Na podstawie farmakologii sieciowej i eksperymentów na zwierzętach mających na celu zbadanie wpływu glikozydu fenylotanoidowego z Cistanche Tubulosa na efekt nefropatii cukrzycowej

Streszczenie: Cel Zbadanie wpływuCistancheglikozydy fenyloetanolowe(CPhG) włączonecukrzycowa choroba nerek(DKD) w oparciu o farmakologię sieciową i eksperymenty na zwierzętach. Metody Do analizy wykorzystano metodę UHPLC-QE-MSskładniki chemiczne CPhG. Do przeglądu głównych komponentów wykorzystano bazy danych TCMSP i Swiss Target Prediction. Do uzyskania celów związanych z DKD wykorzystano bazy danych OMIM i GeneCards. Po uzyskaniu wspólnych celów witrynę STRING wykorzystano do zbudowania sieci interakcji białek. Bazę danych DAVID wykorzystano do analizy szlaków GO i KEGG, a oprogramowanie Cytoscape wykorzystano do skonstruowania sieci „komponent podstawowy-ścieżka docelowa CPhG”. Dziesięć szczurów wybrano losowo jako grupę normalną, a pozostałe szczury karmiono paszą o wysokiej zawartości cukru i tłuszczu oraz podano pojedynczy dootrzewnowy zastrzyk STZ w celu ustalenia modelu DKD. Podzielono ich na grupę modelową, grupę dapagliflozyny (1 mg/kg) oraz wysoką i średnią i niską dawkę CPhG (500, 25{{40}}, 125 mg/kg), po 10 zwierząt w każdej grupie, interwencja lekowa przez 6 tygodni, obserwowano stan ogólny, określano masę ciała i co tydzień badano poziom glukozy we krwi; Po przyjęciu ostatniej dawki zebrano mocz z 24 godzin. Wykryj 24-godzinę całkowitego białka w moczu (24-UTP); pobrać krew z aorty brzusznej i poświęcić ją, oddzielić surowicę i wykryć azot mocznikowy (BUN), kwas moczowy (UA), cholesterol całkowity (TC), trójglicerydy (TG) i wysokie ciśnienie krwi. Do obserwacji zmian patologicznych w tkance nerek wykorzystano oznaczenie poziomu lipoprotein o dużej gęstości (HDL) i lipoprotein o małej gęstości (LDL), barwienie HE i barwienie Massona, a do wykrywania IL-1, IL{{17} w surowicy zastosowano test ELISA. } i TNF-, a do wykrycia tkanki nerkowej zastosowano Western blot. Ekspresja białka JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3. Wyniki Za pomocą technologii UHPLC-QE-MS wykryto łącznie 699 składników. Po przeszukaniu uzyskano 16 podstawowych składników CPhG i 323 powiązane cele. CPhG i DKD miały wspólne 99 celów. Kluczowymi celami były STAT3, SRC, EGFR itp. Analiza szlaku KEGG objęła 151 szlaków sygnalizacyjnych i wykazała, że ​​szlak sygnalizacyjny IL-17, szlak sygnalizacyjny PI3K/Akt, szlak sygnalizacyjny TNF itp. mogą odgrywać kluczową rolę w leczenia DKD za pomocą CPhG. CPhG mogą zwiększać masę ciała szczurów z DKD (P < 0,01), zmniejszać spożycie wody (P < 0,01), regulować metabolizm glukozy i lipidów, zmniejszać poziomy 24-UTP i BUN (P < 0,01) oraz poprawiać tkankę nerek . Uszkodzenia patologiczne zmniejszyły ekspresję białek p-JAK2/JAK2 i p-STAT3/STAT3 w tkance nerek (P<0,01) i zwiększyły ekspresję białka SOCS3 (P<0,01). Wnioski CPhG interweniują w DKD poprzez wiele składników, wiele celów i wiele szlaków, prawdopodobnie poprzez hamowanie JAK2/

Szlak sygnałowy STAT3.

Słowa kluczowe: Glikozyd fenyloetanolu Cistanche; nefropatja cukrzycowa; UHPLC-QE-MS; farmakologia sieciowa; eksperyment na zwierzętach; Szlak sygnałowy JAK2/STAT3

JAK DŁUGO DZIAŁA CISTANCHE U PACJENTÓW Z NERKAMI?

Cukrzycowa choroba nerek (DKD)jako jedno z najważniejszych powikłań mikronaczyniowych cukrzycy, jest nie tylko pierwotnym czynnikiem do niego prowadzącymprzewlekłą chorobę nerekale także główną przyczyną schyłkowej niewydolności nerek (ESRD) na całym świecie. Powód [1-2]. Leczenie kliniczne DKD polega głównie na kontrolowaniu poziomu cukru we krwi, ciśnienia krwi i lipidów we krwi, a po drugie na ochronie funkcji nerek, unikaniu stosowania leków nefrotoksycznych i poprawie stylu życia [3-4. Jednak ze względu na złożoną patogenezę DKD i brak konkretnych celów interwencyjnych obecne możliwości leczenia mają ograniczenia i są nieskuteczne. Częstość występowania schyłkowej postaci DKD stale rośnie. Dlatego tak istotne jest znalezienie skutecznych leków naturalnych.

Cistanche Deserticola Y. C． Mam lubCistanche C.Suszone mięsiste łodygiCistanche tubulosa (Schenk) Wightz łuskowatymi liśćmi [5] zostały po raz pierwszy odnotowane w „Materia Medica Shen Nong” i zostały wymienione jako najwyższej jakości. Nazywane są „żeń-szeniem pustynnym” [6]. Są słodkie, słone i ciepłe. , powraca do meridianów nerek i jelita grubego i ma działanie odżywcze Yang nerek, uzupełnianie esencji i krwi, nawilżanie jelit i działanie przeczyszczające. Badania pokazują, że glikozydy fenyloetanoidowe (CPhG) są jednym z jego głównych składników aktywnych i odpowiadają za jego rozwój.

Materialna podstawa wywoływania efektów farmakologicznych; Ekstrakt z Cistanche ma działanie przeciwcukrzycowe [7-8], przeciwnowotworowe [9], chroniące nerki [10-11], neuroprotekcyjne [12-13] i inne działanie farmakologiczne, ale obecnie CPhG nie są skuteczne w leczeniu DKD. Jego skutki i mechanizmy są niejasne.

W badaniu tym wykorzystano farmakologię sieciową i metody dokowania molekularnego [14], przyjmując CPhG jako obiekt badań, prognozując i analizując jego główne składniki aktywne i potencjalne cele w leczeniu DKD, a następnie ustalając kombinację wysokiej dawki indukowanej streptozocyną (STZ) Model szczura DKD karmiony paszą lipidową wykorzystano jako przedmiot badań in vivo, aby zapewnić punkt odniesienia dla ekspansji klinicznej i zastosowania powiązanych terapii oraz dalszych badań nad mechanizmem działania.

1 materiał

1.1 Zwierzęta

70-tygodniowe samce szczurów SD z poziomem SPF i masą ciała (240±20) g zakupiono w Centrum Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Xinjiang [Licencja na eksperymentalne wykorzystanie zwierząt nr SYXK (nowa) {{4} }], at Zwierzęta hodowano adaptacyjnie przez 1 tydzień w temperaturze (22 ± 2) stopni, przy wilgotności względnej od 50% do 70% i przy naprzemiennym cyklu światła i ciemności 12 h/12 ​​h. Eksperyment został zatwierdzony przez Komisję ds. Etyki Zwierząt Centrum Medycznych Doświadczalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Xinjiang (numer etyczny IACUC-20220127-19).

1.2 Odczynniki i leki

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) dostarczyła firma Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozynę (numer partii NB2248) zakupiono od AstraZeneca w Wielkiej Brytanii. Paszę o wysokiej zawartości cukru i tłuszczu (nr kat. Boaigang-B1135DM) i STZ (nr partii 2021110307) zakupiono od Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; mikroalbumina moczu (nr serii 20220611), azot mocznikowy (nr serii 20220626), kwas moczowy (nr serii 20220613), cholesterol całkowity (nr serii 20220615), triglicerydy (nr serii 20220616), lipoproteiny o dużej gęstości (nr serii 20220614) ) i lipoproteinę o małej gęstości (numer serii 20220615) zakupiono w Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleukina-6 (IL-6, numer partii JL20896), interleukina-1 (IL-1, numer partii JL20884) i czynnik martwicy nowotworu- (TNF-, numer partii 13202 ) zakupiono od Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; Królicze przeciwciało poliklonalne JAK2 (numer serii 22v9316), królicze przeciwciało poliklonalne p-JAK2 (numer serii 78g9360), królicze przeciwciało poliklonalne STAT3 (numer serii 15x8824), królicze przeciwciało poliklonalne p-STAT3 (numer serii 74m1478), królicze przeciwciało poliklonalne SOCS3 (numer serii 74m1478) numer 31d4841) zostały zakupione od Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; Kozie przeciwciało poliklonalne IgG antykrólicze znakowane HRP (numer serii 20000758) zakupiono od Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -aktynowe królicze przeciwciało monoklonalne (numer serii AC230205001), bufor do lizy RIPA (numer serii 20220416), zestawy do oznaczania stężenia białka BCA (numer serii 20230401) zakupiono od Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrumenty

Ultrawysokosprawna chromatografia cieczowa Vanquish, spektrometr masowy wysokiej rozdzielczości Q Exactive Focus, wirówka Heraeus Fresco17, automatyczny czytnik mikropłytek FC (Thermo Fisher Scientific, USA); szlifierka JXFSTPRP-24 (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Miernik czystej wody Mingche D24 UV (Niemcy Merck Millipore Company); Kolumna ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); Glukometr Accu Chek Performa (Swiss Roche Company); Kriostat CM1850UV, pionowy mikroskop fluorescencyjny DM300 (Leica Company, Niemcy); Miernik wirowy GL-88B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektroniczna waga analityczna (Bio-Rad Company, USA).

2 metody

2.1 Analiza UHPLC-QE-MS

2.1.1 Przygotowanie roztworu testowego

Odważyć 100 mg CPhG, dodać 500 μL 80% metanolu, worteksować przez 30 s, poddawać działaniu ultradźwięków w łaźni lodowo-wodnej przez 1 godzinę, odstawić w temperaturze -40 na 1 godzinę, wirować w temperaturze 4 stopni , 12 000 obr./min przez 15 min, odessać supernatant, 0. Przesączyć przez mikroporowatą membranę o średnicy porów 22 μm i przechowywać w lodówce o -80 stopniach.

2.1.2 Warunki chromatograficzne

Kolumna ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); faza ruchoma acetonitryl (A) -1% kwas mrówkowy (B), elucja gradientowa (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 do 12 min, 75% do 98% A; 12 do 14 min, 98% A; 14 do 14, 1 min, 98% do 15% A; 14, 1 do 15 min, 15% A); Strumień objętości powietrza 0 . 5 ml/min; temperatura kolumny 35 stopni; objętość wtrysku 5 µl.

2.1.3 Warunki spektrometrii mas

pełne skanowanie ddMS2 tryb pełnego skanowania; objętościowe natężenie przepływu gazu osłonowego 45 arb; objętościowe natężenie przepływu gazu pomocniczego 15 arb; temperatura kapilary 400 stopni; energia zderzenia w trybie NCE 15% ~ 30% ~ 45% cyklu; napięcie natrysku ± 4,0 kV.

2.2 Sieciowe badania farmakologiczne

2. 2. 1 CPhG

Przeszukiwanie docelowych składników: Posortuj składniki chemiczne analizowane za pomocą UHPLC-QE-MS według względnej zawartości i usuń te, których struktura chemiczna nie została jeszcze określona. Wprowadź numer seryjny InChIKey sprawdzanych składników do bazy danych TCMSP, aby uzyskać parametry farmakokinetyczne każdego składnika. W oparciu o warunki biodostępności po podaniu doustnym (OB) > 30% i podobieństwa do leku (DL) > 0,18, kandydaci spełniający wymagania zostaną poddani badaniu przesiewowemu. Wprowadź numer SMILES każdego składnika w szwajcarskiej bazie danych przewidywań docelowych, aby przewidzieć cel i uzyskać docelowy składnik chemiczny CPhG.

2. 2. 2 DKD

Badania przesiewowe celów chorobowych Użyj „nefropatii cukrzycowej” jako hasła wyszukiwania, aby wyszukać docelowe choroby w bazach danych OMIM, GeneCards i NCBI.

2. 2. 3 Budowa sieci składowa-cel-choroba

Cele krzyżowe składników i chorób CPhG uzyskano poprzez mapowanie oprogramowania R, a oprogramowanie Cytoscape 3.7.2 wykorzystano do skonstruowania systemu sieciowego komponent-cel, w którym wtyczka analizująca wykrywała podstawowe cele.

2. 2. 4 Budowa sieci interakcji białko-białko (PPI)

Zaimportuj docelowe białka składowych i chorób do bazy danych STRING, skonstruuj sieć interakcji białko-białko (PPI), usuń białka bez połączonych węzłów w sieci i ustaw poziom ufności najniższego wyniku interakcji białek na {{1} }.700. Zbuduj sieć PPI, pobierz jej wyniki w formacie TSV, zaimportuj je do oprogramowania Cytoscape 3.7.2 i użyj wtyczki analitycznej do dalszego sprawdzania głównych celów.

2. 2. 5 GO, analiza KEGG

Użyj sekcji Adnotacja funkcjonalna w bazie danych DAVID, aby przeprowadzić analizę wzbogacającą na skrzyżowaniach celów chorób składowych. Najpierw ustaw parametry analizy, wprowadź cel skrzyżowania w polu Lista genów, wybierz oficjalny symbol genu jako identyfikator celu, wybierz Lista genów jako typ danych (Typ listy) i wybierz „Homo Sapiens (gatunki)” jako źródło docelowe (gatunek). Race)”, rozpocznij analizę po potwierdzeniu parametrów analizy, uzyskaj wyniki analizy GO i KEGG, a następnie użyj platformy do rysowania online ImageGP, aby narysować diagram bąbelkowy wyników analizy KEGG i GO. Oprogramowanie Cytoscape 3.7.2 konstruuje komponent -target-pathway obraz sieci.

2. 2. 6 Dokowanie molekularne

Najpierw pobierz diagram struktury 3D składnika aktywnego w formacie SDF z bazy danych PubChem, następnie pobierz diagram struktury 3D celu przecięcia w formacie PDB z amerykańskiej bazy danych Global Protein Database (PDB), a na koniec prześlij go do CB-Dock strona poświęcona dokowaniu molekularnemu. Przejrzyj dominujące konformacje dokowania i wizualizuj je za pomocą Pymolu.

2.3 Eksperymenty na zwierzętach

2.3.1 Modelowanie, grupowanie i podawanie leków

10 szczurów wybrano losowo jako grupę normalną i karmiono zwykłą paszą, a pozostałe szczury karmiono paszą o wysokiej zawartości cukru i tłuszczu. Po 6 tygodniach podano im jednorazową iniekcję dootrzewnową 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/l STZ rozpuszczonego w buforze cytrynianu sodu o pH 4,5), a 72 godziny później pobrano krew z żyły ogonowej do wykrywania glukozy we krwi na czczo (FBG). Jeśli FBG jest większe lub równe 16,7 mmol/l, model cukrzycy został pomyślnie ustalony [15]; kontynuuj Przez 2 tygodnie karmiono je paszą o wysokiej zawartości cukru i tłuszczu. Modelowanie DKD uznano za skuteczne na podstawie dodatniego wyniku glukozy w moczu i 24-godzinnego całkowitego białka w moczu (24-UTP) Co najmniej 20 mg. Spośród nich 3 zmarły podczas procesu modelowania, a 7 zakończyło się niepowodzeniem. łącznie 50 zakończyło się sukcesem. Szczury, które pomyślnie modelowano, podzielono losowo na grupę modelową, grupę dapagliflozyny (1 mg/kg) oraz grupy CPhG o wysokiej, średniej i niskiej dawce (500, 250, 125 mg/kg). Każdą grupę podawania podawano dożołądkowo. Szczurom w grupie normalnej i grupie modelowej podano odpowiednie leki, a szczurom w grupie normalnej i grupie modelowej podawano przez zgłębnik taką samą ilość soli fizjologicznej raz dziennie przez łącznie 6 tygodni. W okresie podawania szczury w każdej grupie, z wyjątkiem grupy normalnej, nadal otrzymywały paszę wysokotłuszczową.

2.3.2 Detekcja wskaźnika biochemicznego

Po 6 tygodniach interwencji CPhG od szczurów pobrano 24-godzinę moczu i zmierzono 24-godzinę całkowitego białka w moczu (24-UTP); krew pobrano z żyły ogonowej na czczo w celu określenia poziomów FBG; krew pobrano z aorty brzusznej, 4 stopnie, 1500 obr./min. Wiruj przez 10 minut, aby oddzielić surowicę i wykryć azot mocznikowy w surowicy.

BUN), kwasu moczowego (UA), cholesterolu całkowitego (TC), trójglicerydów (TG), lipoprotein o dużej gęstości (HDL), lipoprotein o małej gęstości (lipoprotein o małej gęstości LDL).

2.3.3 Obserwacja patologicznej morfologii tkanki nerkowej

Szczury znieczulono pentobarbitalem sodu i uśmiercono. Nerki oderwano, zważono, utrwalono 4% paraformaldehydem, odwodniono, przezroczystość, zanurzono w wosku, zatopiono i pocięto na skrawki w celu wybarwienia hematoksyliną-eozyną (HE).

Po barwieniu Massona obserwowano morfologię tkanki pod mikroskopem, a do analizy zintegrowanej gęstości optycznej i ilościowego określenia względnej powierzchni włókien kolagenowych wykorzystano oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0.

2. 3. 4 ELISA

Metodę tę zastosowano do wykrywania poziomu czynników zapalnych w surowicy u szczurów. Poziomy IL-6, IL-1 i TNF- oznaczono zgodnie z instrukcją zestawu.

2. 3. 5 Metoda Western blot do wykrywania ekspresji powiązanych białek

Pobrano tkankę nerki szczura, dodano lizat RIPA w celu ekstrakcji białka całkowitego i określono stężenie metodą BCA.

Po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu przenieść na membranę PVDF i po zablokowaniu JAK2 (1:2000), p-JAK2 (1:1000), STAT3 (1:2000), p-STAT3 (1:2000), Przeciwciała SOCS3 (1:2000), -aktyna (1:2000), inkubować w temperaturze 4 stopni przez noc, dodać znakowane HRP przeciwciało drugorzędowe IgG (1:5000) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wywoływane za pomocą zestawu do elektroluminescencji, eksponowane za pomocą imagera do obrazowania żelu białkowego, przy użyciu oprogramowania Image J

Analiza ilościowa kawałków. Stosując -aktynę jako wewnętrzne odniesienie, stosunek wartości szarości prążka docelowego i wewnętrznego prążka odniesienia jest względną ekspresją białka.

2.4 Analiza statystyczna

Dane zostały przetworzone w oprogramowaniu SPSS 25.0 i wyrażone jako (x±s). Do porównania pomiędzy grupami wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.