Rozdział 1: Czynnik typu Krϋppel 15 hamuje proliferację komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych poprzez wzmocnienie koniugacji P53 SUMO1

Po więcej informacji. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakcyjny

Komórka mezangialna (MC)proliferacjajest kluczową patologiczną cechą wielu zwykłych ludzichoroby nerek, w tym mezangialne proliferacyjne zapalenie nerek i nefropatie cukrzycowe. Znajomość odpowiedzi MC na bodźce patologiczne ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia tych procesów chorobowych. Wcześniej ustaliliśmy, że czynnik podobny do Krüppela 15 (KLF15), wzbogacony w nerki czynnik transkrypcyjny palca cynkowego, był wymagany do hamowania proliferacji MC. W niniejszym badaniu zbadaliśmy bezpośredni gen docelowy i podstawowy mechanizm, za pomocą którego KLF15 regulował proliferację mezangialną. Najpierw zbadaliśmy mały modyfikator 1 związany z ubikwityną (SUMO1) jako bezpośredni cel transkrypcyjny KLF15 i potwierdziliśmy to odkrycie za pomocą testów ChlP-PCR i lucyferazy. Ponadto wykazaliśmy, że nadekspresja KLF15 lub SUMO1 zwiększyła stabilność P53, który blokował cykl komórkowy ludzkich MC nerkowych (HRMC), a zatem znosił proliferację komórek. Odwrotnie, knockdown SUMO1 w HRMC, nawet tych z nadekspresją KLF15, nie może hamować szybkości proliferacji HRMC i zwiększać SUMOilacji P53. Wreszcie, wyniki pokazały, że poziomy SUMOilowanego P53 w korze nerkowej szczurów modelowych anty-Thy 1 były obniżone w okresach proliferacji. Odkrycia te ujawniają kluczowy mechanizm, za pomocą którego KLF15 atakuje SUMO1 w celu pośredniczenia w proliferacji MC.

SŁOWA KLUCZOWE: KLF15, Proliferacja komórek mezangialnych, P53, SUMO1

Kliknij tutaj, aby poznać zaletycistanchei gdzie można kupić cistanche tubulosa

1| WPROWADZANIE

Komórki mezangialne (MC) stanowią około jednej trzeciej populacji komórek w kłębuszkach nerkowych. Odgrywają ważną rolę w homeostazie, utrzymując strukturę strukturalną kłębuszków, wytwarzając i utrzymując macierz mezangialną, regulując powierzchnię filtracji i fagocytując komórki apoptotyczne lub kompleksy immunologiczne.1 W wielu chorobach kłębuszków nerkowych, takich jak mezangialne proliferacyjne zapalenie nerek i nefropatie cukrzycowe MC są uszkodzone i przechodzą poważne zmiany fenotypowe, co skutkuje niekontrolowaną proliferacją mezangialną i nadmiernym odkładaniem się macierzy mezangialnej.2-4 Oprócz hiperproliferacji i zwiększenia produkcji białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i metaloproteinaz macierzy, MC mogą uwalniają czynniki zapalne, powodując stwardnienie kłębuszków nerkowych i zwłóknienie śródmiąższowe; dodatkowo nasilają uszkodzenie nerek i powodują progresję do nieodwracalnej schyłkowej choroby nerek. 5-Znajomość odpowiedzi MC na bodźce patologiczne ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii mających na celu zmniejszenie uszkodzenia nerek spowodowanego nieprawidłową proliferacją MC i opóźnienie progresji w schyłkową chorobę nerek.

Czynniki podobne do Krüppela (KLF) to grupa czynników transkrypcyjnych wiążących DNA palca cynkowego. Coraz więcej dowodów wskazuje, że ta rodzina bierze udział w różnych procesach komórkowych, takich jak różnicowanie komórek, przebudowa serca, hematopoeza i determinacja losu komórek macierzystych.8-10 Rodzina KLF składa się z osiemnastu członków, wśród których powszechnie występuje KLF15 wnerka, trzustka, serce,wątrobai mięśnie szkieletowe. Wcześniejsze badania wykazały, że KLF15 jest kluczowym regulatorem transkrypcji w różnych procesach fizjologicznych, w tym glukoneogenezie,odpowiedzi immunologiczne, oraz różnicowanie adipocytów.1-14 Nasze poprzednie badanie wykazało, że KLF15 jest niezbędny do hamowania proliferacji MC.15 Badanie to miało na celu wyjaśnienie bezpośredniego genu docelowego i mechanizmu dalszego, za pomocą którego KLF15 reguluje proliferację mezangialną.

2|MATERIAŁY I METODY

2.1 |Model przeciw zapaleniu nerek Thy1

Samce szczurów Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) ważące od 200 do 220 g losowo przydzielono do grup kontrolnych i anty-Thy1. Wszystkie szczury trzymano w ośrodku opieki nad zwierzętami w cyklu światło/ciemność 12/12 godzin ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. W trakcie eksperymentu przeprowadzono oceny i interwencje związane z dobrostanem. W sumie 28 szczurom wstrzyknięto mysie przeciwciało monoklonalne anty-Thy1, jak opisano wcześniej,16 i siedmiu wstrzyknięto sól fizjologiczną (kontrole). Kłębuszki oczyszczono z tkanki kory nerkowej metodą przesiewania. Surowice pobrano do pomiaru stężenia azotu mocznikowego i kreatyniny w surowicy. Szczury z modelu anty-Thy1 uśmiercono w dniach 0,3,5,7 i 10, po czym zebrano ich kłębuszki. Wszystkie procedury dotyczące dobrostanu zwierząt i procedury doświadczalne zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Narodowa Rada ds. Badań Naukowych USA, 1996).

2.2|hodowla i leczenie ludzkich nerek MC (HRMC)

Pierwotne HRMC nerkowe zakupiono od ScienCell (San Diego, CA). HRMC od trzeciego do szóstego pasażu utrzymywano w pożywce MC (MsCM; ScienCell) zgodnie z instrukcjami producenta. Do eksperymentów komórki hodowano do zlewności, wzrost zatrzymano w obniżonej surowicy (0,5% FBS) przez 24 godziny i podzielono na różne grupy doświadczalne.

W celu leczenia różnymi stężeniami glukozy, komórki inkubowano w MsCM zawierającym 5 mmol/L glukozy (normalna glukoza) lub 30 mmol/L glukozy (wysoki poziom glukozy, HG) przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni C. Komórki inkubowano w identycznych warunkach doświadczalnych warunki z 5 mmol/L glukozy i 25 mmol/L mannitolem zamiast 30 mmol/L glukozy zastosowano jako kontrole osmotyczne. W celu traktowania PDGF-BB, komórki inkubowano w MsCM zawierającym 20 ng/ml PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) przez 48 godzin w temperaturze 37°C.

2.3|Immunohistochemia (IHC)

Tkankę nerki zatopioną w parafinie pocięto na skrawki o grubości 4 µm i skrawki wybarwiono na IHC. Plastry inkubowano z 3 procentami H, O, w celu zablokowania endogennej peroksydazy po odparafinowaniu. Po odzyskaniu antygenu i zablokowaniu, skrawki inkubowano z przeciwciałami anty-KLF15 (ab81604, Abcam), anty-małym modyfikatorem 1 związanym z ubikwityną (SUMO1, ab32058, Abcam) i anty-PCNA (ab92552, Abcam) w 4 stopniach C Plastry następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem znakowanym peroksydazą chrzanową w temperaturze 37 stopni przez 30 minut i obserwowano reakcję immunohistochemiczną zgodnie z instrukcjami producenta z 3,3'-diaminobenzydyną (DAB, ORIGINE, CN) jako środkiem chromogennym . Następnie szkiełka wybarwiono kontrastowo hematoksyliną-eozyną i zobrazowano pod mikroskopem świetlnym (Olympus). Barwienie immunohistochemiczne oceniano za pomocą oprogramowania Image J zgodnie ze średnią wartością gęstości optycznej (AOD).

2.4|Immunoprecypitacja chromatyny (ChlP) z równoległym sekwencjonowaniem (ChIP-Seq)

ChIP przeprowadzono przy użyciu zestawu Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, HRMC ulegały nadekspresji z KLF15 lub mieszaniem przy gęstości komórek 2,0×103 komórek/ml i sieciowano 1,7% formaldehydem w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT ). Usieciowane komórki poddano lizie w celu uzyskania frakcji jądrowej, którą poddano sonikacji w buforze 1x ChIP. Lizaty sklarowano przez odwirowanie przy 9300×g przez 10 min w 4 stopniach. Próbki chromatyny inkubowano z przeciwciałem anty-KLF15 (ab81604, Abcam) lub przeciwciałem anty-lgG (kontrola tła) przez noc w 4 stopniach. Kompleksy związane z przeciwciałem wychwytywano przez inkubację z kulkami magnetycznymi z białkiem G. Biblioteki ChlP-Seq do sekwencjonowania przygotowano przy użyciu zestawu TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Biblioteki poddano równoległemu sekwencjonowaniu za pomocą sekwencera HiSeq2500 (Illumina) przy użyciu protokołu długości sekwencjonowania pojedynczego końca 50 bp. Surowe dane sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zostały przekształcone w pliki FASTQ przy użyciu oprogramowania CASAVA (wersja 1.8.2), a każdy zestaw danych został dopasowany do ludzkiego genomu referencyjnego (UCSC hg19) przy użyciu narzędzia Burrows-Wheeler Aligner (wersja 0.7.12). ).17 Wywołanie pików ChIP-Seq przeprowadzono przy użyciu programu MACS2 (wersja 2.0.1) z domyślnymi parametrami, ale z wartością aq 0,05, z danymi wejściowymi do odejmowania.18 Porównanie pików z zaszyfrowaną kontrolą (komórki rodzicielskie) próbki z nadekspresją przeprowadzono za pomocą Diffbind, pakiet R, przy użyciu algorytmu DeSeq2 i uznano, że wskaźnik fałszywego wykrywania wynoszący 0,1 wskazuje na istotność.1 Superwzmacniacze zidentyfikowano z zestawu pików wykrytych w HRMC traktowanych DMSO z superwzmacniaczem software ROSE.2 stopień Piki ChIP-Seq zostały opisane pakietem R ChlPpeakAnno, a promotory zdefiniowano jako regiony wzbogacone w KLF15-w odległości 1 kb od miejsca startu transkrypcji.21 Gen z miejscem startu transkrypcji najbliższym c Enter każdego super-wzmacniacza został zdefiniowany jako gen docelowy tego super-wzmacniacza.

2.5|ChIP-ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (ChlP-PCR)

Procedura ChlP-PCR była podobna do procedury opisanej powyżej. DNA ChIP z komórek traktowanych przeciwciałem anty-KLF15 zastosowano do wykrycia związku między KLF15 i SUMO1. DNA z komórek traktowanych przeciwciałem anty-IgG służyło jako kontrola. Oczyszczone DNA zastosowano do analizy proksymalnego regionu promotora SUMO1 metodą PCR w czasie rzeczywistym na ABI PRISM 7600 przy użyciu SYBR GreenER qPCR Supermix. Startery SUMO1 były następujące: forward: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';reverse:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Względną amplifikację sekwencji promotora genu obliczono stosując {{18 }} AcT, a normalizację przeprowadzono w stosunku do rozcieńczenia 1:100 wejściowego DNA.

2.6|Znakowanie komórek i stabilne znakowanie izotopowe za pomocą aminokwasów w analizie hodowli komórkowej (SILAC)

Komórki o 15% konfluencji wysiano w odpowiedniej pożywce kompletnej (dla HRMC: MsCM). Procedury znakowania i SILAC zostały opisane w poprzednich badaniach.22 W skrócie, po znakowaniu lizyną lekką (znakowaną 13C) lub ciężką (znakowaną 15N) oraz lekką (znakowaną 1c) lub ciężką (znakowaną 15N). )arginina, komórki transfekowano plazmidem z nadekspresją KLF15 lub plazmidem kontrolnym. Po traktowaniu komórki trypsynizowano i zliczano w celu uzyskania osadu komórkowego 2x10komórek/stan, a komórki poddano analizie SILAC przy użyciu spektrometrii masowej. Osady komórek ciężkich i lekkich poddano lizie w buforze radioimmunoprecypitacyjnym z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy przy użyciu krótkich 15-sekundowych impulsów sonikacyjnych. Lizaty wirowano przy 14 000 obr./min przez 20 minuty. Po odwirowaniu zebrano supernatanty i zmierzono stężenie białka za pomocą analizatora aminokwasów Hitachi L-8900. Z próbek przygotowano porcje po 200 ug białka, połączono i wytrącono metodą wytrącania metanol-chloroform. Osady białkowe zawieszono ponownie w buforze 8 mol/L mocznik/0,4 mol/L wodorowęglanu amonu, zredukowano 45 mmol/L DTT przez 30 minut w 37°C, alkilowano 100 mmol/L jodoacetamidem przez 30 minut w ciemności w RT i trawiono proteazą Lys-C (1:20 wag./wag.) przez noc (~16 godzin) w 37°C. Produkt trawienia Lys-C dalej rozcieńczano i trawiono trypsyną (1:20 wag./wag.) przez 8 godzin w 37°C. Fermentację odsolono za pomocą kolumny MacroSpin (The Nest Group, Inc) i osuszono w koncentratorze SpeedVac. Odsolone peptydy następnie wzbogacono fosfopeptydami, stosując żywicę z dwutlenku tytanu osadzoną w 10 µl końcówkach Glygen Corp）. Przepływy były zarezerwowane, a wzbogacone peptydy eluowano stosując stosunek wodorotlenku amonu do wody 1:33. Suszone SpeedVac frakcje przepływowe i elucyjne ponownie zawieszono w buforze A (0,1% mrówkokwasu w wodzie) i poddano analizie metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC/MS).

2.7| Test reporterowy podwójnej lucyferazy

Ludzki promotor SUMO1(NM_001005781) typu dzikiego z 1604 pz (-1474nt- plus 129nt)włącznie z potencjalnym miejscem wiązania (-205nt--199nt) uzyskano przy użyciu PCR amplifikować i subklonować do wektora podstawowego pGL3-(nr kat. E1751 Promega) z miejscami dla enzymów restrykcyjnych SacI i Bglll, nazwanego pGL3-WT-SU. Również miejsce wiązania -CACCCA- w promotorze SUMO1 zostało zmutowane do -CGTTTG-, nazwane pGL3-MT-SU. Plazmid (pReceiver-M94) zawierający ludzkie cDNA pełnej długości KLF15 otrzymano z GeneCopoeia. Plazmid nadekspresji KLF15 i pGL3-WT-SU lub pGL3-MT-SU transfekowano do komórek HEK293T odczynnikiem Lipofectamine 2000. Próbki następnie kotransfekowano plazmidem pRL-TK (nr kat. E2241, Promega) wyrażającym lucyferazę Renilla. Po 24 godzinach transfekcji komórki poddano lizie. Poziomy aktywności lucyferazy świetlika i Renilla badano stosując system podwójnego testu reporterowego lucyferazy (Biotek).

2.8 Przygotowanie |RNA, synteza cDNA i analiza RT-qPCR

Całkowity RNA wyekstrahowano przy użyciu TRlzol (Invitrogen) i oczyszczono przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA wytworzono przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA ProtoScript (New England Biolabs. Ilościową reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). Sekwencje oligonukleotydowe użyte do RT-qPCR przedstawiono w Tabeli 1.

2.9 |Test proliferacji komórek

Pełnej długości ludzkie cDNA SUMO1 (NM_003352.8) otrzymane z OriGene Technologies (Pekin, Chiny) wstawiono do plazmidu pCMV6-Entry (nr kat.: RC200633). Proliferację komórek analizowano za pomocą zestawu Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 Imaging Kit (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, komórki inkubowano w 6-studzienkowej płytce hodowlanej i transfekowano plazmidem kontrolnym KLF15 (Scramble, grupa VECTOR), plazmidem do nadekspresji KLF15 (ten sam powyżej, grupa KLF15), wektorem ekspresyjnym dla SUMO1 (grupa VECTOR), plazmid nadekspresji SUMO1 (grupa SUMO1), siRNA kontroli negatywnej (grupa SI CON), SUMO1 siRNA (grupa SI SUMO1), plazmid nadekspresji KLF15 z siRNA SUMO1 (grupa KLF15 plus SI SUMO1) lub plazmid nadekspresji KLF15 z siRNA kontroli negatywnej (grupa KLF15 plus SICON) przez 24 godziny. Następnie pożywkę zastąpiono pożywką uzupełnioną 20 ng/ml PDGF-BB na 48 godzin, a zoptymalizowane stężenie EdU 10 μmol/l dodano około 12 godzin przed stymulacją PDGF-BB. Po traktowaniu komórki utrwalano 4% formaldehydem, permeabilizowano 0,5% Triton X-100, przemywano 3% BSA w PBS, inkubowano z koktajlem reakcyjnym Click-iT⑧ przez 30 minut w RT i inkubowano z Bufor DAPIre-action przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy ochronie przed światłem. Komórki obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Olympus, Tokio, Japonia). Następnie jądra proliferujących komórek zabarwiono na czerwono.

2.10|Analiza Western blot i immunoprecypitacja (IP)

Komórki poddano lizie przy użyciu buforu RIPA (Thermo Scientific), a całkowite białko w supernatantach oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu do oznaczania białek BCA (Thermo Scientific). Analizę Western blot i IP przeprowadzono jak opisano wcześniej.23.24Do analizy Western blot zastosowano przeciwciało anty-KLF15 (AV32587, Merk), przeciwciało anty-SUMO1 (S8070, Merk) i anty- -aktyna (A5316, Sigma). Do analizy IP zastosowano przeciwciało anty-P53 (P5813, Merk).

2.11 |Analiza bioinformatyczna

Kandydaci z ChIP-Seq lub SILAC wykazywali co najmniej dwukrotne wzbogacenie w porównaniu z kontrolami. Analiza Gene Ontology (GO) została przeprowadzona za pomocą Bazy Danych Adnotacji, Wizualizacji i Zintegrowanego Wykrywania (DAVID; wersja 6.7). Wartości P dostosowano do testowania wielu hipotez przy użyciu metody Benjamini-Hochberg. Istotnie wzbogacone kategorie w podontologii funkcji i szlakach KEGG ze skorygowaną wartością P<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki wyrażono jako średnie ± SE. Wszystkie dane przeanalizowano przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 20.0; SPSS Inc) i porównano przy użyciu testu t-Studenta lub jednokierunkowej analizy ANOVA. Wartość P<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">