej w 37°C i 5% CO, do trzeciego pasażu. Po oderwaniu 0,05% (o/o)trypsyną/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy), komórki hodowano na 6 cm płytkach hodowlanych lub 6-studzienkowych płytkach hodowlanych przez co najmniej 18 godzin przed transfekcją lub traktowaniem.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

2.2.7. Przejściowa transfekcja EC

Komórki transfekowano jak opisano wcześniej [65]. W skrócie, EC transfekowano przy użyciu odczynnika SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Nadekspresję lub knockdown AhR osiągnięto odpowiednio po 24 lub 48 godzinach. Wydajność transfekcji po nadekspresji wynosiła około 40%.

2.2.8. Test ran zarysowania EC

W celu zbadania zdolności migracyjnej EC przeprowadzono testy ran zadrapanych, jak opisano wcześniej [66]. Szczegółowo, rany układano w monowarstwę komórek za pomocą skrobaka do komórek wzdłuż linii śladowej. Po urazie nieprzyczepione komórki usunięto przez delikatne przemycie.ekstrakt z salsy cistancheKurkumina została przeprowadzona bezpośrednio po założeniu rany. Kurkuminę rozpuszczono w DMSO i zastosowano w końcowym stężeniu 7,5 µM. Migrację EC określono ilościowo przez barwienie komórek 5 ug/ml 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy) w PBS przez 5 minut po utrwaleniu komórek z 4% (obj./obj.) paraformaldehydem przez 15 min w temperaturze pokojowej. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy)) przy powiększeniu 200-. Komórki migrujące do rany z linii śladowej zostały automatycznie zliczone przy użyciu funkcji analizy cząstek Image]1,52a]67I po rozdzieleniu nakładających się jąder.

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

2.2.9. Immunobarwienie EC

EC utrwalono 4% (o/v) paraformaldehydem przez 15 min w temperaturze pokojowej. Po permeabilizacji i zablokowaniu w 0.3% (o/o)Triton-X 100 i 3% (o/u)normalnej surowicy koziej w PBS, komórki inkubowano z króliczym przeciwciałem przeciwko AhR (1:100, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) lub Nrf2 (klon D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Niemcy) rozcieńczone w 1% (o/v)normalnej surowicy koziej w PBS przez noc w 4°C. Następnie komórki przemyto PBS i inkubowano z kozią antykróliczą IgG sprzężoną z Alexa 594- (1:500, Invitrogen, Darmstadt, Niemcy) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.łodyga cistancheDo barwienia aktyny komórki inkubowano z Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:7 0, Invitrogen, Darmstadt, Niemcy) przez 20 min w temperaturze pokojowej. Jądra wybarwiono kontrastowo 0,5 ug/ml DAPI w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a komórki umocowano za pomocą ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Niemcy). Obrazy fluorescencyjne wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AxioVision Observer D1, przy powiększeniu 400x lub 200x.

2.2.10. qPCR w komórkach

Całkowity komórkowy RNA wyizolowano przez połączenie lizy w TRIzolTM z dalszą obróbką przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Niemcy)) zgodnie z instrukcjami producenta. Syntezę cDNA przeprowadzono przy użyciu zestawu QuantiTect9 Reverse Transcription Kit Qiagen （Hilden, Niemcy）） z 1 ug RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Względne poziomy transkryptów określono metodą PCR, stosując 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix i termocykler Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden, Niemcy)). Jako odniesienie zastosowano transkrypt dla rybosomalnego białka L32 (rpl32), a względną ekspresję obliczono metodą AC [68]. Użyto następujących par starterów obejmujących Intron:kapitał (numer dostępu genu NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gen numer akcesyjny NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(numer akcesyjny genu NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(numer dostępu genu NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCCATCAGCAGCAC{{ 41}}”.

2.3.Myszy

2.3.1. Linie i hodowla myszy

Kobieta 8-12-tygodniowa („młoda”) i 18-miesięczna („stara”) B6 z niedoborem AHR.129-AHRtmlBra/J (Schmidt i in., 1996; odesłano tutaj jako AHR-KO) myszy były hodowane jako heterozygoty w zakładzie dla zwierząt IUF. Do kontroli wykorzystano zwierzęta z miotu typu dzikiego. Myszy hodowano i utrzymywano w warunkach wolnych od patogenów w cyklu 12/12 godzin światło-ciemność i otrzymywały standardową karmę (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Niemcy) ad libitum. 2.3.2.qPCR u myszy

Całkowity RNA wyizolowano z tkanek narządów trzech myszy WT i trzech myszy z niedoborem AHR za pomocą Trizol[. Następnie 400 ng RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) i losowych starterów heksamerowych. Poziomy ekspresji genów mierzono w dwóch powtórzeniach dla każdej tkanki myszy na Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Niemcy）, w końcowej objętości 15 µl, zawierającej 7,5 µl Rotor Gene SybrGreen™ （Biorad, Feldkirchen, Niemcy）, 1 uM każdego startera ,1,5 μL wody wolnej od cDNA i RNaz. Skuteczność starterów wynosiła od 90 do 146 procent. Sekwencje starterów i wydajności patrz Tabela S2. Poziomy ekspresji kalibrowano do ekspresji RPS6 jako genu przechowującego w tej samej próbce przy użyciu {{ 14}}metoda CT [69].

2.4. Analizy In Silico

Modelowanie homologii CeAhR LBD

Model strukturalny C. elegans AhR LBD (reszty 267-372) został wygenerowany przez modelowanie homologii. Struktury rentgenowskie domen PASB homologicznych członków rodziny bHLH-PAS o najwyższej identyczności sekwencji (około 20 procent) z CeAhR PASB wykorzystano jako matryce: okołodobowe cykle produkcji lokomotorycznej kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), białko 3 zawierające domenę neuronalną PAS (NPAS3, PDB:5SY7), czynniki indukowane niedotlenieniem 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) i lo(HIF10, PDB:4H6J). Model uzyskano za pomocą MODELLER[70-72].korzyści i skutki uboczne cistanche tubulosaOptymalny model został wybrany spośród 10 wygenerowanych na podstawie najlepszego DOPE SCORE [73]. Jakość modeli oceniano za pomocą PROCHECK [74]. Struktury drugorzędowe zostały przypisane przez DSSPcont [75]. Wnękę wiążącą w modelowanych LBD scharakteryzowano za pomocą serwera CASTp [76]. Wizualizacji modeli dokonano za pomocą PYMOL[77].

2.5.Analiza statystyczna

O ile nie zaznaczono inaczej, analizy statystyczne przeprowadzono w GraphPad Prism (wersja 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). W przypadku testów długości życia/zdrowia przeprowadzono analizę statystyczną przy użyciu OASIS[53]. Analiza statystyczna danych z mikromacierzy została przeprowadzona w R (R Foundation (Wiedeń, Austria)). Wykresy pudełkowe zostały utworzone w programie GraphPad Prism (wersja 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) i pokazują medianę (linia), 25-75th percentyl (prosto) i 10-90th percentyl (wąsy).

3. Wyniki

3.1. Kurkumina promuje zdrowie w sposób zależny i niezależny od AhR

Utrata ahr-1 sprzyja zdrowiu i długości życia C.elegans w warunkach podstawowych[14] i negatywnie wpływa na cechy związane z wiekiem w odpowiedzi na modulatory AhR ssaków, takie jak benzo[a]piren (BaP), UVB światło i mikrobiotę [25]. Polifenole dietetyczne, takie jak kurkumina, stanowią ważną grupę modulatorów AhR ssaków z efektem przedłużającym żywotność u C. elegans [78,79] i w ten sposób zbadaliśmy wpływ kurkuminy na wydłużanie życia dla jej ahr-1 zależność. Kurkumina w sposób powtarzalny i znacząco wydłużała długość życia i zdrowia C. elegans w sposób zależny od ahr-1- (ryc. 1A, B). Wcześniej wykazaliśmy, że utrata ahr-1 wydłuża również długość życia w modelach choroby Huntingtona i choroby Parkinsona, z nadekspresją w mięśniach, odpowiednio, poliglutaminy podatnej na agregację (poliQ40) i -synukleiny (-syn). zwiększając jednocześnie zawartość agregatów białkowych [25]. Co ciekawe, leczenie kurkuminą zwiększyło liczbę agregatów polyQ40 i -syn w takim samym stopniu jak utrata funkcji ahr-7 (Figura 1C). Kurkumina promowała również długość życia i zdolność lokomocyjną w tych modelach choroby (Rysunek 1DE), ale skutki utraty ahr-1 i suplementacji kurkuminą były addytywne w PolyQbackground (Rysunek 1D), ujawniając niezależne funkcje ochronne -1-AHR kurkuminy przynajmniej na tym skompromitowanym tle.

Rysunek 1. Kurkumina promuje zdrowie w sposób zależny i niezależny od AHR-1-. Krzywe długości życia (A) i długości życia (B) nicieni wt i ahr -1 leczonych DMSO lub kurkuminą. Krzywe przeżycia przedstawiają połączone dane dotyczące 290-300 robaków/stan z 5 eksperymentów. Test statystyczny: test log-rank, # istotność w porównaniu z DMSO,*istotność w porównaniu z wagą, wartość Bonferronip<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 pośredniczy w przeciwstarzeniowych efektach kurkuminy i wyczerpania ahr-1

W poszukiwaniu możliwych efektorów zależnych od ahr-1- kurkuminy podjęliśmy ukierunkowane i bezstronne podejście. Zbadaliśmy ekspresję klasycznych genów docelowych AhR ssaków i skupiliśmy się na genach Cyp, ponieważ kurkumina zmienia ekspresję CyplA1 i CyplB1 w komórkach ssaków [80,81]. Jednak oznaczenie ilościowe 47 różnych cyp w C.elegans metodą półilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ujawniło, że tylko cyp-13B1 był znacząco regulowany w górę albo przez ubytek ahr-1, albo przez kurkuminę w sposób zależny od ahr-1-(rysunek S1A-B), podczas gdy trzy inne cypy (tj. cyp-13A5, cyp-13A8 i cyp-42A1) były zwiększone przez kurkuminę tylko przy braku ahr-1(Rysunek S1). Dane te, wraz z innymi pracami [25, 82] sugerują, że cypy prawdopodobnie nie są głównym celem CeAhR. Potwierdza to również nasza analiza transkryptomiczna mutantów typu dzikiego i ahr-1. Rzeczywiście, zgodnie z rolą AHR-1 w określaniu neuronów [37,38,40,41], zmiany ekspresji genów między mutantami typu dzikiego i ahr-1 wykazały wzbogacenie w procesach związanych z rozwojem neuronów oraz różnicowanie i brak większych zmian w klasycznych genach detoksykacji (ryc. 2A). Analiza qPCR niektórych z najbardziej regulowanych w górę i w dół genów między ahr-1(jul45) i typu dzikiego (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3) głównie potwierdzili swoją zależność od ahr-1-w warunkach podstawowych (ryc. 2B), ale ani UVB [25], ani kurkumina (ryc. 2C) nie wpłynęły znacząco na ekspresję tych genów. Zastanawialiśmy się, czy zmiany ekspresji w tych genach są ewolucyjnie zachowane i ocenialiśmy ich ekspresję w różnych tkankach (tj. mózgu, wątrobie, jelitach i krwi) 8- i 18-miesięcznych typów dzikich i Myszy AhR KO. Niektóre geny wykazywały tendencję do zwiększonej ekspresji u młodych (homolog atf{-2) lub starych (homologów lpr{-4/5) w sposób specyficzny dla tkanki, ale ani oczywisty wzór, ani konserwowane zmiany nie były obserwowane (Rysunek S2). Wyniki te odzwierciedlają możliwe różnice specyficzne dla gatunku lub zależną od tkanki aktywność transkrypcyjną AhR u ssaków, przeoczoną w analizie transkryptomicznej całego zwierzęcia w C. elegans. Dokładne badanie najbardziej zróżnicowanej ekspresji genów między C. elegans typu dzikiego a ahr-1(jul45) ujawniło, że ekspresja wielu z tych genów jest zaburzona w C. elegans podczas starzenia i przez modulatory AhR ssaków w diecie ( np. kwercetyna i resweratrol)[25], co sugeruje rolę AHR-1 w ekspresji genów modulowanej polifenolami. Zgodnie z tym scenariuszem, dane z mikromacierzy pokazały, że większość genów ulegających różnicowej ekspresji podczas leczenia kurkuminą była rzeczywiście regulowana w sposób zależny od ahr-1- (Rysunek 2D; Tabela 1).ekstrakt z kanalików cistancheSpośród 47 genów zmienionych przez kurkuminę w typie dzikim (43 w górę i 4 w dół), tylko 5 było również indukowanych przez kurkuminę w ahr-1(ju145). Wśród genów regulowanych przez kurkuminę w sposób zależny od AHR-1-były enzymy fazy II i, co ciekawe, niektóre z nich (ugt-9 i ugt-29) były regulowane w tym samym kierunku przez kurkuminę lub przez utratę ahr-1 (Tabela 1). W związku z tym sprawdziliśmy ich ekspresję oraz dodatkowe ugts(ugt-45 i ugt-57), które były wyrażane w różny sposób przy zastosowaniu mniej restrykcyjnej analizy statystycznej nieskorygowanej dla wielokrotnych porównań. Spośród badanych genów ugt-45 był podwyższony w ahr-1(ijul45) i przez traktowanie kurkuminą (ryc. 3A, B). Zaobserwowaliśmy również zmiany w ekspresji niektórych genów detoksykacji między genami typu dzikiego i Myszy AhR KO w sposób zależny od tkanek. Zróżnicowana ekspresja tych genów była najwyższa w mózgu, gdzie poziom Ugt2a3 (ugt-9 i ugt-29 u C.elegans) był niższy, a Hpgds (gst-4 u C. elegans) został podwyższony (rysunek S3A). Nie było zmian w ekspresji żadnego z testowanych genów w próbkach wątroby myszy (Figura S3B). Zgodnie z danymi z C.elegans, mysi homolog Ugt3a2 ugt{-45 wykazywał tendencję do nadekspresji w jelita myszy Ahr KO (Figura S3C). Warto zauważyć, że ugt-45 RNAi zapobiegł korzystnemu wpływowi na życie i zdrowie, promowane przez kurkuminę (ryc. 3C, D) lub ubytek ahr-1 (ryc. 3E, F), co wskazuje, że te dwie interwencje mogą polegać na wspólnie modulowane przekazywanie sygnałów w dół, aby wywołać ich aktywność przeciwstarzeniową.

Rysunek 2. Geny różnie regulowane przez kurkuminę są przede wszystkim regulowane w sposób zależny od ahr. (B, C)Ekspresja najsilniejszych genów regulowanych w dół i w górę między wt i ahr-1 [25] została oceniona za pomocą qPCR w wt vs.ahr-1(B) i DMSO-vs . nicienie traktowane kurkuminą (C). Wykresy pudełkowe przedstawiają dane z 3 eksperymentów. Ekspresja jest pokazana w stosunku do wagi ciała traktowanego DMSO (linia przerywana). Test statystyczny:1-way ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya,*wartość p<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

Rysunek 3.ugt-45 jest wymagany do wydłużenia życia mutantów kurkuminy i ahr-1. (A, B) Ekspresję genów oceniano metodą qPCR w nicieniach wt vs. ahr-1(A) i DMSO- vs. kurkuminie (B). Wykresy pudełkowe przedstawiają dane z 3 eksperymentów. Ekspresja jest pokazana w stosunku do wt traktowanego DMSO (wskazane jako linia przerywana). Test statystyczny: 2-Way ANOVA z testem wielokrotnych porównań Sidaka, *wartość p<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 i kurkumina niezależnie chronią przed stresem oksydacyjnym

Korzystne właściwości polifenoli przypisuje się często ich zdolności do ochrony przed reaktywnymi formami tlenu (ROS)|83,84]. Ponieważ AhR bierze udział w procesach, w których pośredniczy stres oksydacyjny [85-87], zastanawialiśmy się, czy kurkumina może wpływać na fizjologię zwierząt poprzez odpowiedzi antyoksydacyjne regulowane przez AhR. Zaobserwowaliśmy, że mutanty ahr-1 produkują więcej mitochondrialnych(mt)ROS i mają obniżony potencjał błony mitochondrialnej (ryc. 4A, B), dwa parametry korelujące z długowiecznością [88,89]. Chociaż zgodnie z paradygmatem mitohormesis ahr-1(jul45) wytwarzają nieco więcej mtROS i żyją dłużej, zwierzęta te były bardziej wrażliwe na stres oksydacyjny niż typ dziki. W szczególności szkodliwy wpływ wywołany przez juglon i H2O2 na skoki, ruchliwość i przeżycie zwierząt był znacznie silniejszy w ahr -1(jul45) w porównaniu z typem dzikim (Figura 4C-F). Dane te sugerują, że wyczerpanie AHR-1 ma korzystny wpływ na motorykę w warunkach podstawowych, podczas gdy jego obecność jest wymagana do ochrony przed stresem oksydacyjnym, tym samym oddzielając dwa często korelujące ze sobą parametry związane z wiekiem, a mianowicie długość życia i odporność na stres. Zamiast tego kurkumina znacznie poprawiła odporność na H, O i juglon zarówno u mutantów typu dzikiego, jak i mutantów ahr-1 (Rysunek 4E, F), co sugeruje, że kurkumina wywołuje niezależną odpowiedź antyoksydacyjną ahr-1-. Zgodnie z niezwiązaną regulacją długości życia i odporności na stres oksydacyjny, wyciszenie ugt-45 nie wpłynęło na wrażliwość na stres oksydacyjny ani w przypadku mutantów ahr-1, ani zwierząt leczonych kurkuminą (Rysunek 4G).opinie o cistanche tubulosaTak więc kurkumina ma działanie przedłużające życie poprzez ahr-1 i ugt-45, ale chroni przed stresem oksydacyjnym poprzez mechanizmy niezależne od ahr-1-.

3.4. Nrf2/SKN-1 pośredniczy w niezależnych od AhR efektach kurkuminy

W celu dalszej oceny przesłuchu AhR-kurkuminy w dodatkowych cechach związanych z wiekiem, zmierzyliśmy zdolność migracji w pierwotnym EC człowieka – cecha charakterystyczna dla funkcjonalności naczyń, która zmniejsza się wraz z wiekiem [90] i jest redukowana przez aktywację AhR [14]. Zgodnie z działaniem przeciwstarzeniowym supresji ahr-1 i kurkuminy, nadekspresja AhR została znacznie zahamowana, podczas gdy kurkumina zwiększyła zdolność migracji pierwotnego ludzkiego EC (Figura 5A). Warto zauważyć, że indukcja zdolności do migracji przez kurkuminę była porównywalna w komórkach transfekowanych pustym wektorem lub wektorem ekspresyjnym AhR (Figura 5A). Jednak migracja komórek traktowanych kurkuminą została znacznie zmniejszona przez nadekspresję AhR: kurkumina indukuje w komórkach transfekowanych pustym wektorem do 60 migrujących komórek na pole wysokiej mocy, podczas gdy w komórkach z nadekspresją AhR tylko do 25 komórek na pole wysokiej mocy (rysunek 5A). Dane te sugerują, że promigracyjne działanie kurkuminy jest modulowane przez mechanizmy niezależne od AhR, ale prawdopodobnie również przez zmniejszenie aktywności AhR. Następnie określiliśmy wewnątrzkomórkową dystrybucję AhR i ekspresję cVplal w traktowanych kurkuminą ludzkich EC. Kurkumina nie wpływała na translokację jądrową AhR (Figura 5B) lub ekspresję cyplal (Figura 5C). W poszukiwaniu ścieżek modulowanych przez kurkuminę w sposób niezależny od AhR, wróciliśmy do profili transkryptomicznych nicieni, aby znaleźć czynniki transkrypcyjne regulujące geny istotnie modulowane przez utratę ahr-1 lub kurkuminę u zwierząt typu dzikiego (Tabela 1 ). To wyszukiwanie in silico zidentyfikowało czynnik transkrypcyjny redoks SKN-1, ortolog ludzkiego Nrf2 (czynnika związanego z czynnikiem jądrowym erytroid 2-czynnika 2), którego aktywacja przez kurkuminę [91] jest często opisywana jako możliwy mediator jego aktywność przeciwutleniająca [92,93]. W związku z tym prototypowy gen zależny od C.elegans Nrf2/SKN-1-, gst-4, jest nadeksprymowany w mutancie alhr-1 [25] i indukowany przez kurkuminę w typie dzikim, a nawet więcej w mutantach ahr-1 (Rysunek 5D). Ponadto kurkumina zwiększyła stabilizację i translokację jądrową Nrf2 w pierwotnym ludzkim EC (Rysunek 5E) i indukowała ekspresję dysmutazy ponadtlenkowej manganu (Sod2) — klasycznego genu docelowego Nrf2 — w komórkach transfekowanych pustym wektorem lub w komórkach, w których AhR jest wyciszany przez shRNA (Figura 5F). Brak indukcji Sod2 przez AhR shRNA w EC może wynikać z częściowej redukcji (50 procent) ekspresji (ryc. S3D), co może nie być wystarczające do wywołania aktywacji Nrf2 lub dodatkowego czynnika transkrypcyjnego (TF), który , u C.elegans, może zgadzać się z indukcją gst-4 [94]po całkowitym wyczerpaniu AhR. Co ciekawe, Hpgds, homolog C.elegans gst-4, był znacząco zwiększony w mózgu myszy AhR KO (Rysunek S3A), ale nie jest celem Nrf2. Kolejnym dowodem na możliwą niezależną sygnalizację Nrf2/SKN-1 aktywowaną przez wyczerpanie ahr-1 jest to, że aktywacja gst-4 przez kurkuminę jest całkowicie tłumiona przez -7 RNAi skóry w C.elegans typu dzikiego, podczas gdy mutanty ahr-1 nadal indukują gst-4 pomimo niedoboru skóry-1 (Rysunek 5G, H). Jednak RNAi -1 skóry zmniejszał odporność na stres oksydacyjny zarówno w przypadku typu dzikiego, jak i ahr-1(ju145)(Figura 5I). Nieoczekiwanie wyciszenie skóry -1 nie wpłynęło na odporność na juglon zwierząt leczonych kurkuminą (Figura 5I). Nasze dane ujawniają złożony scenariusz, w którym kurkumina promuje różne funkcje przeciwstarzeniowe, polegające na sygnalizacji zależnej od AhR lub niezależnej od AhR, ale zależnej od Nrf2/SKN-1- (i dodatkowej).

Rysunek 4. AHR-1 i kurkumina niezależnie chronią przed stresem oksydacyjnym. (A) Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja intensywności DSRed (po prawej) w barwionych MitoSOX nicieniach wt lub ahr-1. Wykresy pudełkowe przedstawiają połączone dane dotyczące 129-135 robaków/stanów w 3 eksperymentach. (B) Potencjał błony mitochondrialnej oceniano przez barwienie TRME u nicieni we wskazanym wieku. Przedstawiono reprezentatywne obrazy (po lewej) i ocenę ilościową fluorescencji TMRE (po prawej). Wykresy pudełkowe pokazują połączone dane z 3 eksperymentów. (C, D) Aktywność pompowania gardła (C) i ruchliwość (D) mutantów wt i ahr -1 po traktowaniu H2O2. Wykresy pudełkowe pokazują połączone dane z 39-54(C)lub ​​35-36 robaków/stanu (D)w 3-4eksperymentach.*wartość p<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Rycina 5. Kurkumina aktywuje Nrf2/SKN-1 niezależnie od testu rany zarysowanej AhR.(A) w ludzkich pierwotnych EC traktowanych kurkuminą (cur) lub DMSO transfekowanych pustym wektorem (EV) lub wektorem ekspresyjnym ludzkie AhR. Panel górny: zdjęcia reprezentatywne; linia przerywana reprezentuje początek migracji. Skala: 100 um. Dolny panel: kwantyfikacja; wykresy pudełkowe pokazują dane z 4-6eksperymentów.Test statystyczny:1-way ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Kurkumina i prooksydanty wykazują przeciwny wpływ na aktywność AHR-1

Zgodnie z działaniem przeciwstarzeniowym zmniejszonej ekspresji/aktywności AhRe, nasze dane sugerują, że kurkumina może wydłużyć życie C.elegans poprzez hamowanie-1-regulowanych szlaków AHR poprzez zmniejszenie ekspresji/aktywności AHR-1 lub działanie na wspólnych dalszych szlakach sygnałowych. Dlatego próbowaliśmy określić ilościowo aktywność AHR-1 u C.elegans, ale liczne próby oceny ekspresji AHR-1 i lokalizacji subkomórkowej przy użyciu przeciwciał (przeciwko ssaczym AhR lub dostosowanym przeciwciałom przeciwko CeAhR) lub znakowane fluorescencyjnie reporterzy (OP562, UL1709, ZG93) nie przedstawili znaczących dowodów. Biorąc pod uwagę, że AHR-1 wiąże się z XRE in vitro [35], pomyśleliśmy, aby wykorzystać ekspresję genu sterowaną przez XRE jako odczyt aktywności AHR-1. W związku z tym zwróciliśmy się do komórek Cos7 pochodzących od małpy, które nie wyrażają endogennego AhR, a zatem nie wykazują żadnej endogennej aktywności AhR [95,96] i mogą być wykorzystane do monitorowania indukcji lucyferazy kierowanej przez XRE jako odczyt dla AHR-1 aktywność (Larigot et al.; przedstawiony wraz z tym badaniem). Gdy komórki Cos7 kotransfekowano wektorami wyrażającymi C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 i sprzężony z lucyferazą promotor XRE ludzkiego genu CYPIA1 sprzężony z lucyferazą [64] AHR{ {27}} wykazywał niską aktywność w warunkach podstawowych (po traktowaniu nośnikiem). Warto zauważyć, że leczenie kurkuminą lub innymi nutraceutykami, które promują zdrowe starzenie się u C.elegans, takimi jak luteina [97] i resweratrol [98,99], znacząco hamowały aktywność AHR-1 (ryc. 6A-C). Zamiast tego BaP i leflunomid, znane aktywatory AhR u ssaków, nie wpływały na aktywność AHR-1 (Rysunek 6A, B) w stosowanych stężeniach. Warto zauważyć, że aktywność AHR-1 została zniesiona w komórkach Cos7 transfekowanych wektorem wyrażającym allel ahr-1(jul45) zamiast allelu typu dzikiego (Figura 6A-C), co sugeruje, że jul45 jest prawdziwym allel utraty funkcji i że mierzona intensywność lucyferazy jest spowodowana czynnościową AHR-1.

Następnie staraliśmy się zbadać, czy kurkumina zmniejsza aktywność AHR-1 poprzez bezpośrednie wiązanie lub pośrednią modulację. Do chwili obecnej nie zidentyfikowano żadnych ligandów C.elegans AHR-1, a ponieważ nie ma dostępnych informacji na temat jej LBD, przeprowadziliśmy analizę in silico, aby ją scharakteryzować. Dwie izoformy AHR-1, la i 1b, zostały dopasowane i chociaż mają różną długość, ich sekwencja domeny PASB jest identyczna. Sekwencja ta została następnie dopasowana do domeny PASB Drosophila melanogaster oraz do tych dwóch AhR od kręgowców, dla których wcześniej wygenerowano modele strukturalne, a mianowicie myszy (Mus musculus) [100] i danio pręgowanego (Danio rerio) [101] (Rysunek 6D). Dopasowanie wykazało wyraźne różnice między gatunkami, z główną osobliwością bezkręgowców odsłaniających sekwencje w najbardziej zmiennym regionie w domenie PAS, odpowiadającej elastycznemu regionowi, w tym wiązce helikalnej (helisy C , D , E) i krótkimi pętlami łączącymi te elementy (rysunek 6D,E). Te delecje mogą zmniejszyć dostępną przestrzeń we wnęce wiążącej tych AhR. Następnie wygenerowaliśmy model 3D AHR-1 PASB przez modelowanie homologii. Ten model przedstawia typową fałdę PAS, ale z krótszą helisą Do w porównaniu do innych AhR. Jednak wnęka wewnętrzna ma pewne osobliwości; zawiera więcej reszt hydrofobowych i jest skrócony do połowy przez niektóre wewnętrzne łańcuchy boczne. W szczególności H365 i H274 są licowane i mogą tworzyć wiązanie wodorowe w środku wnęki; ponadto łańcuchy boczne Y332, L363 i L302 mogą blokować wnękę, zmniejszając wewnętrzną przestrzeń dostępną dla ligandów (Rysunek 6E). Ta mała i ścięta jama najprawdopodobniej nie pozwala na wiązanie dużych ligandów (np. TCDD lub kurkuminy). Podobnie do modelu strukturalnego AHR-1, model danio pręgowanego zfAhRla wykazał, że jama LBD jest skrócona w porównaniu z paralogami wiążącymi TCDD zfAhR1b i zfAhR2 [101]. Małe i elastyczne ligandy, takie jak leflunomid, wiążą i aktywują zfAhRla, ale badane przez nas stężenie leflunomidu nie aktywowało AHR-1 w naszym układzie komórek Cos7 (Figura 6B). Następnie zastanawialiśmy się, czy mutacje w aminokwasach odpowiedzialnych za małą jamę LBD mogą umożliwić klasycznym ligandom aktywację CeAhR. Reszta CeAhR L363 (Figura 6D) odpowiada A375 w mAhRb-I i V375 w Madrycie, a reszta ta ma duży wpływ na wiązanie liganda [102]. Podobnie, T386 zfAhRla (Rysunek 6D), pasujący do A375 w mAHRb-1 i A386 w zfAhR1b i zfAhR2, przyczynia się do braku wiązania TCDD zfAhRla i, po zmutowaniu do alaniny, przywraca czułość TCDD, gdy Y296H również jest wprowadzony [101]. Aminokwas Y296 jest już histydyną w C.elegans(H274). Tak więc zmutowaliśmy tylko leucynę w pozycji L363 w wektorze CeAhR do alaniny (L363A) (Figura 6D, E wskazano strzałką). Co więcej, zmutowaliśmy pobliską histydynę w pozycji H365 do glutaminy (H365Q), która jest Q377 u myszy (Rysunek 6D, E wskazano strzałką), ponieważ prawdopodobnie tworzy wiązanie wodorowe z H274 i może przyczyniać się do małej wnęki AHR{ {49}} (rysunek 6E). Następnie zbadaliśmy, czy ssacze ligandy AhR wpływają na aktywność AHR-1, gdy L363 i H365 są zmutowane. Jednak te zmiany, zamiast przywracania odpowiedzi na ligandy ksenobiotyczne, jak u danio pręgowanego [101], znosiły nawet podstawową aktywność AHR-1, podobną do allelu ju145 (ryc. 6F). Wyniki te pokazują wyraźne różnice między LBD C. elegans i danio pręgowanego, ale pokazują, że LBD ma fundamentalne znaczenie dla podstawowej aktywności AHR-1. Wraz z wcześniejszymi badaniami [35,38,82], nasze wyniki sugerują, że AHR-1 prawdopodobnie nie bierze udziału w klasycznej odpowiedzi transaktywacyjnej indukowanej przez ksenobiotyki, co w związku z tym może nie mieć znaczenia dla regulowanej -1-ahr starzenie fizjologiczne. Zamiast tego, związki pochodzenia roślinnego mogą wywierać konserwatywne działanie przynajmniej częściowo poprzez tłumienie szlaków modulowanych AHR-1-. Nasz model 3D sugeruje, że kurkumina nie moduluje aktywności AHR-1 poprzez wiązanie jej LBD. Zatem hamowanie aktywności AHR-1 przez kurkuminę może wynikać z jej działania przeciwutleniającego. Zgodnie z tą możliwością i zwiększoną wrażliwością mutantów C.elegans ahr-1 na stres oksydacyjny, stwierdziliśmy, że aktywność AHR-1 jest rzeczywiście zwiększona przez czynniki indukujące ROS. Mianowicie, komórki Cos7 traktowane prooksydantem rotenonem wykazywały zwiększoną aktywność AhR po transfekcji C. elegans lub mysim AhR, ale nie po transfekcji allelem jul45 lub allelem z mutacjami LBD (Figura 6G, H).

Ogólnie rzecz biorąc, podczas gdy aktywacja CeAhR chroni przed stresem oksydacyjnym we wczesnym okresie życia, jego zmniejszona ekspresja przeciwdziała starzeniu się i pośredniczy w korzystnym działaniu przeciwstarzeniowym kurkuminy (ryc. 7). Kurkumina może zatem pomóc zrównoważyć aktywację redoks TF w sposób zależny od kontekstu i czasu i sprzyjać supresji AhR bezpośrednio poprzez jej działanie przeciwutleniające i/lub poprzez aktywację Nrf2/SKN-1 (lub innego TF), które mogą jednocześnie pośredniczą w przeciwstarzeniowej aktywności kurkuminy.

Rysunek 6. Kurkumina i prooksydanty mają przeciwny wpływ na aktywność AHR-1. (AC) Ocena aktywności AHR-1 po traktowaniu wskazanymi związkami w komórkach Cos7 transfekowanych albo wt AHR-1(wt) albo AHR-1 niosącymi mutację punktową ju145 (ju145) i AHA-1 jak również lucyferaza indukowana przez XRE. Wykresy pudełkowe pokazują dane z 3-5eksperymentów.* Wartość p<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Rysunek 7. Proponowany model szlaku sygnałowego AHR-1 w odpowiedzi C.elegan na pro- i przeciwutleniacze. W „normalnych” warunkach (panel środkowy), AHR-1 jest aktywowany przez wewnątrzkomórkowe ROS. Prowadzi to do zrzucania białek opiekuńczych z cytozolowej AHR-1 i późniejszej translokacji jądrowej AHR-1. W jądrze AHR-1 tworzy heterodimer z translokatorem jądrowym AHR (AHA{ {7}})i wiąże się z XRE docelowych genów, co z kolei prowadzi do zmniejszenia wewnątrzkomórkowych poziomów ROS. W tych warunkach utrata funkcji ahr-1 prowadzi do wydłużenia życia. W obecności przeciwutleniaczy (lewy panel) wewnątrzkomórkowe stężenia ROS są niskie, co prowadzi do AHR-1 rezydującego w cytoplazmie, związanym przez jej kofaktory. Hamowanie podstawowej aktywności AHR-1 prowadzi do wydłużenia życia. W obecności prooksydantów (prawy panel) AHR-1 jest aktywowany przez nadmiar ROS, co powoduje jego translokację jądrową, tworzenie heterodimeru AHR-1-AHA-1 i inicjację transkrypcja genu docelowego. W ahr-1 KO zmniejszona detoksykacja ROS przez geny docelowe indukowane przez AHR-1- prowadzi do akumulacji ROS i sprawia, że ​​ahr-1 KO jest podatny.

4. Dyskusja

AhR został pierwotnie odkryty u ssaków ze względu na jego aktywność odpowiedzi ksenobiotycznej indukowanej przez wiązanie toksyn środowiskowych lub endogennych ligandów, ale modulatory nie polegające na wiązaniu liganda również istnieją, ale są znacznie mniej zbadane. C.elegans stanowi unikalny organizm modelowy do badania aktywności AhR niezależnie od jego klasycznej odpowiedzi ksenobiotycznej, ponieważ CeAhR nie wiąże prototypowych ligandów AhR [35,39]. Korzystając z tego modelu, zidentyfikowaliśmy ewolucyjnie zachowaną funkcję AhR w procesie starzenia [14] i wykazaliśmy, że niektóre modulatory AhR ssaków (tj. bakterie, Bal i UVB) wpływają na parametry starzenia poprzez AHR-1 w sposób zależny od kontekstu [25]. Tutaj kontynuowaliśmy nasze poprzednie odkrycia, przeprowadzając bardziej mechanistyczne badanie cech starzenia regulowanych przez AhR u różnych gatunków przez kurkuminę polifenolową w diecie. Nasze połączone analizy in vivo, in vitro i in silico ujawniły nowy i złożony scenariusz: podczas gdy kurkumina promuje właściwości przeciwstarzeniowe u nicieni i pierwotnej EC człowieka przynajmniej częściowo w sposób zależny od AhR, jej działanie przeciwutleniające u obu gatunków opiera się na na mechanizmy niezależne od AhR, ale przede wszystkim zależne od Nrf2/SKN-1.

Po raz pierwszy wykazaliśmy, że kurkumina opóźniała fizjologiczne starzenie się C.elegans w sposób zależny od AHR-1-. W poszukiwaniu możliwych dalszych efektorów kurkuminy zależnych od -1-od ahr, zastosowaliśmy ukierunkowane i bezstronne podejścia i odkryliśmy, że większość różnie regulowanych genów po leczeniu kurkuminą jest regulowana w sposób zależny od AHR-1-. Co więcej, wiele z tych genów wykazywało podobny wzorzec ekspresji u zwierząt z niedoborem AHR-1- i leczonych kurkuminą, co sugeruje, że kurkumina sprzyja wydłużeniu życia poprzez tłumienie aktywności AHR-1. Co zaskakujące, ani analiza ukierunkowana, ani analiza transkryptomiczna nie wskazały na główną rolę klasycznych genów docelowych AhR, takich jak kubki, które zamiast tego okazały się w dużej mierze niewyrażone w neuronach (Larigot i wsp.; przedłożony wraz z tym badaniem). Co ciekawe, odkrycia te mogą wskazywać, że transkryptomika całych zwierząt może maskować specyficzne dla neuronów efekty AhR, w tym konkretnym przypadku poprzez geny cps. Odkryliśmy, że wśród genów o zróżnicowanej ekspresji wiele z nich należy do enzymów detoksykacji fazy II, takich jak jelito-45, które zostało zwiększone zarówno przez zmniejszenie ahr-1 (oraz w mózgu myszy AhR KO) i kurkumina, aby pośredniczyć w przedłużeniu ich życia. Zamiast tego leczenie kurkuminą i wyczerpanie ahr-1 zwiększyło ekspresję innego enzymu detoksykacji fazy II, GST-4, poprzez różne mechanizmy: pierwszy polega na, podczas gdy drugi jest głównie niezależny od Nrf2/ SKN-1, klasyczny TF redoks wywołujący GST-4 pod wpływem stresu oksydacyjnego u C.elegans [103]. Co więcej, podczas gdy kurkumina indukuje zależne od Nrf2/SKN-1- reakcje w C.elegans (ekspresja GST-4) i ludzkie pierwotne EC (ekspresja Sod2 i zdolność migracji), chroni również C.eleans przed stresem oksydacyjnym w SKN-1-niezależny sposób. U C.elegans kurkumina nie może przedłużyć życia w bardzo chorej skórze -1(zu67) mutanty [104], podczas gdy GST-4 może być indukowany w sposób niezależny od SKN-1- przez sygnalizację EGF [94] i crosstalk między szlakiem EGF i AhR odnotowano u ssaków [105].

Co ciekawe, w przeciwieństwie do szczepu typu dzikiego, zaobserwowaliśmy niezależny od AHR-1-wpływ kurkuminy na długość zdrowia w modelach nicieni odpowiednio dla choroby Huntingtona i Parkinsona. W tych szczepach leczenie kurkuminą zwiększyło liczbę agregatów białkowych w takim samym stopniu jak niedobór AHR-1, co wskazuje na działanie ochronne samej agregacji białka i/lub aktywację kurkuminy szlaków chroniących przed agregacją białka niezależnie od hr-1 wyczerpanie. Wpływ kurkuminy na agregację białek jest kontrowersyjny: wykazano, że hamuje ona tworzenie włókienek, ale także wiąże prefibrylarne/oligomeryczne gatunki białek amyloidogennych, tym samym przyspieszając ich agregację i zmniejszając ogólną neurotoksyczność [106]. Warto zauważyć, że kofeina, która również chroni przed cechami starzenia układu sercowo-naczyniowego [66, 107], zapobiega również porażeniu wywołanemu przez A bez zmniejszania agregatów A, ale poprzez aktywację ochronnego szlaku zależnego od Nrf2/SKN-1- [108]. Ważne będzie, aby ocenić, czy efekt ochronny wywołany przez kurkuminę lub całkowite wyczerpanie -1 w modelach choroby C. elegans jest pośredniczony przez mechanizmy promujące usuwanie gatunków oligomerycznych/prefibrylarnych do mniej toksycznych agregatów i/lub przez aktywacja innych mechanizmów, takich jak Nrf2/SKN-1, które mogą jednocześnie chronić przed proteotoksycznością. Warto zauważyć, że enzymy detoksykacyjne mogą zawierać zarówno XRE, jak i ARE (elementy reagujące na przeciwutleniacze), a opisano wzajemne oddziaływanie między sygnalizacją regulowaną Nrf2/ARE i AhR/XRE [109]. Interesujące będzie zatem wyjaśnienie, w jaki sposób kurkumina promuje swoje różne korzystne efekty przeciwstarzeniowe poprzez równowagę między sygnalizacją regulowaną przez Nrf2 i AhR.

Nasze połączone podejścia wykazały, że kurkumina hamuje aktywność AHR-1. Zasugerowano, że u ssaków hamujący wpływ kurkuminy na AhR jest pośredniczony przez bezpośrednie wiązanie LBD [110] lub hamowanie kinazy białkowej C, która fosforyluje AhR [79]. Inne badanie wykazało, że aktywność transkrypcyjna AhR zależy od komórkowego stanu redoks i struktury chromatyny, na które ma wpływ kurkumina [111]. Chociaż AHR-1 nie wiąże TCDD, wiąże XRE in vitro[36], ale brakuje systematycznych badań dotyczących potencjału węglowodorów poliaromatycznych lub innych ligandów AhR ssaków do modulowania AHR-1, głównie z powodu brak odpowiednich narzędzi do oceny tego. Nasze badania próbują wypełnić tę lukę i wykorzystać komórki Cos7 wyrażające AHR-1 w połączeniu z testami lucyferazy (Larigot i wsp.; przedłożone wraz z tym badaniem) oraz modelowanie in silico C. elegans LBD, ujawniło, że kurkumina hamuje AHR aktywność -1, ale prawdopodobnie nie przez bezpośrednie wiązanie LBD. Test in vitro zastosowany w naszym badaniu potwierdził, że CeAhR nie jest aktywowany przez klasyczne sygnalizowanie ksenobiotyków. Jednak nie ujawniłby aktywności związanych z wiązaniem AhR z sekwencjami DNA innymi niż „klasyczny” XRE występujący w CYP1A1, taki jak XRE reagujący na polifenole (kwercetynę) znaleziony w PON1 [112, 113]. Immunobarwienie w ludzkich pierwotnych EC również przemawia przeciwko indukującej kurkuminie translokację jądrową AhR, co wraz z działaniem promującym zdolność migracyjną w komórkach z nadekspresją AhR może również wskazywać, że kurkumina hamuje aktywność AhR.

Proponujemy, że hamujące działanie kurkuminy, zamiast polegać na wiązaniu AhR, obejmuje jej zdolność antyoksydacyjną, która rzeczywiście może być powiązana z aktywacją Nrf2/SKN, a nawet od niej zależeć-1. Ssacze AhR jest aktywowane przez ROS poprzez modyfikację oksydacyjną niezależną od LBD [85], ale nasze dane pokazują, że indukcja aktywności AHR-1 przez prooksydacyjny rotenon wymaga LBD. Pośrednim mechanizmem aktywacji AhR za pośrednictwem ROS jest tworzenie silnego ligandu AhR FICZ [114]. Jednak FICZ jest dużą płaską cząsteczką, która zgodnie z naszym modelem in silico nie pasowałaby do LBD AHR-1. Chociaż dokładny mechanizm, za pomocą którego aktywność AHR-1 jest promowana przez ROS i hamowana przez kurkuminę (albo poprzez bezpośrednie wygaszanie ROS lub pośrednio poprzez aktywację Nrf2 lub innych genów regulacyjnych przeciwutleniaczy), pozostaje do ustalenia, jest to silnie wspierane przez nasze wyniki: AHR-1 jest aktywowany przez rotenon, a mutanty ahr-1 wykazują więcej mtROS, zmniejszony potencjał błony mitochondrialnej i są bardziej wrażliwe na H, O i juglon, a także na UVB i BaP [25] , z których oba wytwarzają ROS[115,116]. W tym kontekście warto zauważyć, że mutanty ahr-1 wykazują łagodne zmiany funkcji mitochondrialnych, które przypominają mitohormezę [117. Sugeruje to, że całe -1 zubożenie (i ewentualna kurkumina poprzez hamowanie AHR-1) może promować zdrowie poprzez łagodny stres mitochondrialny, o którym wiadomo, że wydłuża życie C.elegan poprzez geny detoksykacji podobnie modulowane w innych { {20}} mutanty [118,119]. Co więcej, to, czy Nrf2/SKN-1 i mitochondria odgrywają rolę w modulowaniu aktywności AHR-1 podczas leczenia kurkuminą, jest interesującą możliwością, która pozostaje do zweryfikowania.

Ogólnie rzecz biorąc, korzystając z wielu cech oferowanych przez nicienie C.elegans do badań in vivo, sugerujemy, że pierwotna funkcja AhR może polegać na regulacji enzymów fazy II związanych z odpowiedziami antyoksydacyjnymi, a nie ksenobiotycznymi. W przeciwieństwie do szkodliwych skutków wywoływanych przez wysoki poziom ROS, korzystne efekty promowane przez niedobór AhR mogą być pośredniczone przez łagodny stres mitochondrialny i/lub łagodną produkcję ROS (mitohormesis), które również zależą od Nrf2/SKN-1. Dostarczamy również mocnych dowodów na interakcję między kurkuminą a AhR. Hamowanie przez kurkuminę sygnalizacji AhR jest ewolucyjnie konserwowane i prawdopodobnie nie pośredniczy w nim wiązanie z AhR LBD, ale raczej przez właściwości kurkuminy zmiatające ROS lub aktywację Nrf2/SKN-1. Ścieżka sygnalizacyjna Nrf2 może rzeczywiście być aktywowana przez kurkuminę na różne sposoby [91]. Wreszcie, nasze dane wykazały, że kurkumina promuje efekty przeciwstarzeniowe również w sposób niezależny zarówno w C.elegans (zwiększona ekspresja GST-4 i odporność na stres oksydacyjny), jak i pierwotnym EC (zwiększona ekspresja Sod2 i zdolność migracyjna) ), co może również wyjaśnić addytywne działanie kurkuminy i utratę funkcji AHR-1 na stan zdrowia zwierząt z ekspresją poliQ.

5. Wnioski

Podsumowując, poprzez oryginalną kombinację podejść in silico, vitro i in vivo, wykazaliśmy, że chociaż aktywacja CeAhR chroni przed stresem oksydacyjnym we wczesnym okresie życia, jego zmniejszona ekspresja przeciwdziała starzeniu się i pośredniczy w korzystnym działaniu przeciwstarzeniowym kurkuminy (Rysunek 7) . Kurkumina może zatem pomóc w zrównoważeniu aktywności różnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w detoksykację/odpowiedź antyoksydacyjną (tłumienie AhR i aktywację Nrf2) w warunkach, w których są one zmienione (wzrost AhR i spadek Nrf2/SKN-1), takich jak starzenie się lub zaburzenia związane z wiekiem. Nasza praca dodaje kolejny poziom złożoności do i tak już rozległych wielofunkcyjnych i specyficznych dla kontekstu działań AhR, z istotnymi konsekwencjami dla zdrowia organizmu i długości życia. Co więcej, otwiera drzwi do dodatkowych badań, wykorzystujących system nicieni do odkrywania i badania funkcji przodków AhR, których wykrycie u ssaków jest mniej prawdopodobne.

Ten artykuł pochodzi z Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants