Abstrakcyjny:Donoszono, że korzenie Vitis amurensis mają potencjał wybielania skóry poprzez ocenę aktywności hamującej melanogenezę i tyrozynazę. W tym badaniu korzenie V. amurensis wykorzystano do szybkiego wybrania składników wybielających za pomocą LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem hamowania tyrozynazy oraz do optymalizacji procesu ekstrakcji do zastosowania jako materiału funkcjonalnego wybielającego skórę za pomocą metodologii odpowiedzi powierzchniowej. Wyniki pokazały, że korzenie V. amurensis wykazywały działanie hamujące tyrozynazę przez dwa oligomery stilbenu, ε-vinifera (1) i witaminę B (2), jak przewidywano za pomocą LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem biologicznym. Optymalne warunki ekstrakcji (stężenie metanolu 66 procent, objętość rozpuszczalnika 140 ml i czas ekstrakcji 100 minut) dla składników wybielających skórę ustalono z wydajnością 6,20 procent, a aktywność hamowania tyrozynazy wynosiła 87,27 procent. Zależność między każdym czynnikiem a odpowiadającą mu odpowiedzią została potwierdzona przez analizę korelacji Pearsona. Objętość rozpuszczalnika wykazywała wyraźny liniowy związek z wydajnością, a stężenie metanolu miało silny liniowy związek z aktywnością hamowania tyrozynazy dla związków 1 i 2, jak również ich kombinacji. Ogólnie rzecz biorąc, udowodniono, że LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem biologicznym ma potencjał skutecznego znajdowania nowych aktywnych składników, jak również znanych aktywnych składników; Witaminy można zaproponować jako nowy naturalny potencjalny środek wybielający.

Według odpowiednich badań,Cistanchejest pospolitym ziołem znanym jako „cudowne zioło przedłużające życie”. Jego głównym składnikiem jestcistanozyd, który ma różne efekty, takie jakprzeciwutleniacz, przeciwzapalny, Ipromocja funkcji odpornościowych. Mechanizm między cistanche aWybielanie skórypolega na działaniu przeciwutleniającym cistancheglikozydy. Melanina w ludzkiej skórze jest wytwarzana przez utlenianie tyrozyny katalizowane przeztyrozynaza, a reakcja utleniania wymaga udziału tlenu, więc wolne rodniki tlenowe w organizmie stają się ważnym czynnikiem wpływającym na produkcję melaniny. Cistanche zawieracistanozyd, który jest przeciwutleniaczem i może ograniczać wytwarzanie wolnych rodników w organizmie, hamując w ten sposób produkcję melaniny.

Kliknij Cistanche sprzedane w pobliżu

Po więcej informacji:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Słowa kluczowe:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS sprzężony z testem hamowania tyrozynazy; metodologia powierzchni odpowiedzi; Korelacja Pearsona

1. Wstęp

Melanina jest odpowiedzialna za kolor skóry i sierści ssaków oraz chroni skórę przed promieniami ultrafioletowymi, ale nadmierna produkcja melaniny i gromadzenie się melaniny w skórze powoduje przebarwienia skóry, takie jak piegi, melasma, plamy starcze, nabłonki i starcze plamy soczewicowate. Tyrozynaza, znana jako enzym oksydazy zawierającej miedź, odgrywa kluczową rolę w biosyntezie melaniny. Enzym katalizował dwie następujące po sobie reakcje utleniania: pierwszy etap to hydroksylacja L-tyrozyny do 3,4-dihydroksy-L-fenyloalaniny (L-DOPA), a drugi etap to utlenianie L-DOPA do dopachinon. Dopachinon jest wysoce reaktywną substancją, która może spontanicznie polimeryzować, tworząc melaninę [1–3]. W związku z tym inhibitory tyrozynazy można stosować w leczeniu chorób skóry związanych z hiperpigmentacją oraz jako środki wybielające skórę.

Vitis amurensis, dziko rosnący gatunek winorośli, występuje głównie w Azji (Korea, Chiny i Japonia). W pełni dojrzałe owoce są spożywane na surowo i zawierają obfite składniki odżywcze, takie jak sacharoza, glukoza, białko i witaminy, dlatego są wykorzystywane jako materiał do wina, soków, galaretek i dżemów. Dodatkowo jej liście wykorzystywane są w sałatkach [4]. Jego korzenie i łodygi były stosowane w tradycyjnej medycynie do leczenia raka, bólu nerwobólowego i bólu brzucha [5,6]. Jego korzenie składają się ze stylbenów (główny składnik), procyjanidyn, flflawonoidów, triterpenoidów i innych związków fenolowych. Do tej pory skład chemiczny korzenia był wystarczająco szczegółowo badany. W szczególności opisano różne oligomery stilbenu, w tym resweratrol, amurensynę A, witaminę A, (plus)-ε-vinifera, amurensyny C–M, ampelopsynę A, D i ampelopsynę E [6]. Metanolowy ekstrakt z korzenia wykazuje działanie antymelanogenne przeciwko melanogenezie indukowanej hormonem stymulującym melanocyty w komórkach B16F10 oraz utlenianiu 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (L-DOPA) przez tyrozynazę grzybową [7]. Dodatkowo ekstrakty z V. amurensis i ich związki aktywne wykazują działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, neuroprotekcyjne i przeciwnowotworowe [7–10].

LC-MS w połączeniu z testem biologicznym może jednocześnie potwierdzić profil chemiczny i aktywność biologiczną składników w produktach naturalnych bez konieczności ekstrakcji i izolacji. Dlatego od niedawna jest wykorzystywana do sprawnej i szybkiej identyfikacji związków bioaktywnych w produktach naturalnych [11–13].

Optymalizacja to proces, który pozwala na uzyskanie maksymalnej wydajności eksperymentalnych systemów lub produktów. Metodologia powierzchni odpowiedzi (RSM), analiza wielowymiarowa, projektowanie eksperymentów z wykorzystaniem technik matematycznych i statystycznych w oparciu o modele empiryczne oraz wyrażanie korelacji między projektem eksperymentu a wynikami w postaci funkcji wielomianowej to tylko niektóre techniki, które zapewniają idealne warunki optymalizacji przy maksymalnej wydajności. RSM to dokładna i wydajna metoda optymalizacji szeroko stosowana w różnych dziedzinach, w tym w przetwórstwie spożywczym, chemii, biologii i rolnictwie [14–16]. W ostatnich dziesięcioleciach wzrosło zainteresowanie farmaceutykami, kosmetykami i żywnością funkcjonalną zawierającą produkty naturalne; w związku z tym trwają badania zarówno w środowisku akademickim, jak iw przemyśle, mające na celu opracowanie takich produktów [17,18]. Pierwszym krokiem w tych badaniach jest ekstrakcja składnika bioaktywnego z produktów naturalnych. W tej chwili, ponieważ wiele czynników, takich jak czas ekstrakcji, temperatura, stosunek ciecz-ciało stałe i objętość rozpuszczalnika wpływa na wyekstrahowane składniki, wymagana jest optymalizacja ekstrakcji składników bioaktywnych do maksimum.

O ile nam wiadomo, rzadko donoszono o składnikach hamujących tyrozynazę i optymalizacji ekstraktów z korzeni V. amurensis [5,19]. Dlatego niniejsze badanie miało na celu szybkie uzyskanie inhibitora tyrozynazy z korzeni V. amurensis za pomocą LC-Q-TOF-MS sprzężonego z testem hamowania tyrozynazy oraz optymalizację warunków ekstrakcji w celu poszerzenia wykorzystania korzeni V. amurensis jako środka wybielającego skórę przez RSM.

2. Wyniki i dyskusja

2.1. LC-QTOF MS w połączeniu z testem hamowania tyrozynazy z użyciem ekstraktu z korzenia V. amurensis

8 0 procentowy ekstrakt MeOH z korzenia V. amurensis wykazywał znaczącą aktywność hamowania tyrozynazy (80,7 ± 0,8 procent przy 50 µg/ml, Tabela S1). Aby zidentyfikować związki hamujące tyrozynazę w korzeniu V. amurensis bez izolacji, przeprowadzono LC-QTOF-MS sprzężony z testem hamowania tyrozynazy. Profil chemiczny ekstraktu z korzenia V. amurensis uzyskano w pierwszym przebiegu (ryc. S1), a związki bioaktywne zidentyfikowano za pomocą testu hamowania tyrozynazy frakcji zbieranych co 30 s od drugiego przebiegu (ryc. 1). Na chromatogramie masowym były dwa piki między 19 a 22 minutami, które miały mieć znaczącą aktywność hamującą tyrozynazę, a ich struktury zidentyfikowano jako dimer stilbenu (1) i tetramer stilbenu (2) przy użyciu profilowania chemicznego (Tabela 1).

2.2. Identyfikacja składników hamujących tyrozynazę korzenia V. amurensis

Najpierw z frakcji EtOAc wyizolowano dwa składniki, które prawdopodobnie będą miały działanie hamujące tyrozynazę, i oceniono ich bioaktywność. Struktury wyizolowanych związków 1 i 2 zidentyfikowano odpowiednio jako ε-vinifera (1) [20,21] i witaminę B ( -vinifera, 2) [21–23], stosując 1H-NMR, 13C-NMR i ESI-MS (Rysunek 2, Ryciny S2 i S3 oraz Tabela S2). W teście hamowania tyrozynazy wartości IC50 związków 1, 2 i kwasu kojowego wynosiły odpowiednio 3,51, 10,74 i 27,09 uM. Oba związki wykazywały silniejsze działanie hamujące tyrozynazę niż kontrola pozytywna, kwas kojowy, który jest znanym składnikiem wybielającym skórę (tabela 1 i rysunek S4). We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że ε-vinifera (1) ma działanie hamujące tyrozynazę [23]; jednak witamina B (2) została po raz pierwszy zidentyfikowana w naszym badaniu.

Podsumowując, wyniki, skorelowane z przewidywanymi danymi LC-MS w połączeniu z testem hamowania tyrozynazy i witaminą B (2), wykazują potencjał jako nowy inhibitor tyrozynazy. Ponadto przeprowadzono badania dokowania molekularnego, aby potwierdzić wynik znaczącej aktywności hamującej tyrozynazę dwóch oligomerów stilbenu. Jak pokazano w Tabeli 1, związki 1 i 2 wykazały wyższy wynik dokowania niż kontrola pozytywna, kwas kojowy, zgodnie z naszymi danymi eksperymentalnymi. Jednak wyniki dokowania związków były sprzeczne z naszymi wynikami eksperymentalnymi. Sposoby oddziaływania związków 1 i 2 opisano na rycinie 3. Związek 1 tworzył 4 wiązania wodorowe, 2 oddziaływania hydrofobowe i 1 oddziaływanie typu pi-lon, a związek 2 tworzył 11 wiązań wodorowych, 7 oddziaływań hydrofobowych, 1 oddziaływanie van der Waalsa i 3 interakcje pi-lone pair. W rezultacie potwierdzono, że związki mogą być wstawiane w miejsce aktywne docelowego białka i wiązać się z katalitycznymi resztami aminokwasowymi, które mogą hamować aktywność tyrozynazy. Dodatkowo, ε-vinifera (1) jest opisywana jako konkurencyjny inhibitor, który wiąże się z tym samym miejscem, w którym L-DOPA wiąże się z tyrozynazą [23]. Zaobserwowano, że witamina B (2) wiąże się w tym samym miejscu co ε-vinifera (1), co potwierdziło, że witamina B (2) jest nowym konkurencyjnym inhibitorem.

2.3. Optymalizacja ekstrakcji korzeni V. amurensis za pomocą RSM

Aby wykorzystać korzenie V. amurensis jako wybielający skórę materiał funkcjonalny, Box-Behnken design (BBD) zaprojektował optymalne warunki ekstrakcji, aby zmaksymalizować wydajność ekstrakcji i aktywność hamowania tyrozynazy. Wpływ niezależnych odpowiedzi, takich jak wydajność ekstrakcji, aktywność hamowania tyrozynazy, ilość związku 1, ilość związku 2 oraz suma ilości związków 1 i 2, na trzy zmienne niezależne (czas ekstrakcji, stężenie MeOH/woda i objętość rozpuszczalnika), zmierzono (Tabela 2). Zakres zmiennych ustalono jako czas ekstrakcji (40, 70 i 1{25}} min), stężenie MeOH (40, 70 i 1{29}} procent) oraz objętość rozpuszczalnika ( 35, 87,5 i 140 ml) na podstawie wstępnego eksperymentu jednoczynnikowego (dane nie pokazane). Wartości uzyskane z zaprojektowanych eksperymentów wyrażono jako wielomiany korelacji między zmiennymi za pomocą analizy regresji (tabele S4–S13 i rysunek S5). W wyniku przeprowadzenia indywidualnej optymalizacji dla każdej reakcji (Tabela 3), oczekiwano, że wydajność wyniesie 6,21% po ekstrakcji 100.{35}} min, MeOH 64,78%, 140.{{42} } ml. Aktywność hamowania tyrozynazy (procent) ekstrahowano w warunkach 65,22 min, MeOH 100,{49}} procent, 140,{51}} ml i przewidywano, że wykaże ona wartość 90,37 procent. Ilość związku 1 w 65,74 minucie, MeOH 100,{65}} procent, 35,00 ml przewidywano jako 37,45 µg/mg, a ilość związku 2 w 70,00 minucie, MeOH 70,00 procent i 92,24 ml przewidywano jako 86,77 µg/mg. Ponadto oczekiwano, że całkowita zawartość związków 1 i 2 wykaże maksymalną wartość 108,10 ug/mg po ekstrakcji w warunkach 75,20 min, MeOH 100,00 procent i 35,00 ml. Eksperymenty oparte na zoptymalizowanych warunkach dały 6,19 ± 0,36 procent, aktywność hamowania tyrozynazy 91,72 ± 3,48 procent, zawartość związku 1 36,54 ± 1,78 µg/mg, zawartość związku 2 85,74 ± 16,57 µg/mg, a suma związków 1 i {{85} } 0,10 ± 19,11 µg/mg, a indywidualne odpowiedzi dla każdej zmiennej wykazywały różnicę 5 procent lub mniej od teoretycznie przewidywanych wartości. Przeprowadzono optymalizację wielu odpowiedzi, aby zmaksymalizować wydajność ekstrakcji i aktywność hamowania tyrozynazy (Tabela 3). Zoptymalizowane warunki były następujące: czas ekstrakcji, 100 min; stężenie MeOH, 66,38 procent; i objętość rozpuszczalnika, 140 ml. W tych warunkach określono wydajność na 5,95 ± 1,13 procent, a aktywność hamowania tyrozynazy na 85,93 ± 1,57 procent; wartości te były zbliżone do wartości przewidywanych, odpowiednio 6,20 i 87,25%. Dodatkowo korelację między każdą zmienną a odpowiadającą jej odpowiedzią analizowano za pomocą korelacji Pearsona (Tabela 4). Wydajność ekstrakcji wykazała wyraźną zależność liniową między czasem ekstrakcji a stężeniem MeOH oraz ujemną zależność liniową od ilości związku 1. Dodatkowo aktywność hamowania tyrozynazy wykazała silną liniową zależność między ilością związku 2 a ilością sumy związków 1 i 2 oraz wyraźną liniową zależność ze związkiem 1. Zatem aktywność hamująca tyrozynazę korzenia V. amurensis była proporcjonalna do obu związków 1 i 2, ale wykazywała silniejszy liniowy związek z ilością związku 2 niż związek 1.

3. Materiały i metody

3.1. Ogólne procedury eksperymentalne

Średniociśnieniową chromatografię cieczową (MPLC) przeprowadzono stosując Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Szwecja). Jeden system jest wyposażony w pompę do wysokosprawnej chromatografii błyskawicznej (HPFC), detektor o zmiennej długości fali i kolektor. Widma NMR uzyskano przy użyciu spektrometru Bruker SPECTROSPIN 300 MHz (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Metanol-d4, rozpuszczalnik NMR, zakupiono od Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Acetonitryl (ACN), wodę i metanol (MeOH) czystości chromatograficznej zakupiono od ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Republika Korei). L-tyrozynę, grzybową tyrozynazę, kwas kojowy i kwas mrówkowy zakupiono od Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA).

3.2. Materiał roślinny

Korzeń V. amurensis otrzymano z Gyeongbuk w Korei, a także zakupiono od Omniherb (Daegu, Republika Korei). Zostały zidentyfikowane przez dr prof. Ki Yong Lee z College of Pharmacy na Korea University. Próbka kuponu (KUP-HD071) została zdeponowana w Laboratorium Farmakognozji, College of Pharmacy, Korea University.

3.3. Spektrometria masowa LC-Q-TOF

LC przeprowadzono przy użyciu serii Agilent 126{6}} (Agilent, Santa Clara, CA, USA) składającej się z pompy binarnej, odgazowywacza online, autosamplera, termostatycznie kontrolowanego przedziału kolumny i detektora z matrycą fotodiod. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono stosując kolumnę Shiseido CapCell PAK C18 (5 urn, 4,6 mm, ID x 15 0 nm). Faza ruchoma składała się z wody (rozpuszczalnik A) i ACN (rozpuszczalnik B), oba zawierające 0,1% kwasu mrówkowego. Warunki gradientu były następujące: 0–5 min, 10 procent B, 5–30 min i liniowy wzrost B od 10 do 90 procent. Współczynnik towarzysza ustawiono na 0,6 ml/min; 5 µl i 20 µl próbek wstrzyknięto odpowiednio do analizy LC-Q-TOF-MS i LC-Q-TOF-MS sprzężonej z testem hamowania tyrozynazy. Spektrometrię mas przeprowadzono stosując spektrometr masowy Agilent 6530 Q-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, USA) z interfejsem jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI) w trybie ujemnym. Dane o zakresie mas od m/z 50–1{44}}0 zostały zebrane w trybie centroidowym. Parametry masy były następujące: napięcie kapilarne, 4000 V; ciśnienie nebulizatora, 40 psi; napięcie fragmentacyjne, 175 V; napięcie odpieniacza, 65 V; temperatura gazu suszącego, 325 ◦C; inna szybkość gazu suszącego, 12,0 l/min; energia zderzenia 10, 20, 30 i 40 eV. Dostosowanie parametrów akwizycji i przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu akwizycji danych LC-MS / MS przy użyciu serii 6530 Q-TOF (wersja B.05.00) (oprogramowanie MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

3.4. LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem hamowania tyrozynazy

LC-Q-TOF-MS sprzężony z testem hamowania tyrozynazy przeprowadzono stosując metodę ustaloną w poprzednim badaniu [24]. W skrócie, test przebiegał w dwóch seriach. W pierwszym przebiegu profil chemiczny próbki uzyskano za pomocą LC-Q-TOF-MS. W kolejnym przebiegu eluat po przejściu przez układ LC w określonych warunkach LC-Q-TOF zbierano co 30 s do 96-płytek studzienkowych. Aktywność hamowania tyrozynazy zebranych frakcji oceniano za pomocą testu hamowania tyrozynazy.

3.5. Izolacja związków hamujących tyrozynazę z korzenia V. amurensis

W celu izolacji związków hamujących tyrozynazę, zidentyfikowanych za pomocą LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem hamowania tyrozynazy, korzeń V. amurensis (3,01 kg) ekstrahowano trzykrotnie 80 procentami MeOH przez 60 min w temperaturze pokojowej za pomocą ultradźwięków. Wyekstrahowany rozpuszczalnik przesączono i zatężono, otrzymując surowy ekstrakt (215,7 g), który zawieszono w wodzie i kolejno rozdzielono przy użyciu n-heksanu, octanu etylu (EtOAc) i n-BuOH. Frakcję EtOAc (25,85 g) poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując n-heksan:EtOAc w warunkach gradientu (20:1 → 0:1) uzyskując siedem frakcji (E1 – E7). Frakcję E4 ​​rozdzielono przy użyciu MPLC i 100 g SNAP KP-Sil, wkładu z żelu krzemionkowego i dichlorometanu: MeOH w warunkach gradientu (97:3 → 0:100), uzyskując siedem podfrakcji (E4–1 do E4–7) . Związek 2 (417,0 mg) otrzymano z E4-5. Podfrakcję E4–4 ponownie chromatografowano na MPLC przy użyciu SNAP 25 g Ultra, wkładu z żelem krzemionkowym i chloroform:MeOH:H2O w warunkach gradientu (50:4:1 → 15:4:1), uzyskując siedem frakcji ( E4–4–1 do E4–4–7). Związek 1 (396,0 mg) otrzymano z E4-4-5, który obserwowano jako pojedynczą plamkę na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC).

3.6. Test hamowania tyrozynazy

Aktywność hamowania tyrozynazy oceniano metodą opisaną wcześniej z niewielką modyfikacją [25]. Dwa mikrolitry próbki i 50 µl 0,1 U/µl tyrozynazy grzybowej umieszczono w 96- płytkach studzienkowych i inkubowano w temperaturze 37°C. Po 15 minutach dodano 50 µl 1 mM L-tyrozyny, a następnie prowadzono reakcję w temperaturze 37°C przez 15 minut. Ilość utworzonego dopachromu mierzono przy 495 nm przy użyciu czytnika mikropłytek Spectra Max 19 {{2{23}}}} (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Aktywność hamowania tyrozynazy obliczono przy użyciu następującego równania: hamowanie tyrozynazy (procent)=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, gdzie S to absorbancja próbki, tyrozynazy i L -tyrozyna; S0 oznacza absorbancję próbki i L-tyrozyny; C to absorbancja tyrozynazy i L-tyrozyny, a C0 to absorbancja L-tyrozyny. Kwas kojowy, znany inhibitor tyrozynazy, zastosowano jako kontrolę pozytywną. Wartości IC50 obliczono przy użyciu GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

3.7. Badania dokowania molekularnego

Dokowanie molekularne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) ze strukturami krystalicznymi PPO3, tyrozynazy z Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Wszystkie cząsteczki wody z białka docelowego zostały usunięte, a przygotowanie ligandu przeprowadzono zgodnie z protokołem przygotowania „sanitize” w SYBYL-X 2.1.1. Powinowactwo białko-ligand obliczono za pomocą pola siłowego Tripos i wyrażono jako wyniki całkowite. Zadokowaną pozę ligandu z kompleksu białko-ligand zwizualizowano w programie Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co., San Diego, CA, USA).

3.8. Projekt eksperymentalny i analiza statystyczna

Zoptymalizowane warunki ekstrakcji składników o maksymalnej aktywności hamowania tyrozynazy z korzenia V. amurensis zostały ustalone przy użyciu BBD z trzema zmiennymi i trzema poziomami (oprogramowanie statystyczne MINITAB wersja 14.12.{2}}). Na podstawie wstępnych wyników eksperymentu jednoczynnikowego wybrano zmienne niezależne obejmujące czas ekstrakcji (X1), stężenie MeOH i wody (X2) oraz objętość cieczy (X3) oraz zakres ich zmiennych (tabela S3). Zmienne dla RSM zostały zakodowane przy użyciu trzech poziomów, -1, 0 i 1. Ogółem zaprojektowano 15 eksperymentów, w tym 3 powtórzenia w środku projektu (Tabela 2). Jako niezależne odpowiedzi zmierzono wydajność (w procentach), aktywność hamowania tyrozynazy (w procentach), ilość związku (1) (µg/mg) i ilość związku (2) (µg/mg). Aktywność hamującą tyrozynazę ekstraktu oceniano przy stężeniu 50 µg/ml. Każda odpowiedź jest wyrażona za pomocą następującego równania wielomianowego drugiego rzędu:

gdzie R oznacza odpowiedź; 1, 2 i 3 to współczynniki liniowe; 12, 23 i 13 to współczynniki interakcji między trzema zmiennymi; a 11, 22 i 33 to współczynniki kwadratowe.
Ponadto przeprowadzono analizę korelacji Pearsona w celu określenia istnienia liniowej zależności między każdą zmienną a odpowiedzią. Współczynnik korelacji Pearsona ma silną liniową zależność między {{0}},7 a 1,0, wyraźną zależność liniową między 0,3 a 0,7, słaba zależność liniowa między {{10}},1 a 0,3 oraz brak lub nieistotna zależność liniowa między 0,0 a 0,1. Dodatnia i ujemna korelacja jest wyrażana w zależności od tego, czy współczynnik korelacji Pearsona jest dodatni, czy ujemny.

3.9. Analiza ilościowa związków hamujących tyrozynazę 1 i 2

Ilość każdego związku 1 i 2 w ekstraktach otrzymanych w zaprojektowanych 15 warunkach doświadczalnych zmierzono za pomocą krzywych kalibracyjnych (Tabela 2). Krzywe kalibracji dla związków 1 i 2 wyznaczono przy użyciu powierzchni pod krzywą chromatogramu UV (33 0 nm uzyskanych odpowiednio przy stężeniach 0,1–1000 µg/ml i 7,81–1000 µg/ml). LC przeprowadzono przy użyciu systemu Waters 2695 LC (Waters, Santa Clara, CA, USA) w tych samych warunkach, co system LC wyszczególniony w Materiałach i metodach, spektrometria mas LC-Q-TOF.

4. Konkluzje

ε-Viniferin (1) i witamina B (2) z korzeni V. amurensis scharakteryzowano jako składniki wybielające skórę przy użyciu LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem hamowania tyrozynazy. W szczególności witamina B (2) została po raz pierwszy zidentyfikowana jako związek hamujący tyrozynazę w tym badaniu, a ε-vinifera (1) i witamina B (2) wykazały silniejsze działanie hamujące tyrozynazę niż kontrola pozytywna, kwas kojowy. Warunki optymalizacji przy maksymalnym działaniu hamującym tyrozynazę i wydajności korzeni V. amurensis ustalono na podstawie czasu ekstrakcji (100 min), stężenia MeOH (66,38 procent) i objętości cieczy (140 ml). Wynik wykazał dobrą zgodność między wartościami doświadczalnymi i przewidywanymi. W rezultacie LC-Q-TOF-MS w połączeniu z testem biologicznym dowiodło potencjału skutecznego znajdowania nowych składników aktywnych, jak również znanych składników aktywnych, witaminy B (2), którą można zaproponować jako nowy naturalny potencjalny środek wybielający.

Materiały uzupełniające: Poniższe są dostępne online, rysunek S1: chromatogram MS w trybie jonizacji ujemnej (A); Chromatogram UV przy 280 nm (B) ekstraktów z korzeni V. amurensis, Rycina S2: Widma 1H i 13C-NMR związku 1 (300 i 75 MHz, CD3OD), Rycina S3: Widma 1H i 13C-NMR związku 2 (300 i 75 MHz, CD3OD), Rycina S4: Wykres sigmoidalny i IC50 kontroli pozytywnej, związki 1 i 2, Rycina S5: Wykresy powierzchni i konturów odpowiedzi pokazujące wpływ parametrów ekstrakcji (X1: czas ekstrakcji, min; X2: Stężenie MeOH, procent; X3: objętość rozpuszczalnika, ml). (A) wydajność; (B) aktywność hamowania tyrozynazy; (C) związek 1; (D) związek 2; (E) suma związków 1 i 2, Tabela S1. Aktywność hamująca tyrozynazę ekstraktów z korzeni V. amurensis, Tabela S2: Dane 1H- i 13C NMR związków 1 i 2 w CD3OD (δ w ppm), Tabela S3: Zmienne niezależne i poziomy dla metodologii powierzchni odpowiedzi, Tabela S4: Szacunkowa regresja współczynnik wydajności, Tabela S5: Analiza wariancji wydajności, Tabela S6: Szacowany współczynnik regresji dla aktywności hamowania tyrozynazy, Tabela S7: Analiza wariancji aktywności hamowania tyrozynazy, Tabela S8: Szacowany współczynnik regresji dla związku 1, Tabela S9: Analiza wariancja dla związku 1, Tabela S10: Oszacowany współczynnik regresji dla związku 2, Tabela S11. Analiza wariancji dla związku 2, Tabela S12: Oszacowany współczynnik regresji dla sumy związków 1 i 2, Tabela S13: Analiza wariancji dla sumy związków 1 i 2.
Autorskie Wkłady: Konceptualizacja, KYL; metodologia, K.-EO, HS i KYL; oprogramowanie, K.-EO i HS; walidacja, HS; analiza formalna, K.-EO i HS; dochodzenie, K.-EO, HS, MKL i KYL; przechowywanie danych, K.-EO, HS, BP i KYL; pismo — opracowanie pierwotne projektu, K.-EO i HS; pisanie — recenzja i redakcja, HS, MKL, BP i KYL; nadzór, MKL, BP i KYL Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.
Finansowanie: Badania te były wspierane przez grant National Research Foundation of Korea finansowany przez rząd Korei (NRF-2017R1A2B4003403 i NRF-2019R1A6A1A03031807) oraz grant Korea Health Technology R&D Project za pośrednictwem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (HF20C0038).
Oświadczenie o dostępności danych: Dane przedstawione w tym badaniu są dostępne w materiale dodatkowym.
Konflikt interesów:Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Dostępność próbki: Niedostępne

Bibliografia

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-połączony z triazolem 5-benzylideno(tio)barbiturany jako nowe inhibitory tyrozynazy i zmiatacze wolnych rodników. Łuk. Farmacja 2020, 353, 2000058. [Odsyłacz] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, HY-Y; Lin, H.-C. Identyfikacja 6, 7, 40 - trihydroksyizoflawonu jako silnego inhibitora tyrozynazy. Biologia. Biotechnologia. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Inhibitor tyrozynazy z otrębów z czarnego ryżu. J. Agric. Chemia spożywcza. 2003, 51, 6953–6956. [Odnośnik]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Pieśń, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Przegląd chemii i farmakologii. Fitomedycyna 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Och, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Kwas betulinowy wyizolowany z korzenia Vitis amurensis hamuje melanogenezę wywołaną przez 3-izobutyl-1- metyloksantynę poprzez regulację szlaków MEK/ERK i PI3K/Akt w komórkach B16F10. Chemia spożywcza. Toksykol. 2014, 68, 38–43. [Odnośnik]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Zawieszony, Dakota Północna; Bae, K. Aktywność hamująca działanie przeciwutleniające i lipooksygenazy oligostilbenów z liści i łodyg Vitis amurensis. J. Etnofarmakol. 2009, 125, 304–309. [Odnośnik]

7. Jin, K.-S.; Och, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht korzeń hamował melanogenezę indukowaną hormonem stymulującym melanocyty w komórkach B16F10. Nutr. Rez. ćwiczyć. 2014, 8, 509–515. [Odnośnik]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH Oligomery resweratrolu z Vitis amurensis osłabiają wywołany amyloidem stres oksydacyjny w komórkach PC12. Biol. Farmacja Byk. 2007, 30, 1130–1134. [Odnośnik]

9. Lee, EO; Lee, H.-J.; Hwang, HS; Ahn, KS; Chae, C.; Kang, KS; Lu, J.; Kim, S.-H. Silne hamowanie wzrostu raka płuc Lewisa przez heksanol A z korzeni Vitis amurensis poprzez działania apoptotyczne i antyangiogenne. Rakotwórczy 2006, 27, 2059–2069. [Odnośnik]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, HS; czerwiec, M.; Jeong, W.-S. Działanie przeciwzapalne procyjanidyn z nasion dzikich winogron (Vitis amurensis) w komórkach RAW 264.7 indukowanych LPS. Utleniony. Med. Komórka. Longev. 2013, 2013. [Odsyłacz]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Identyfikacja składników przeciwutleniających z Polygonum aviculare przy użyciu LC-MS w połączeniu z testem DPPH. Nat. Szturchać. nauka 2016, 22, 64–69. [Odnośnik]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Charakterystyka hamujących składników produkcji NO z Catalpa ovata przy użyciu LC-MS w połączeniu z testem komórkowym. Bioorg. chemia 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Wysokosprawna chromatografia cieczowa ze sprzężonym UV on-line, spektrometrią mas i detekcją biochemiczną do identyfikacji inhibitorów acetylocholinoesterazy z produktów naturalnych. J. Chromatograf. 2000, 872, 61–73. [Odnośnik]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, PE; Villar, LS; Escaleira, LA Metodologia powierzchni odpowiedzi (RSM) jako narzędzie optymalizacji w chemii analitycznej. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka K.; Podstawczyk D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Zastosowanie metodologii powierzchni odpowiedzi i metod sztucznych sieci neuronowych w modelowaniu i optymalizacji procesu biosorpcji. Biosurowiec. Techno. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Projekt eksperymentu I. Badanie przesiewowe. Analityk Trendów. chemia 1996, 15, 26–31. [Odnośnik]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Słońce, Y.; Shi, L.; Xue, P. Optymalizacja ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami za pomocą metodologii powierzchni odpowiedzi, zdolności przeciwutleniającej i aktywności hamującej tyrozynazę antocyjanów z otrębów czerwonego ryżu. Nauka o jedzeniu. Nutr. 2020, 8, 921–932. [Odnośnik]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Jednoczesna optymalizacja wspomaganej mikrofalami ekstrakcji związków fenolowych i aktywności przeciwutleniającej nasion awokado (Persea americana Mill.) Przy użyciu metodologii powierzchni odpowiedzi. J. Analny. Metody Chem. 2020, 2020, 7541927. [Odsyłacz]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Oddzielenie pięciu oligostilbenów z Vitis amurensis za pomocą wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej z innym stopniem gradientu. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [Odnośnik]

20. Wang, K.-T.; Chen, LG; Tseng, SH; Huang, J.-S.; Hsieh, MS; Wang, CC-C. Przeciwzapalne działanie resweratrolu i oligostilbenów z Vitis thunbergii var. taiwaniana przeciwko zapaleniu stawów wywołanemu przez lipopolisacharydy. J. Agric. Chemia spożywcza. 2011, 59, 3649–3656. [Odnośnik]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polifenole izolowane z liści Vitis thunbergii var. tajwaniana regulują szlak związany z APP. Bioorg. Med. chemia Łotysz. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Nowe oligostilbeny z Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [Odnośnik]

23. Anna Malinowska, M.; Kęs, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Ekstrakty z trzciny winogronowej jako wielofunkcyjny odmładzający składnik kosmetyczny: ocena aktywności sirtuiny, hamowania tyrozynazy i potencjału biodostępności. Cząsteczki 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Och, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, Kentucky; Lee, MK Charakterystyka składników hamujących tyrozynazę z nadziemnych części Humulus japonicus przy użyciu testu online sprzężonego LC-MS / MS. Bioorg. Med. chemia 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Synteza i ocena biologiczna pochodnych resweratrolu jako inhibitorów melanogenezy. Cząsteczki 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501