Inhibitor ASK1 NQDI‑1 zmniejsza stres oksydacyjny i neuroapoptozę poprzez szlak sygnałowy ASK1/p38 i JNK we wczesnym uszkodzeniu mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym u szczurów – część 1

Abstrakcyjny. Stres oksydacyjny i neuroapoptoza to kluczowe procesy patologiczne po krwotoku podpajęczynówkowym (SAH). W niniejszym badaniu oceniono przeciwutleniające i antyapoptotyczne działanie neuroprotekcyjne inhibitora kinazy 1 regulującej sygnał apoptozy (ASK1), etylo-2,7-diokso-2,7-dihydro-3H-nafto(1,2, 3-de) karboksylan chinoliny (NQDI-1) we wczesnym uszkodzeniu mózgu (EBI) po SAH w modelu szczurzym. Wykorzystano ogółem 191 szczurów i indukowano model SAH przy użyciu perforacji monofilamentu. Następnie zastosowano technikę Western blotting do wykrycia endogennych poziomów ekspresji białek. Następnie zastosowano immunofluorescencję, aby potwierdzić lokalizację ASK1 w komórkach nerwowych. Krótkoterminową funkcję neurologiczną oceniano za pomocą zmodyfikowanej skali Garcii i testu równowagi wiązki 24 godziny po SAH, natomiast długoterminową funkcję neurologiczną oceniano za pomocą testu rotarod i testu labiryntu wodnego Morrisa. Apoptozę neuronów oceniano za pomocą barwienia TUNEL, a stres oksydacyjny oceniano za pomocą barwienia dihydroetydyną 24 godziny po SAH. Poziomy ekspresji białek ufosforylowanych (p-)ASK1 i ASK1 wzrosły po SAH. NQDI‑1 wstrzyknięto do komory mózgowej 1 godzinę po SAH i wykazano znaczną poprawę zarówno krótko-, jak i długoterminowej funkcji neurologicznej oraz znacznie zmniejszono stres oksydacyjny i apoptozę neuronów. Wstrzyknięcie NQDI‑1 spowodowało znaczny spadek poziomu ekspresji białek p‑ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4-hydroksynonenalu i Bax oraz znacząco zwiększyło poziom ekspresji białek oksygenazy hemowej 1 i Bcl‑2. Zastosowanie inhibitora p38 BMS-582949 lub inhibitora JNK SP600125 doprowadziło do znacznego zmniejszenia poziomu ekspresji białka odpowiednio p-p38 lub p-JNK oraz znacznego zmniejszenia stresu oksydacyjnego i apoptozy neuronów; jednakże inhibitory te nie wykazały wpływu na poziomy ekspresji białka p-ASK1 lub ASK1. Podsumowując, leczenie NQDI-1 poprawiło funkcje neurologiczne i zmniejszyło stres oksydacyjny i apoptozę neuronów w EBI po SAH u szczurów, prawdopodobnie poprzez hamowanie fosforylacji ASK1 i szlaku sygnałowego ASK1 / p38 i JNK. NQDI-1 można uznać za potencjalny środek do leczenia pacjentów z SAH.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniem DNA spowodowanym przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silne zdolności wymiatania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA oraz mają pewien wpływ ochronny na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i może wychwytywać reaktywne formy tlenu, zapobiegać degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ na naprawę uszkodzeń anionów wolnych rodników tyminy.

Kliknij Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Słowa kluczowe: krwotok podpajęczynówkowy, NQDI-1, kinaza regulująca sygnał apoptozy 1, stres oksydacyjny, apoptoza, wczesne uszkodzenie mózgu

Wstęp

Krwotok podpajęczynówkowy (SAH) jest poważną, ostrą chorobą naczyniowo-mózgową spowodowaną napływem krwi do przestrzeni podpajęczynówkowej mózgu (1). Jednak obecnie nie ma dostępnych skutecznych leków poprawiających uszkodzenie tkanki mózgowej po SAH po zapobieganiu nawrotom krwawienia (2). Dlatego pilnie potrzebne są dalsze badania nad mechanizmami uszkodzenia mózgu po SAH i poszukiwanie odpowiednich opcji leczenia w celu poprawy rokowania w SAH.

Wczesne uszkodzenie mózgu (EBI) odnosi się do wtórnego uszkodzenia tkanki mózgowej spowodowanego wieloma zaburzeniami fizjologicznymi i szeregiem zmian patologicznych, które pojawiają się w ciągu 72 godzin od wystąpienia SAH (3). W fazie ostrej odpowiedzi po SAH uraz rozpoczyna się od wniknięcia dużej ilości krwi do przestrzeni podpajęczynówkowej, po czym następuje seria urazów patologicznych (4). Ponieważ mitochondria są szczególnie podatne na niedotlenienie i uszkodzenie niedokrwienne, dysfunkcja mitochondriów jest jednym z głównych uszkodzeń patologicznych po SAH (5). Uwalniane są duże ilości reaktywnych form tlenu (ROS), co prowadzi do nasilenia stresu oksydacyjnego i aktywacji mitochondrialnego szlaku apoptozy, powodując uszkodzenie i dysfunkcję mitochondriów (6). Dlatego metody terapeutyczne zmniejszające stres oksydacyjny i apoptozę są kluczowe dla poprawy rokowania SAH.

Kinaza regulująca sygnał apoptozy 1 (ASK1), członek rodziny kinaz białkowych aktywowanych mitogenem 3 (MAP3K), jest aktywowana przez wiele różnych rodzajów stresu komórkowego i odgrywa ważną rolę w stresie oksydacyjnym i apoptozie (7). W pierwotnych hodowlach mysich neuronów hipokampa inhibitor kinazy Rho, fasudil, odwraca indukowany przez amyloid wzrost fosforylowanego (p-)ASK1, co zmniejsza apoptozę neuronów w chorobie Alzheimera (8). Jednak zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, opcje terapeutyczne ukierunkowane na ASK1 po SAH nie zostały ocenione.

Zgłoszono, że swoistym inhibitorem ASK1 i została potwierdzona przy użyciu testów kinazy in vitro (9,10). Wcześniejsze badania wykazały, że NQDI-1 może być skuteczny w leczeniu wielu chorób poprzez hamowanie aktywności ASK1 (11,12). NQDI-1 łagodzi uszkodzenia mitochondriów i apoptozę wywołane przez mikrocystynę-LR i apoptozę w komórkach ziarnistych jajnika poprzez hamowanie aktywacji ASK1 (13). Ponadto indometacyna może indukować odpowiedzi kaskady apoptotycznej w komórkach glejowych poprzez aktywację ASK1 stresu retikulum endoplazmatycznego (14). Dlatego swoisty dla ASK1 inhibitor NQDI‑1 może wywierać działanie neuroprotekcyjne po SAH poprzez hamowanie aktywności ASK1. uważa się, że p38 i JNK tworzą dalsze szlaki sygnałowe ASK1; aktywowane p38 i JNK mogą dodatkowo aktywować różne substraty, w tym jądrowe czynniki transkrypcyjne, jak również kinazy białkowe i inne funkcjonalne białka, co prowadzi do początku stresu oksydacyjnego i apoptozy (15).

Postawiono hipotezę, że inhibitor ASK1 NQDI-1 wywiera działanie neuroprotekcyjne i zmniejsza stres oksydacyjny i neuroapoptozę poprzez szlak sygnałowy ASK1/p38 i JNK w EBI po SAH u szczurów.

Materiały i metody

Zwierzęta doświadczalne.Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Doświadczalnych Central South University (zgoda nr 2019sydw0104). W sumie 191 samców szczurów Sprague-Dawley (SD) o wadze 280-320 g trzymano w środowisku o stałej temperaturze (21-23˚C) i wilgotności (45-50 procent) z cyklem 12/12-h światło/ciemność i miał swobodny dostęp do wody i pożywienia. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (16) oraz zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Animals (17). Kiedy szczury osiągnęły wyznaczony punkt czasowy eksperymentu lub spełniły określone kryteria eutanazji [całkowita utrata apetytu na 24 godziny lub słaby apetyt (50 procent poniżej normy) przez 3 dni, niezdolność do jedzenia lub picia, lub zostały ocenione jako bliskie śmierci (samookaleczanie, nieprawidłowa postawa, niewydolność oddechowa itp.)], szczury umieszczano w urządzeniu do eutanazji dwutlenku węgla z szybkością wypierania objętościowego CO2 ustawioną na 30 procent / min (18). Śmierć potwierdzono zatrzymaniem oddechu i bicia serca oraz rozszerzeniem źrenic. Zwłoki wszystkich szczurów zostały zapakowane i zamrożone w celu utylizacji przyjaznej dla środowiska.

Model SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 na podstawie oceny punktacji SAH uznano za spełniające wymagania eksperymentalne i za udany model. Procedura dla grupy pozorowanej była podobna do tej dla grupy SAH, z wyjątkiem tego, że prolina 4‑0 nie przebiła ściany tętnicy. Oddech, częstość akcji serca, kolor skóry i odruch pedałowania monitorowano co 5 minut podczas etapów rekonwalescencji chirurgicznej i anestezjologicznej. Spośród nich 23 szczury zmarły, a 8 szczurów zostało wykluczonych, a te zgony i wykluczenia zostały uzupełnione przez nowe szczury modelowane na SAH.

Ciężkość SAH.Nasilenie SAH oceniano za pomocą skali oceny SAH 24 godziny po SAH (20). Brzuszną stronę tkanki mózgowej podzielono na 6 obszarów, z których każdy oceniono na 0-3 w zależności od ilości skrzepu krwi i stopnia zaciemnienia naczyń krwionośnych: Wynik 0 wskazuje na brak skrzepu, 1 oznacza niewielką ilość skrzepu, 2 oznacza umiarkowaną ilość skrzepu, ale nadal można zidentyfikować duże naczynia u podstawy czaszki, a 3 wskazuje dużą ilość skrzepu i niezidentyfikowane naczynia u podstawy czaszki. Sześć regionalnych wyników zsumowano, aby obliczyć całkowity wynik (0-18), gdzie wyższe wyniki wskazywały na cięższy krwotok. Uznano, że szczury z całkowitym wynikiem oceny SAH mniejszym niż lub równym 8 mają łagodne SAH, wykluczono je z kolejnych eksperymentów i zastąpiono nowo wymodelowanymi szczurami.

Podawanie leków.Aby umożliwić dokładniejszą regulację stężenia leku w tkance mózgowej niezależnie od wątroby i innych czynników, siRNA i NQDI‑1 podawano przez wstrzyknięcie dokomorowe mózgu (21). Po znieczuleniu (indukcja, 3% izofluranu; podtrzymanie, 2% izofluranu), szczury umieszczono w aparacie stereotaktycznym mózgu. Mikrowtryskiwacz przymocowano do bregma na głębokości 1,0 z tyłu, 1,5 z prawej strony i na głębokość 3,3 mm. SiRNA ASK1 (nr kat. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) lub kontrola siRNA Scr (nr kat. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) rozpuszczono w 5 µl sterylnej dejonizowanej wody wolnej od nukleaz w stężeniu 500 pmol i podano 48 godzin przed SAH. Sekwencje siRNA ASK1 były następujące: sensowna 5'-CGG CAGACAUUGUUAUCAATt-3' i antysensowna 5'-UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc-3'. Stężenia i dawki leku podane w podobnym badaniu (22) oraz rozpuszczalność NQDI-1 zostały wykorzystane do określenia stężeń zastosowanych w niniejszym badaniu. Trzy dawki NQDI‑1 (1, 3 i 10 µg/kg; Selleck Chemicals) lub roztwór nośnika w całkowitej objętości 5 µl/szczura wstrzyknięto 1 godzinę po SAH. BMS-582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals) i roztwory podłoża mogły przekraczać barierę krew-mózg i były podawane dootrzewnowo 1 godzinę po SAH (23,24).

Krótkoterminowa funkcja neurologiczna.Do oceny krótkoterminowej funkcji neurologicznej 24 godziny po SAH wykorzystano zmodyfikowaną skalę Garcii i skalę równowagi wiązki. Zmodyfikowany wynik Garcii podzielono na sześć następujących kategorii: dobrowolny ruch, dobrowolny ruch kończyn, wyprost przedniej łapy, zdolność wspinania się, reakcje somatosensoryczne i reakcja macek, z których każda była oceniana indywidualnie i sumowana, aby uzyskać całkowity wynik w zakresie od 3-18 (25). Wyższe wyniki uznano za wskazujące na lepszą funkcję neurologiczną. W celu oceny równowagi belki szczury umieszczono na belce na 1 minutę i oceniono wynik w zakresie 0-4 na podstawie przebytej odległości (26). Wyższe wyniki uznano za wskazujące na lepszą funkcję neurologiczną.

Długoterminowa funkcja neurologiczna.Eksperymenty z preadaptacją Rotarod przeprowadzono na szczurach przy użyciu tej samej początkowej prędkości i przyspieszenia przed modelowaniem SAH. Szczury umieszczono na testerze z obrotowym prętem Rotamex (Columbus Instruments) do testu Rotarod w dniach 7, 14 i 21 po SAH (27). Najpierw początkową prędkość Rotarod ustawiono na 5 obrotów na minutę, a przyspieszenie na 2 obroty na 5 sek. Po założeniu szczurów rejestrowano opóźnienie upadku szczurów. Następnie szczurom pozwolono odpocząć przez 1 godzinę. Na koniec ponownie przetestowano opóźnienie upadku szczurów przy początkowej prędkości 5 obrotów na minutę i przyspieszeniu 2 obrotów na 5 sekund. Uznano, że dłuższe opóźnienie upadku wskazuje na lepszą koordynację ruchową u szczurów. W 4 tygodniu po modelowaniu SAH zastosowano test labiryntu wodnego Morrisa do oceny pamięci uczenia się i orientacji przestrzennej szczurów (27). Ćwiczenie nauki pływania i znajdowania platformy znajdującej się pod powierzchnią wody wykonywano od dnia 1 do dnia 5 w 4 tygodniu (dni 28‑33 po SAH) i rejestrowano trajektorię pływania, opóźnienie ucieczki i odległość pływania. Ostatniego dnia platformę usunięto do testów i przez 60 sekund rejestrowano trajektorię pływania, odległość pływania i czas trwania kwadrantu sondy.

Barwienie IF.Po sekwencyjnej perfuzji 4°C soli fizjologicznej i 4°C, 4% paraformaldehydu z serca w celu usunięcia krwi z tkanki mózgowej, uzyskano nienaruszoną tkankę mózgową. Po odwodnieniu w gradiencie sacharozy tkankę mózgową pocięto na 10-µm skrawki w pozycji czołowej i przechowywano w temperaturze -20˚C. Barwienie IF zastosowano do oceny kolokalizacji ASK1 z komórkami nerwowymi. Zamrożone skrawki tkanek blokowano przy użyciu 5% oślej surowicy (nr kat. G1217-5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w 4˚C z przeciwciałami pierwotnymi w następujący sposób: Anty-ASK1 (mysz; 1:200; nr kat. 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), anty-NeuN (królik; 1:200; nr kat. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , antyjonizowana cząsteczka adaptorowa wiążąca wapń-1 (Iba-1; królik; 1:200; nr kat. 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) i kwaśne białko fibrylarne przeciwglejowe (GFAP; kurczak ; 1:200; nr kat. ab4674; Abcam). Następnie skrawki tkanek inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z odpowiednimi drugorzędowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi w następujący sposób: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H plus L) (nr kat. 715-585-150; 1:500 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) (nr kat. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) i Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H plus L) (nr kat. 703-545-155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Następnie barwiono je pod kątem jąder komórkowych przy użyciu 2 µg/ml DAPI (nr kat. G1012‑100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki oceniano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX53 (Olympus Corporation) i rejestrowano obrazy.

Barwienie dihydroetydyną (DHE).Barwienie DHE przeprowadzono w celu oceny stresu oksydacyjnego mózgu (28). Zamrożone skrawki tkanki mózgowej inkubowano z 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) w temperaturze 37°C przez 30 minut w ciemności. Po wybarwieniu jąder komórkowych przy użyciu 2 ug/ml DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej skrawki oceniano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX53. Łącznie wybrano losowo sześć skrawków z każdej tkanki mózgowej i sześć obszarów w każdym skrawku losowo wybrano do obrazowania. Liczbę komórek DHE-dodatnich zliczono za pomocą oprogramowania ImageJ 1.4 (National Institutes of Health), a średnią obliczono i przyjęto jako ostateczne wartości procentowe dla każdego skrawka tkanki mózgowej.

Barwienie metodą TUNEL.Barwienie TUNEL zastosowano do oceny odsetka neuronów apoptotycznych (29). Zamrożone skrawki tkanek blokowano przy użyciu 5% oślej surowicy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w 4˚C z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-NeuN (króliczym; 1:200; nr kat. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc. .). Skrawki tkanek następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem fluorescencyjnym Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) (nr kat. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Barwienie TUNEL przeprowadzono stosując zestaw One Step TUNEL Apoptosis Assay (nr kat. C1090; Beyotime Institute of Biotechnology) zgodnie z protokołem producenta. Na koniec skrawki tkanek barwiono pod kątem jąder komórkowych przy użyciu 2 µg/ml DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Losowy wybór lokalizacji zliczania TUNEL i obliczenie neuronów TUNEL-dodatnich dla każdej sekcji przeprowadzono przy użyciu wyżej wymienionej metody zliczania DHE.

Western blotting (WB).WB zastosowano do półilościowego określenia poziomów ekspresji białek. Po perfuzji serca solą fizjologiczną o temperaturze 4°C w celu usunięcia krwi z tkanki mózgowej uzyskano nienaruszoną tkankę mózgową. We wcześniejszych badaniach wykazano, że model SAH, wywołany przez nakłucie wewnątrznaczyniowe po lewej stronie, powoduje pewien stopień odchylenia w kierunku krwawień i może być stosunkowo poważny pod względem uszkodzenia lewej tkanki mózgowej (30). Dlatego do oceny patologicznego uszkodzenia po modelowaniu SAH wykorzystano tkankę mózgową po lewej stronie. Białka tkanki mózgowej ekstrahowano stosując roztwór do lizy RIPA (nr kat. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) zgodnie z protokołem producenta. Stężenie białka w próbkach określono za pomocą testu BCA (nr kat. P0012; Beyotime Institute of Biotechnology), a następnie doprowadzono do 5 µg/µl dodając różne ilości wody podwójnie destylowanej. 5 µl 5 µg/µl próbek białka dodano do każdej ścieżki i te próbki białek rozdzielono na 10 procentowych żelach za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i przeniesiono na membrany PVDF. Membrany blokowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy użyciu 5% odtłuszczonego mleka w proszku (nr kat. P0216‑300g; Beyotime Institute of Biotechnology). Błony inkubowano przez noc w temperaturze 4˚C z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: Anti‑p‑ASK1 (Ser‑83; 1:1, 000; nr kat. MA5‑28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), anty‑ASK1 (1:1,000; nr kat. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anty‑p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000; nr kat. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anty‑p38 MAPK (1:1,000; nr kat. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), kinaza białkowa aktywowana anty‑fosfo‑stresem/kinaza końcowa Jun‑amino (fosfo‑SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; nr kat. 9255; Cell Signaling Technology, Inc.), anty-SAPK/JNK (JNK; 1:1,{44}}; nr kat. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anty-4-hydroksynonenal (4-HNE; 1:1 ,000; nr kat. ab46545; Abcam), anty-hemowa oksygenaza 1 (HO-1; 1:1, 000; nr kat. 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anty-Bcl-2 (1:1,000; nr kat. 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), anty-Bax (1,1000; nr kat. 60267‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) i anty‑‑aktyna (1:2,000; nr kat. 4970; Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.). Następnie inkubowano z odpowiednimi drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową przez 2 godziny w temperaturze pokojowej: Kozie anty-mysie IgG-HRP (nr kat. sc-2005; 1:5,{80}}; Santa Cruz Biotechnology , Inc.) lub koziej anty-króliczej IgG-HRP (nr kat. sc-2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), a specyficzne prążki wizualizowano za pomocą zestawu ECL (nr kat. P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) i zobrazowano przy użyciu systemu UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). Względną analizę densytometryczną prążków WB przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ 1.4 (NIH), a poziomy ekspresji białka znormalizowano względem -aktyny.

Eksperymentalny projekt

Zmiany ekspresji i lokalizacja komórkowa ASK1 po SAH. Łącznie 36 szczurów przydzielono losowo do sześciu grup (n{2}}/grupę) w następujący sposób: i) Operacja pozorowana (pozorowana), ii) 3 godziny po SAH, iii) 6 godzin po SAH, iv ) 12 godzin po SAH, v) 24 godziny po SAH i vi) 72 godziny po SAH. WB zastosowano do oceny zmian w poziomach ekspresji białek endogennych ASK1 i p-ASK1. W sumie 4 dodatkowe szczury podzielono na grupy pozorowane (n{11}}) i SAH 24 h (n{13}}), a barwienie IF zastosowano do oceny kolokalizacji ASK1.

Efekty terapeutyczne inhibitora ASK1 NQDI-1 na krótko- i długoterminowe funkcje neurologiczne po SAH. W sumie 30 szczurów podzielono na 5 grup (n=6/grupę) w następujący sposób: i) pozorowana, ii) SAH plus nośnik, iii) SAH plus 1,0 µg /kg NQDI‑1, iv) SAH plus 3,0 µg/kg NQDI‑1 i v) SAH plus 10,0 µg/kg NQDI‑1. Do oceny krótkoterminowej funkcji neurologicznej 24 godziny po SAH wykorzystano zmodyfikowaną skalę Garcii i równowagę wiązki. W oparciu o zakres krótkoterminowej poprawy neurologicznej, 3,0 µg/kg NQDI‑1 uznano za najbardziej odpowiednią grupę dawkowania i tę dawkę NQDI‑1 zastosowano w kolejnych eksperymentach. W sumie 30 szczurów podzielono na 3 grupy (n{21}}) w następujący sposób: i) pozorowana, ii) SAH plus nośnik i iii) SAH plus NQDI-1. Do oceny długotrwałej funkcji neurologicznej w dniach 7, 14 i 21 po SAH zastosowano rotarod, aw 4. tygodniu po SAH przeprowadzono test labiryntu wodnego Morrisa w celu oceny długoterminowej funkcji neurologicznej.

Efekty terapeutyczne inhibitora ASK1 NQDI-1 na stres oksydacyjny i apoptozę. Łącznie 12 szczurów podzielono na 3 grupy (n{4}}/grupę) w następujący sposób: i) pozorowana, ii) SAH plus nośnik i iii) SAH plus NQDI-1. Barwienie (THE) przeprowadzono w celu oceny stresu oksydacyjnego, a barwienie TUNEL zastosowano do oceny apoptozy neuronów 24 godziny po SAH.

Rola szlaku sygnałowego ASK1/p38 i JNK w efektach terapeutycznych NQDI-1. Łącznie 48 szczurów podzielono na 8 grup (n{5}}/grupę) w następujący sposób: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH plus nośnik, iv) SAH plus NQDI-1, v) SAH plus wymieszane (Scr) krótkie interferujące (si) RNA, vi) SAH plus ASK1 siRNA, vii) SAH plus BMS-582949 i viii) grupy SAH plus SP600125. ASK1 siRNA, inhibitor p38 BMS-582949 i inhibitor JNK SP600125 wstrzyknięto w celu oceny, czy ASK1, p38 i JNK były zaangażowane w neuroprotekcyjne działanie NQDI-1.

Analiza statystyczna. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe, a dane eksperymentalne WB uzyskano w 6 niezależnych powtórzeniach, podczas gdy barwienie DHE i barwienie TUNEL wykonano w 4 niezależnych powtórzeniach. Dane analizowano przy użyciu SPSS wersja 17 (SPSS, Inc.). Dane z testu labiryntu wodnego Morrisa zostały ocenione przy użyciu mieszanej ANOVA/dwukierunkowej ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a następnie testu post hoc LSD. Dane z pozostałych eksperymentów przetestowano pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu rozkładu normalnego Shapiro-Wilka, a następnie jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie testu porównań wielokrotnych post hoc Tukeya. Wykresy sporządzono przy użyciu GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Wyniki

Śmiertelność i nasilenie SAH. W niniejszym badaniu wykorzystano łącznie 191 szczurów SD, z których 8 szczurów wykluczono z powodu jedynie łagodnego SAH (wynik oceny SAH mniejszy niż lub równy 8). Spośród szczurów SD użytych w eksperymentach 34 szczury znajdowały się w grupie pozorowanej, a 149 szczurów przeszło modelowanie SAH. Żaden szczur z grupy pozorowanej nie umarł; jednakże 23 szczury zmarły po modelowaniu SAH (wskaźnik śmiertelności 15,4 procent) (tabele SI-V). W porównaniu z grupą pozorowaną, skrzepy w przestrzeni podpajęczynówkowej były zlokalizowane głównie w pobliżu pierścienia Willisa i po obu stronach tętnicy podstawnej po modelowaniu SAH (ryc. 1A). Wynik oceny SAH 24 godziny po modelowaniu SAH nie wykazał istotnej różnicy w ciężkości krwotoku między wszystkimi grupami nie pozorowanymi i istotną różnicę między grupami pozorowanymi a wszystkimi grupami niepozorowanymi (ryc. 1B).

Zmiany ekspresji białek i lokalizacja komórkowa ASK1 po SAH. Poziomy ekspresji białka ASK1 wzrosły i osiągnęły szczyt po 24 godzinach w mózgu po SAH (ryc. 1C i D). Jednak stosunek ekspresji białka p-ASK1 / ASK1 nie wykazał znaczącej różnicy (ryc. 1C i E). Lokalizację komórkową ASK1 z neuronami NeuN-dodatnimi, Iba-1-dodatnimi mikroglejami i astrocytami GFAP-dodatnimi wykazano zarówno w grupie pozorowanej, jak i SAH 24 h (ryc. 1F-H).

Inhibitor ASK1 NQDI-1 poprawia krótkoterminowe funkcje neurologiczne 24 godziny po SAH. NQDI‑1 (1, 3 i 10 µg/kg) wstrzyknięto dokomorowo-mózgowo 1 godzinę po SAH. Szczury poddane modelowaniu SAH miały znacznie niższe zmodyfikowane wyniki Garcii i równowagi wiązki 24 godziny po modelowaniu SAH; jednakże wszystkie trzy dawki NQDI‑1 doprowadziły do ​​istotnej częściowej poprawy krótkoterminowej funkcji neurologicznej (ryc. 2A i B). Zmodyfikowane wyniki Garcii były znacząco wyższe w grupie SAH plus NQDI‑1 (3,0 µg/kg) w porównaniu z grupą SAH plus NQDI‑1 (1,0 µg/kg); jednak nie wykazano statystycznie istotnych różnic w porównaniu z grupą SAH plus NQDI‑1 (10,0 µg/kg) (ryc. 2A i B), co sugeruje, że dalsze zwiększanie stężenia NQDI‑1 nie nie wywoływały dalszej poprawy krótkoterminowej funkcji neurologicznej po SAH. Dlatego NQDI‑1 (3,0 µg/kg) uznano za efektywne optymalne stężenie i zastosowano w kolejnych eksperymentach.

Inhibitor ASK1 NQDI-1 poprawia długoterminowe funkcje neurologiczne po SAH. Stosując prędkość początkową 5 lub 10 obr./min w teście Rotarod, opóźnienie upadku było znacznie zmniejszone w grupie SAH plus z podłożem w porównaniu z grupą pozorowaną, podczas gdy opóźnienie upadku było znacznie wydłużone po wstrzyknięciu dokomorowym NQDI‑1 w porównaniu z podłożem SAH plus grupa (ryc. 2C i D). Ponadto, w dniach 1-5 fazy treningowej testu labiryntu wodnego Morrisa w 4. tygodniu po wystąpieniu SAH, grupa SAH plus nośnik wykazała znacznie dłuższe opóźnienie ucieczki i dystans pływania w porównaniu z grupą pozorowaną, podczas gdy leczenie NQDI-1 wykazało znaczny spadek w porównaniu z grupą pojazdów SAH plus (ryc. 2E-G). W fazie testów z usunięciem podwodnej okrągłej platformy nie zaobserwowano znaczących różnic w prędkości pływania między trzema grupami (ryc. 2H). Czas trwania kwadrantu sondy był istotnie krótszy w grupie SAH plus nośnik w porównaniu z grupą pozorowaną, a leczenie NQDI-1 znacznie wydłużyło czas eksploracji w porównaniu z grupą SAH plus nośnik (ryc. 2I).

Inhibitor ASK1 NQDI-1 zmniejsza stres oksydacyjny i apoptozę neuronów 24 godziny po SAH. Poziom stresu oksydacyjnego mierzono za pomocą barwienia DHE, a odsetek neuronów apoptotycznych oceniano za pomocą odsetka neuronów TUNEL-dodatnich 24 godziny po SAH. Odsetek komórek DHE-dodatnich był znacznie wyższy w grupie SAH plus nośnik w porównaniu z grupą pozorowaną, a leczenie NQDI-1 znacznie zmniejszyło to w porównaniu z grupą SAH plus nośnik (ryc. 3A i). Odsetek neuronów TUNEL-dodatnich był znacząco wyższy w grupie SAH plus nośnik w porównaniu z grupą pozorowaną. Jednak odsetek neuronów TUNEL-dodatnich zmniejszył się znacząco po leczeniu NQDI-1 w porównaniu z grupą SAH plus nośnik (ryc. 3B i D).

ASK1 siRNA, BMS-582949 i SP600125 poprawiają krótkoterminowe funkcje neurologiczne 24 godziny po SAH. W porównaniu z grupą SAH plus Scr siRNA lub grupą SAH plus nośnik, podawanie ASK1 siRNA, BMS-582949 lub SP600125 wykazało znaczną poprawę zmodyfikowanego wyniku Garcii i równowagi wiązki (ryc. 4A i B).

NQDI-1 osłabia stres oksydacyjny i apoptozę po SAH poprzez zmniejszoną fosforylację ASK1, p38 i JNK. Poziomy ekspresji białek ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, HO-1, Bax i Bcl-2 były znacząco wyższe po SAH w porównaniu z grupą pozorowaną; jednakże stosunek p‑ASK1/ASK1 nie różnił się istotnie (ryc. 5A‑M). Wstrzyknięcie nośnika lub siRNA Scr nie wywołało znaczących różnic w poziomach ekspresji białka w porównaniu z grupą SAH. W porównaniu z grupą SAH plus nośnik, leczenie przy użyciu NQDI‑1 spowodowało znaczny spadek poziomów ekspresji białek p‑ASK1/ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE i Bax, podczas gdy poziomy ekspresji białek HO -1 i Bcl-2 były znacznie zwiększone. W porównaniu z grupą SAH plus Scr siRNA, poziomy ekspresji białka ASK1 znacznie spadły po wstrzyknięciu siRNA ASK1. Leczenie siRNA ASK1 spowodowało również znaczny spadek poziomów ekspresji białek p-p38, p-JNK, 4-HNE i Bax oraz znaczny wzrost ekspresji HO-1 i Bcl-2 w porównaniu z siRNA SAH plus Scr Grupa.

Inhibitor p38 BMS‑582949 zmniejsza poziom ekspresji białka p‑p38, ale nie wpływa na poziom ekspresji białka p‑ASK1, ASK1 ani p‑JNK. Leczenie inhibitorem p38 BMS-582949 wykazało znaczny spadek poziomów ekspresji białek p-p38, 4-HNE i Bax, a także znacząco zwiększoną ekspresję białek HO-1 i Bcl-2 w porównaniu z grupą SAH plus nośnik; jednakże poziomy ekspresji białka ASK1, p-ASK1 / ASK1 i p-JNK nie wykazały znaczących różnic (ryc. 6A-M). Inhibitor JNK SP600125 zmniejsza poziom ekspresji białka p-JNK, ale nie wpływa na poziomy ekspresji białka p-ASK1, ASK1 ani p-p38. Leczenie inhibitorem JNK SP600125 spowodowało znaczny spadek poziomów ekspresji białek p-JNK, 4-HNE i Bax oraz znaczny wzrost poziomów ekspresji białek HO-1 i Bcl-2 w porównaniu z grupą SAH plus nośnik; jednakże poziomy ekspresji białka ASK1, p-ASK1 / ASK1 i p-p38 nie uległy istotnej zmianie (ryc. 7A-M).

【Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】