Karwedilol, bloker adrenergiczny, hamuje syntezę melaniny poprzez hamowanie szlaku sygnałowego CAMP/CREB w ludzkich melanocytach i hodowli ludzkiej skóry ex Vivo

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ i Sung Eun Chang 1

Abstrakcyjny:Katecholaminy działają poprzez receptory sprzężone z białkiem G, powodując wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu 30 50-cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) w różnych komórkach. Biosynteza katecholamin i receptor adrenergiczny występują wmelanocyty; dlatego katecholaminy mogą odgrywać kluczową rolę w pigmentacji skóry. Jednak ich działanie i mechanizmy pośredniczące w melanogenezie w skórze człowieka nie zostały jeszcze zbadane. Dlatego zbadaliśmy potencjalny efekt przeciwmelanogenetyczny karwedylolu, nieselektywnego blokera o słabym działaniu 1-blokującym. Karwedilol obniżył zawartość melaniny i aktywność tyrozynazy komórkowej bez pogarszania żywotności komórek u normalnego człowiekamelanocytyjak również w unieśmiertelnionych melanocytach myszy Mel-Ab. czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią (MITF), tyrozynaza, białko związane z tyrozynazą (TRP)-1 i TRP-2 regulowane w dół przez karwedilol. Leczenie karwedylolem doprowadziło do obniżenia poziomu białka wiążącego element fosfor-cAMPresponse (CREB). Ponadto wzrost poziomów cAMP po leczeniu forskoliną odwracał przeciwmelanogenne działanie karwedylolu. Ponadto karwedilol znacznie obniżył indeks melaniny w kulturach ludzkiej skóry napromieniowanej promieniowaniem ultrafioletowym. Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że karwedilol skutecznie hamuje melanogenezę u ludzimelanocytyoraz ex vivo ludzka skóra przez hamowanie sygnalizacji cAMP/kinaza białkowa A/CREB. Antymelanogenne działanie karwedylolu może mieć potencjalne znaczenie dla skórybielenieagentów.

Słowa kluczowe:karwedilol; bloker adrenergiczny;synteza melaniny; Sygnalizacja cAMP/CREB

Cistanchejest w stanie hamować syntezę melaniny

1. Wstęp

Szeroka gama pigmentowych zaburzeń skóry ma znaczący wpływ na psychikę i społeczeństwo pacjentów. Opracowano różne metody leczenia, w tym środki ogólnoustrojowe i miejscowe oraz laseroterapię [1–3]. Jednak wyniki leczenia są często niezadowalające, a działania niepożądane, takie jak przebarwienia pozapalne (PIH) i hipopigmentacja, są częste. Ponadto leczenie jest kosztowne i czasochłonne [4–6].

Katecholaminy, do których należą dopamina, epinefryna i norepinefryna, są cząsteczkami sygnalizacyjnymi, które działają jako neuroprzekaźniki i hormony endokrynologiczne. W skórze biosynteza i degradacja katecholamin zachodzi w ludzkich keratynocytach, ale synteza katecholamin w melanocytach jest nieco inna [7–9]. Katecholaminy działają poprzez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR). Wiązanie katecholamin z GPCRs powoduje aktywację wewnątrzkomórkowej adenylatecyklazy, która syntetyzuje 30, 50-cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP) z ATP [10]. Drugi przekaźnik cAMP wywiera swoją aktywność poprzez wiązanie podjednostki R kinazy białkowej A (PKA), co powoduje fosforylację białka wiążącego element odpowiedzi cAMP (CREB). GPCR są aktywowane przez aminy i peptydy, w tym glukagon, parathormon, sekretynę i kalcytoninę [10].

Antagoniści receptora adrenergicznego obejmują antagonistów receptora i receptora. -antagoniści receptora są podzieleni na podkategorie nieselektywne, 1-selektywne i 2-selektywne, podczas gdy antagoniści receptora są podklasyfikowani jako nieselektywni, 1-selektywni i 2-selektywni agentów na podstawie ich selektywnych działań blokujących. W przeciwieństwie do nieselektywnych antagonistów receptorów pierwszej generacji, takich jak propranolol, tymolol i nadolol, karwedilol jest nieselektywnym blokerem trzeciej generacji, który wykazuje działanie rozszerzające naczynia poprzez blokowanie 1-adrenoreceptorów ({17}}AR) [11]. Dlatego karwedylol jest nieselektywnym blokerem o słabym działaniu 1-blokującym [12]. Jest stosowany głównie jako lek doustny do kontroli nadciśnienia tętniczego i zastoinowej choroby serca, podobnie jak inne blokery [12]. Jednak blokery trzeciej generacji wykazują działanie angiogenne, antyoksydacyjne, antyproliferacyjne, antyhipertroficzne i antyapoptotyczne, które wymagają dalszego wyjaśnienia [11]. W dermatologii, ze względu na swoje działanie przeciwutleniające i przeciwzapalne, karwedilol jest często stosowany w preparatach doustnych w leczeniu trądziku różowatego na tle skórno-teleangiektycznym [13,14]. Ponadto działanie antyoksydacyjne karwedylolu zapobiega powstawaniu karcynogenezy skóry indukowanej promieniowaniem ultrafioletowym (UV), co czyni go atrakcyjnym środkiem w leczeniu chorób skóry związanych z promieniowaniem UV [15–18]. Jednak w chemoprewencyjnym działaniu karwedylolaru nie pośredniczą bezpośrednio AR. [19] Chociaż dokładny mechanizm jest stosunkowo nieznany, szlak sygnałowy cAMP/PKA i PKC-δ może być powiązany z właściwościami karwedylolu przeciwko przerzutom do skóry [20].

We wczesnych stadiach badania pigmentacji człowiekmelanocytystwierdzono ekspresję -1-sygnalizacji AR po zewnątrzkomórkowej indukcji noradrenaliną. Jednak po stymulacji sygnałem adrenergicznym wmelanocyty[8]. Odwrotnie, Cillbro i in. później wykazał, że w ludzkich melanocytach występuje specyficzny funkcjonalny sygnał 2-AR oraz że 2-stymulacja AR prowadzi do pigmentacji poprzez szlak 2-AR/cAMP [7]. W związku z tym sugerowano rolę katecholamin w kontroli pigmentacji, a cAMP uważa się za główną oś kontroli katecholamin melanogenezy.

Melanogeneza to złożony proces obejmujący wiele ścieżek. Tyrozynaza, białko 1 związane z tyrozynazą (TRP-1) i TRP-2, zwane również tautomerazą dopachromową (DCT), są trzema głównymi enzymami specyficznymi dla melanocytówsynteza melaniny[21]. Melanogeneza jest indukowana lub hamowana przez wiele czynników, w tym hormony, cytokiny, neuroprzekaźniki, czynniki wzrostu i mikrocząsteczki [21–23].

Najważniejszym pozytywnym regulatorem jest receptor melanokortyny-1 i jego ligandy, melanokortyny i hormon adrenokortykotropowy [23]. Jednak różne czynniki zaangażowane w melanogenezę to -endorfina, estrogeny, androgeny, witamina D3 i katecholaminy [23]. Zgromadzone dowody sugerują, że L-tyrozyna i L-DOPA, będące substratami i półproduktami melanogenezy, oprócz regulatorów innych funkcji komórkowych, działają jako induktory i pozytywne regulatory szlaku melanogenicznego [24]. Ponadto Jeff Howe i in. zasugerowali, że w indukcji i regulacji melanogenezy przez L-tyrozynę pośredniczy bezpośrednia aktywacja receptorów adrenergicznych przez L-tyrozynę, a nie przez jej produkty metaboliczne, takie jak katecholaminy [25]. W ich badaniach norepinefryna i adrenalina stymulowały aktywność tyrozynazy, ale ich indukcyjny wpływ nasynteza melaninybył stosunkowo niższy niż L-tyrozyna [25].

Katecholaminy mogą odgrywać ważną rolę w systemie pigmentacji skóry; jednak ich wpływ na melanogenezę w odniesieniu do działania nieselektywnego blokera trzeciej generacji nie został jeszcze zbadany. Dlatego w niniejszym badaniu chcieliśmy zbadać, czy karwedilol wpływa na melanogenezę i zbadać jego mechanizmy działania u ludzimelanocytyi ex vivo ludzka skóra i jej potencjalne zastosowanie jakobielenieprodukt.

hamować tworzenie melaniny za pomocąHerba Cistanches

2. Wyniki

2.1. Karwedylol hamuje melanogenezę

Cytotoksyczność karwedylolu wobec normalnego człowiekamelanocyty(NHM) i komórki Mel-ab oceniano w teście proliferacji komórek WST. Stężenie karwedylolu wynoszące 10 µM zaczęło wykazywać cytotoksyczność zarówno wobec komórek NHM, jak i Mel-ab (Figura 1A, B). Dlatego w dalszych ocenach użyliśmy 8 µM karwedylolu, który nie jest cytotoksyczny dla NHM.

Leczenie karwedylolem zmniejszyło zawartość melaniny w sposób zależny od dawki bez wpływu na żywotność NHM (ryc. 1C). Zawartość melaniny zmniejszyła się o 28,36 procent po traktowaniu 96 hof 8 µM karwedylolem (Figura 1C). Dodanie 100 mg/ml arbutyny zmniejszyło zawartość melaniny w mniejszym stopniu niż karwedilol (Figura 1C). Po 4 dniach leczenia karwedylolem zawartość melaniny zmniejszyła się w sposób zależny od czasu (ryc. 1D). Jednak leczenie forskoliną (FSK) przez 4 dni po wstępnym leczeniu karwedylolem indukowało wzrost zawartości melaniny (ryc. 1E). FSK zwiększa transkrypcję MITF w największym stopniu po 2 godzinach w NHM i uważa się, że działa poprzez cAMP /PKA/CREB (ryc. 1F).

2.2. Karwedilol hamuje ekspresję MITF i jego docelowych genów oraz obniża poziom fosfo-CREB w NHM

Ponieważ karwedilol zmniejszał akumulację melaniny, zbadaliśmy aktywność tyrozynazy komórkowej. Leczenie karwedylolem zmniejszało aktywność tyrozynazy komórkowej w sposób zależny od dawki w NHM (Figura 2A). Aktywność tyrozynazy zmniejszyła się o 28,48 procent po 96 godzinach traktowania 8 µM karwedylolem (Figura 2A). Następnie ustaliliśmy, czy karwedilol wpływa na ekspresję MITF, który odgrywa kluczową rolę w regulacji tyrozynazy i dalszych genów melanogenicznych. Leczenie FSK zwiększyło wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i odwróciło antymelanogenne działanie karwedylolu. Karwedylol znacząco obniżył poziom białka MITF, centralnego czynnika transkrypcyjnego melanogenezy, po 72 godzinach (Figura 2B). Ponadto ekspresja jego genów docelowych, takich jak tyrozynaza i TRP-1, została obniżona po leczeniu karwedylolem (Figura 2B). Wyniki te wskazują, że karwedilol hamuje melanogenezę poprzez osłabienie sygnalizacji MITF.

Następnie zbadaliśmy wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe melanogenezy, które regulują transkrypcję MITF, mierząc poziomy ekspresji fosfo-CREB i fosfo-ERK. Poziomy fosfo-ERK nie zmieniły się w czasie po leczeniu karwedylolem; jednak poziomy fosfo-CREB były obniżone (Figura 2B). Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, nasze wyniki wykazały, że karwedylolina hamuje melanogenezę poprzez hamowanie szlaku sygnałowego cAMP/PKA/CREB. Co więcej, leczenie FSK odwróciło antymelanogenne działanie karwedylolu poprzez zwiększenie poziomu cAMP.

2.3. Indeks melaninowy i barwienie immunohistochemiczne w hodowli ludzkiej skóry ex Vivo

Gęstość melanocytów naskórka i wskaźnik melaniny w skrawkach tkanek ludzkiej skóry ex vivo wykryto odpowiednio za pomocą barwienia Melan-A i Fontany-Massona. Karwedilol nie wpływał na liczbę Melan-A (plus)melanocytyw próbce poddanej działaniu karwedylolu plus promieniowanie UV (UVR) w porównaniu z próbką poddaną działaniu samego UVR (ryc. 3A). HMB45(plus)melanocyty mogą wskazywać, że aktywność melanocytów wzrosła po leczeniu UVR i była odwrotnie regulowana w dół po leczeniu karwedylolem (Figura 3B). Jednak zawartość melaniny była znacznie zmniejszona w próbkach leczonych karwedylolem plus UVR w porównaniu z próbkami poddanymi działaniu samego UVR (ryc. 3C). W celu obliczenia indeksu melaniny obliczono i porównano ułamek pola barwionego Fontany-Massona w całkowitej powierzchni między próbką wystawioną na UV a tą na karwedilol plus UVR (ryc. 3D). Lizaty komórkowe każdej próbki analizowano metodą Western blotassay, która wykazała, że ​​tyrozynaza, TRP1 i DCT zostały zwiększone przez UVR i obniżone przez traktowanie karwedylolem (Figura 3E). W rezultacie karwedylol znacznie obniżył indeks melaniny i białka związane z melanogenezą, wykazując swój antymelanogenny wpływ na ludzką skórę poddaną promieniowaniu UV.

3. Dyskusja

Melanina jest pigmentem odpowiedzialnym za kolor skóry i włosów i jest syntetyzowana w melanosomach przezmelanocyty. Chociaż melanina naskórkowa odgrywa ważną rolę ochronną przed promieniowaniem UV, to nadprodukcja i akumulacja melaniny w skórze powoduje uciążliwe zaburzenia hiperpigmentacyjne skóry, takie jak PIH, dyspigmentacja związana z fotostarzeniem, melasma i plamy soczewicowate [18, 26]. Dlatego też hamowanie melanogenezy było głównym celem zabiegów leczniczych i kosmetycznych dla piękna i zdrowia skóry. Podjęto znaczne wysiłki w celu zidentyfikowania nowych i skutecznych środków przeciwpigmentacyjnych. Jednak mechanizmy przeciwdziałania melanogenezie poszczególnych środków są obecnie niepewne i zostały ogólnie ocenione w komórkach mysich, co daje wyniki, które nie zawsze są zgodne z wynikami badań skórnych na ludziach [27,28]. Co więcej, ponieważ melanogeneza melanocytów jest ściśle regulowana przez keratynocyty i inne sąsiednie komórki, współhodowane komórki ludzkie lub ludzka skóra ex vivo są bardziej wiarygodnymi ustawieniami eksperymentalnymi do badania skutecznychbielenieagentów [29]. Większość środków wybielających skórę, pochodzenia naturalnego lub chemicznego, może powodować toksyczność lub podrażnienie skóry, które można przewidzieć w pewnym stopniu za pomocą testów żywotności komórek in vitro z melanocytami. W naszym badaniu karwedilol nie wykazywał cytotoksyczności, gdy był stosowany w umiarkowanych dawkach.

cistanche bienfaits

Miejscowe kremy hydrochinonowe mogą powodować niepożądane zaburzenia hipopigmentacji i toksyczność skórną [30–32]. Ponadto niektórebieleniekosmetyki mają katastrofalne skutki, wywołując hipopigmentację poprzez degradację białek tyrozynaz [33–35]. Środki wybielające mogą być stosowane w wyższych dawkach w zależności od użytkownika, aby zmaksymalizować wybielanie zmian hiperpigmentacyjnych. Dlatego też trwają badania nad odkryciem bezpiecznych i zdrowych środków wybielających skórę.

Dlatego niniejsze badanie zostało zaprojektowane do przeprowadzenia w normalnych komórkach ludzkich i ludzkiej skórze ex vivo. Ponadto, opierając się na ustalonym mechanizmie działania katecholamin w sygnalizacji G, który zwiększa komórkowy poziom cAMP, sądziliśmy, że bloker adrenergiczny może obniżać poziomy cAMP i hamować szlak sygnałowy UVR/cAMP/CREB, który jest głównym mechanizmem hiperpigmentacji skóry wywołanej przez UV [36,37]. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że blokery adrenergiczne, które obniżają poziom cAMP, zmniejszająsynteza melaniny.

Ponadto, aby rozwijać się bezpieczniebielenieleków, należy równolegle dążyć do wiarygodnych i odtwarzalnych mechanizmów przeciwdziałania melanogenezie. Najistotniejszym fizjologicznie bodźcem jest promieniowanie UV, a wśród sygnalizacji UVR do naskórkamelanocytyOś CREB jest najbardziej ustaloną ścieżką regulacji melanogenezy w ludzkim naskórku [29]. Ekspozycja na UV kolejno aktywuje produkcję cAMP, PKA i czynnik transkrypcyjny CREB, który z kolei indukuje ekspresję MITF i dalszych docelowych genów melanogennych [38, 39]. Oprócz fosforylacji CREB przez PKA, ostatnie badania wykazały, że rekrutacja koaktywatora transkrypcji regulowanego przez CREB (CRTC) 3 do kompleksu transkrypcyjnego CREB jest również wymagana dla MITF stymulowanego cAMP. MITFspełnia najważniejszą rolę w regulacjisynteza melaninyi powstałą transkrypcję enzymów melanogennych [26,40,41]. Podczas tego wewnątrzkomórkowego procesu sygnalizacji melanogeneza jest regulowana przez kluczowy enzym, tyrozynazę i dodatkowe białka enzymatyczne, takie jak TRP-1 i DCT [1–4]. W niniejszym badaniu karwedilol skutecznie zmniejszał fosforylację CREB, co wskazuje, że zmniejsza białka MITF i tyrozynazy poprzez hamowanie transkrypcji MITF (Figura 4). Biorąc pod uwagę, że regulacja genu mRNA MITF jest misternie kontrolowana i ratowana przez inne wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnalizacyjne i koaktywatory, regulacja poziomu transkrypcji MITF jest obiecującą strategią badania zdrowych składników wybielających skórę, ponieważ funkcja przeżycia MITF jest zachowana i uratowana [1,38,40]. Rzeczywiście, kiedy badaliśmy indukowaną przez FSK transkrypcję MITF, stwierdzono, że mRNA MITF ma swoją własną krzywą odpowiedzi szczytowej dla melanogenezy i przeżycia komórkowego dla homeostazy komórkowej. Funkcje biologicznemelanocytywydaje się być wewnętrznie regulowany przez inne sygnały zwrotne w ludzkich melanocytach. Co więcej, karwedylol ma mniejsze ryzyko wystąpienia działań niepożądanych związanych z hipopigmentacją, ponieważ osłabia aktywność komórkowej tyrozynazy w czasie, a nie nagle.

Katecholaminy obejmują dopaminę, epinefrynę i norepinefrynę i są syntetyzowane z tyrozyny zawartej w diecie pod wpływem enzymów [42]. Biosynteza i degradacja katecholamin zachodzi w szerokim zakresie komórek, w tym w neuronach nerwów współczulnych i mózgu, komórkach rdzenia nadnerczy, komórkach śródbłonka, neutrofilach i komórkach jednojądrzastych [43–45]. W skórze ludzkiej synteza katecholamin zachodzi w keratynocytach. Odwrotnie, melanocyty również wyrażają mRNA i enzymy do autokrynnej syntezy norepinefryny, ale nie epinefryny [7,42]. U człowiekamelanocyty, -1-AR może mieć znaczenie w reakcji na noradrenalinę, alesynteza melaninyma również wpływ na funkcjonalną 2-ARsygnalizację [7,8]. Co ciekawe, pacjenci z bielactwem nabytem mają zwiększoną gęstość 2-AR w keratynocytach [46]. Podwyższony poziom noradrenaliny stwierdza się w moczu i osoczu pacjentów z bielactwem niesegmentowym, co sugeruje, że metabolizm katecholamin może być związany z rozwojem i progresją bielactwa nabytego. [47]. Ponadto oprócz klasycznych neuroprzekaźników stresu melanocyty wytwarzają neuropeptydy i hormony, takie jak czynnik uwalniający kortykotropinę i proopiomelanokortyna. Produkcja ta jest stymulowana przez UVR i inne czynniki działające w obrębie układu neuroendokrynnego skóry [48]. Dlatego działanie katecholamin i funkcja melanocytów są ściśle powiązane w różnych złożonych szlakach. Ponadto karwedylol może zakłócać reakcje chemiczne w szlaku melanogenicznym i ta możliwość powinna być dalej badana. Karwedylol może mieć zalety, ponieważ ma jednoczesne działanie przeciwzapalne, ponieważ większość zaburzeń hiperpigmentacyjnych to PIH klinicznie lub subklinicznie u pacjentów z ciemną skórą. Ponieważ przenikanie karwedylolu przez skórę badano zarówno in vitro, jak i ex vivo, karwedilol można opracować jako miejscowo stosowanybielenieagenta w przyszłości [49–51].

Ogólnoustrojowe podawanie karwedylolu może powodować bradykardię, zawroty głowy, niedociśnienie, bóle głowy i oszołomienie. Miejscowe stosowanie karwedylolu zwykle nie powoduje objawów ogólnoustrojowych, jednak powinniśmy zwracać szczególną uwagę na te objawy, stosując go u pacjentów z wadami bariery skórnej, np. z atopowym zapaleniem skóry. Ponadto w rzadkich przypadkach podczas przyjmowania karwedylolu zgłaszane są egzema, świąd i wykwity liszajowate. Te dermatologiczne skutki uboczne, a także kontaktowe zapalenie skóry należy również wziąć pod uwagę podczas stosowania karwedylolu jako miejscowegobielenieagent.

Podsumowując, wykazaliśmy, że karwedilol skutecznie zmniejsza melanogenezę u człowiekamelanocytyoraz ludzka skóra ex vivo poprzez hamowanie szlaku cAMP/CREB/MITF, co sugeruje jej potencjalne zastosowanie jako skutecznego środka wybielającego. Należy przeprowadzić dalsze badania nad funkcjonalnym zaangażowaniem receptora adrenergicznego przez karwedilol w ludzkich melanocytach.

4. Materiały i metody

4.1. Materiały

Karwedilol, 3,4-dihydroksy-L-fenyloalaninę (L-DOPA), toksynę cholery (CT) i octan 12-tetradekanoiloforbolu-13-(TPA) zakupiono od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) i Dulbecco's Dulbecco's Modified Eagle's Medium oraz sól fizjologiczną buforowaną fosforanami zakupiono z WelGENE (Daegu, Korea). Płodową surowicę bydlęcą (FBS), antybiotyk przeciwgrzybiczy i trypsynę-EDTA zakupiono od Gibco (Grand Island, NY, USA). Medium 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, USA) i FSK ([3R-(3,4a,5,6,6a,10,10a,10b)]-5-(Acetyloxy)-3-etenylodekahydro{ {24}},10,10b-trihydroksy-3,4a,7,7,10a-pentametylo-1H-nafto[2,1-b]piran-1-on ) zakupiono od Tocris Bioscience (Bristol, Wielka Brytania).

4.2. Linie komórkowe i hodowla komórek

Pierwotne NHM otrzymane z Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) utrzymywano w pożywce 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) uzupełnionej suplementem wzrostu ludzkich melanocytów (Thermo Fisher). Komórki Mel-ab, pochodząca od myszy spontanicznie unieśmiertelniona linia komórkowa melanocytów, otrzymano z Koreańskiego Banku Linii Komórkowych (KCLB, Seul, Korea) i utrzymywano w DMEM uzupełnionej 10% FBS, penicyliną-streptomycyną, 100 nM TPA i 1 nM CT. Wszystkie komórki były rutynowo utrzymywane w temperaturze 37°C w wilgotnym środowisku 5% CO2.

4.3. Przeciwciała i Western Blots

Komórki przemyto raz zimnym PBS i poddano lizie w buforze do lizy białek (1 procent SDS w 10 mMTris i 5 mM EDTA, pH 7,4), a następnie inkubowano w 98°C przez 10 min. Próbki białka rozdzielono metodą elektroforezy w 8-procentowym żelu poliakrylamidowym SDS, przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA), a następnie zablokowano roztworem soli fizjologicznej buforowanej Tris, zawierającym 0,5% Tween 20 i 5% BSA, oraz poddane immunoblottingowi. Przeciwciała przeciwko tyrozynazie i TRP-1 zakupiono z Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA), a MITF zakupiono z Abcam (Cambridge, Wielka Brytania). -tubulinę (Gentex, Holandia, MI, USA) zastosowano jako wewnętrzną kontrolę obciążenia.

4.4. Zawartość melaniny

Działanie cytotoksyczne karwedylolu oceniano za pomocą zestawu Ez-Cytox Cell Viability Assay Kit (Dogen-Bio Co., Ltd., Seul, Korea) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki Mel-Ab i NHM wysiano na sześciostudzienkowych płytkach przy gęstości odpowiednio 6 × 105 i 3 × 105 komórek/studzienkę. Komórki traktowano karwedylolem, jak pokazano na figurach, przez 3 lub 5 dni (d). Przed pomiarem zawartości melaniny komórki obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym i fotografowano (Olympus, Tokio, Japonia). Komórki rozpuszczono w 550 µl 1 N NaOH w 100°C przez 30 min i odwirowano przy 13,000 obr./min przez 5 min. Absorbancję supernatantów mierzono przy 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wewnątrzkomórkową zawartość melaniny przedstawiono jako procent w stosunku do nietraktowanej kontroli komórek. Arbutynę (100 mg/ml) zastosowano jako kontrolę pozytywną.

4.5. Aktywność tyrozynazy komórkowej

Aktywność tyrozynazy oceniano, mierząc szybkość tworzenia dopachromu L-DOPA. Po inkubacji z karwedilolem komórki przemyto lodowatym PBS i poddano lizie w buforze do lizy tyrozynazy (bufor fosforanowy, pH 6,8, zawierający 1% Triton X{ {5}}) z powtarzanymi cyklami zamrażania/rozmrażania. Lizaty sklarowano przez odwirowanie przy 15,000 obr./min w 4◦C przez 10 min. Po określeniu ilościowym poziomów białka w lizacie i dostosowaniu stężeń białka buforem do lizy, 90 µl supernatantu zmieszanego z 10 µl 10 mM L-DOPA w buforze do lizy tyrozynazy inkubowano w temperaturze 37°C. 475 nm przy użyciu czytnika mikropłytek co 10 min przez co najmniej 1 godz. Arbutynę (100 mg/ml) zastosowano jako czynnik kontroli pozytywnej.

Herba Cistanches

4.6. Analiza immunohistochemiczna

Zatopione w parafinie tkanki skóry ludzkiej pocięto na skrawki o grubości 6- µm i wybarwiono Melan-A (Novocastra, Newcastle, Wielka Brytania), zestawami Fontana-Masson (laboratoria ID, Londyn, ON, Kanada) i HMB45 (Santa Clara , CA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Wskaźnik melaniny określono mierząc procent zabarwionego obszaru do całkowitego obszaru tkanki przy użyciu oprogramowania ImageJ 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.7. Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnie ± błąd standardowy średniej (SEM), a istotność statystyczną określono za pomocą niesparowanego testu t Studenta przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism5 (San Diego, CA, USA). W tym badaniu p < 0.05,="" p="">< 0.01="" i="" p="">< 0,001="" uznano="" za="" istotne="" statystycznie="" i="" są="" one="" reprezentowane="" przez="" *,="" **="" i="" ***,="">

Bibliografia

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ Melanogeneza i mechanizmy środków rozjaśniających skórę — Istniejące i nowe podejścia. wewn. J. Kosmetyczka. Nauka. 2011, 33, 210-221. [Odsyłacz] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; Nie, TK; Choi, KH; Chang, SE Leczenie melasmy i pozapalnej hiperpigmentacji za pomocą pikosekundowego 755-nm lasera aleksandrytowego u pacjentów azjatyckich. Anny. Dermatol. 2017, 29 779-781. [Odsyłacz] [PubMed]

3. Lee, YJ; Park, JH; Lee, DY; Lee, JH nabył obustronną dyspigmentację na twarzy i szyi: podejście odpowiednie klinicznie. J. Koreański Med. Nauka. 2016, 31, 2042-2050. [Odsyłacz] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Przebarwienia pozapalne związane z leczeniem soczewic słonecznych za pomocą lasera Q-Switched 532-nm Nd:YAG: Ankieta wieloośrodkowa.J. Dermatolog. Leczyć. 2017, 28, 447–451. [Odsyłacz] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie doustnego kwasu traneksamowego w celu zapobiegania przebarwieniom pozapalnym po laserze rubinowym z przełączaniem Q. Dermatol. Chirurg. 2011, 37, 605–610. [Odsyłacz] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Nieskuteczne leczenie opornej melasmy i pozapalnych przebarwień za pomocą lasera rubinowego Q-switched. J. Dermatol. Chirurg. Płk. 1994, 20, 592-597. [Odn.]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU Autokrynna biosynteza katecholamin i sygnał receptora beta-adrenergicznego promują pigmentację w ludzkich melanocytach naskórka. J. Dochodzenie. Dermatol.2004, 123, 346-353. [Odn.]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkowa, MR; Swanson, NN; Gardner, ML Indukcja układu transdukcji sygnału receptora alfa-1-adrenergicznego na ludzkich melanocytach. Do potęgi. Dermatol. 1996, 5, 20-23.[Odsyłacz]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lew-Tow, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.; Peavy, TR; i in. Ostre rany zmieniają sygnalizację beta2-adrenergiczną i szlaki syntezy katecholamin w keratynocytach. J. Dochodzenie. Dermatol. 2014, s. 134, 2258-2266. [Odn.]

10. Emery, AC Receptory katecholaminowe: Prototypy do odkrywania leków na podstawie GPCR. Przysł. Pharmacol. 2013, 68 335–356.

11. Czy Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Trzy generacje beta-blokerów: historia, różnice klasowe i zastosowanie kliniczne. Aktualn. Nadciśnienie. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: Przegląd właściwości farmakodynamicznych i farmakokinetycznych oraz skuteczności terapeutycznej. Narkotyki 1993, 45, 232–258. [Odsyłacz] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Wyraźne zaczerwienienie twarzy i uporczywy rumień trądziku różowatego skutecznie leczone przez karwedilol, nieselektywny bloker beta-adrenergiczny. J. Am. Acad. Dermatol. 2012, 67, 491-493. [Odsyłacz][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Długoterminowe leczenie wyraźnego zaczerwienienia twarzy i trwałego rumienia trądziku różowatego poprzez leczenie karwedylolem. J. Dermatolog. Leczyć. 2018, 29, 310–313. [Odsyłacz] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Jackson, EK; Andresena, BT; i in. Zapobieganie karcynogenezie skóry przez beta-bloker karwedilol. RakPoprz. Res. 2015, 8, 27-36. [Odsyłacz] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang S.; Shahid, A.; Andresena, BT; Huang, Y. Beta-bloker karwedilolu zapobiegał uszkodzeniom komórek naskórka myszy i 3D zrekonstruowanej ludzkiej skóry za pośrednictwem promieniowania ultrafioletowego. wewn. J.Mol. Nauka. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.; Andresen, BT; Huang, Y. Miejscowo stosowany karwedilol osłabia rakotwórczość skóry wywołaną promieniowaniem ultrafioletowym słonecznym. Rak Poprzedni. Res. 2017, 10, 598-606. [Odn.]

18. Brenner, M.; Słuch, VJ Ochronna rola melaniny przed promieniowaniem UV w ludzkiej skórze. Fotochem.Fotobiol. 2008, 84, 539-549.

19. Cleveland, KH; Liang S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolin hamuje mediowane przez EGF tworzenie kolonii JB6 P plus poprzez mechanizm niezależny od adrenoceptorów. PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [Odn.]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol hamuje migrację i inwazję złośliwych komórek piersi poprzez inaktywację Src z udziałem szlaku sygnałowego cAMP / PKA i PKCdelta. J. Cancer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrześniok, D. Od tyrozyny do melaniny: Szlaki sygnałowe i czynniki regulujące melanogenezę. Postepy Hi. Med. Dośw. Online 2016, 70, 695-708. [Odn.]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Och, SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Park, YS; Lee, J. Globular adiponektyna działa jako sygnał melanogenny w ludzkich melanocytach naskórka. Fr. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [Odsyłacz][PubMed]

23. Słomiński A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melanina pigmentacja skóry ssaków i jej regulacja hormonalna. Fizjol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Słomiński A.; mgr Żmijewski; Pawełek, J. L-tyrozyna i L-dihydroksyfenyloalanina jako hormonopodobne regulatory funkcji melanocytów. Czerniak z komórek pigmentowych Res. 2012, 25, 14–27. [Odsyłacz] [PubMed]

25. Howe, J.; Konstantyn R.; Słomiński, A. O domniemanym mechanizmie indukcji i regulacji melanogenezy przez L-tyrozynę. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150-152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, szlaki sygnalizacyjne ME w melanogenezie. wewn. J.Mol. Nauka. 2016, 17, 1144. [Odsyłacz]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Ty, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Park, SH; Kim, DW Ochronne działanie toksyny botulinowej na pigmentację skóry wywołaną promieniowaniem ultrafioletowym. Plast. Rekonstrukcja Chirurg. 2019, 144, 347–356. [Odsyłacz]

28. Jeong, YM; Och, WK; Tran, TL; Kim, WK; Śpiewane, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglikon Rh4 hamuje syntezę melaniny w komórkach czerniaka B16: możliwy udział szlaku kinazy białkowej A. Biosci. Biotechnologia. Biochem. 2013, 77, 119–125. [Odn.]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Hej, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. Potencjał terapeutyczny Rottlerin w zaburzeniach przebarwień skóry poprzez hamowanie aktywności transkrypcyjnej koaktywatorów transkrypcyjnych regulowanych przez CREB. J. Dochodzenie. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[Odsyłacz]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Chemiczna leukoderma spowodowana hydrochinonem: niezwykłe zjawisko. Indyjski J. Dermatol. Wenerol. Leprol. 2019, 85, 567. [Odsyłacz]

31. Jow, T.; Hantash, BM Depigmentacja wywołana hydrochinonem: Opis przypadku i przegląd piśmiennictwa. Zapalenie skóry 2014, 25, e1–e5. [Odn.]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Bielactwo i narażenie zawodowe na hydrochinon z serwisowania maszyn do samodzielnego fotografowania. Skontaktuj się z Dermatem. 1981, 7, 285-287. [Odsyłacz] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, związek fenolowy wywołujący depigmentację, wywiera cytotoksyczność melanocytów poprzez mechanizm zależny od tyrozynazy. Czerniak z komórek pigmentowych Res. 2014, 27, 754–763. [Odsyłacz] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya S.; Sato Y.; i in. Analiza kliniczna i epidemiologiczna w 149 przypadkach leukodermy indukowanej przez rododendrony.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [Odsyłacz] [PubMed]

35. Harris, JE Bielactwo wywołane chemikaliami. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151–161. [Odsyłacz] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Wpływ leczenia karwedylolem na ekspresję i fosforylację białka wiążącego element odpowiedzi cAMP serca w ostrym zapaleniu mięśnia sercowego wywołanym przez wirus Coxsackie B 3-. BMC Kardiovasc. Nieład. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Polimorfizmy Steinberga, SF S49G i R389G receptora beta(1)-adrenergicznego sygnalizujące poprzez szlaki cAMP-PKA i ERK. Fizjol. Genom. 2013, 45, 1186-1192. [Odn.]

38. Lee, AY; Noh, M. Regulacja melanogenezy naskórka poprzez szlaki sygnałowe cAMP i/lub PKC: spostrzeżenia na temat rozwoju środków z hipopigmentacją. Łuk. Farmacja Res. 2013, 36, 792–801. [Odn.]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, ścieżka cAMP i reakcja na słoneczne UV: rozszerzenie horyzontu poza pigmentację. Czerniak z komórek pigmentowych Res. 2014, 27, 699–720. [Odn.]

40. Lin, CB; Babiarz L.; Liebel, F.; Roydon Price, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, Niemcy; Seiberg, M. Modulacja ekspresji genu czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią zmienia pigmentację skóry.J. Dochodzenie. Dermatol. 2002, 119, 1330–1340. [Odn.]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Hej, H.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK hamuje melanogenezę poprzez ingerencję w regulowaną przez CREB koaktywator transkrypcji 3-zależną od ekspresji MITF. Teranostyka2020, 10, 4017-4029. [Odsyłacz] [PubMed]

42. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, w syntezie S.Catecholamine pośredniczy tyrozynaza pod nieobecność hydroksylazy tyrozynowej. J. Neurosci. 1999,19, 3519-3526. [Odsyłacz] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Marino, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogenna katecholaminsynteza, metabolizm, przechowywanie i wychwyt w ludzkich neutrofilach. Życie Sci. 1999, 64, 975-981. [Odn.]

44. Marino, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogenna synteza katecholamin, magazynowanie metabolizmu i wychwyt w ludzkich jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. Do potęgi. Hematol.1999, 27, 489–495. [Odn.]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Komórki śródbłonka Iaccarino, G. są zdolne do syntezy i uwalniania katecholamin zarówno in vitro, jak i in vivo. Nadciśnienie 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Frattini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Katecholaminy zwiększają mocz w przypadku bielactwa niesegmentalnego, szczególnie w fazie aktywnej. Komórka pigmentowa Res. 2003, 16, 111–116. [Odsyłacz][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Badanie struktury osobowości pacjentów z bielactwem i możliwym związkiem z zaburzeniami metabolizmu katecholamin. Dermatologia 1995, 190, 109-115. [Odsyłacz][PubMed]

48. Słomiński, A. Aktywność neuroendokrynna melanocytów. Do potęgi. Dermatol. 2009, 18, 760-763. [Odn.]

49. Gannu, R.; Wisznu, YV; Kiszan, W.; Rao, YM Przenikanie karwedylolu przez skórę świni in vitro: Wpływ nośników i środków wzmacniających penetrację. PDA J. Pharm. Nauka. Technol. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Opracowanie i ocena transdermalnego systemu dostarczania leku zawierającego karwedilol: badanie charakterystyki in vitro i in vivo. Dew. leków Farmacja ind. 2012,38, 1530-1537. [Odn.]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Rozwój i ocena plastrów przezskórnych z karwedilolem.Acta Pharm. 2007, s. 57, 151–159. [Odsyłacz] [PubMed]