Abstrakcyjny
Tło:Przetwarzanie chińskiej materia medica to wyróżniająca się i unikalna technika farmaceutyczna w Tradycyjnej Medycynie Chińskiej (TCM) stosowana w celu zmniejszenia skutków ubocznych oraz zwiększenia lub nawet zmiany skuteczności terapeutycznej surowych ziół. Zmiany w podstawowych składnikach wywołane zoptymalizowaną procedurą przetwarzania są przede wszystkim odpowiedzialne za zwiększoną skuteczność roślin leczniczych. Pobudzający yang nerek gotowany na parze Cistancha deserticola (C. deserticola) w winie ryżowym był silniejszy niż surowy C. deserticola (CD).
Metody:Przeprowadzono analizę porównawczą przy użyciu UPLC-Q-TOF-MSE z platformą informatyczną UNIFI w celu określenia wpływu przetwarzania. Przeprowadzono badania in vitro w celu scharakteryzowania składników oraz metabolitów in vivo. W CD i jego przetworach oznaczono skład chemiczny. Wielowymiarowe analizy statystyczne przeprowadzono w celu oceny różnic między nimi, podczas gdy OPLS-DA zastosowano do porównania parami.
Wyniki:Wyniki tego badania ujawniły znaczne różnice w glikozydach fenyloetanoidowych (PhG) i irydoidach po przetworzeniu. W ekstraktach CD i jego przetworzonym produkcie wykryto łącznie 97 związków. PhG mające grupę 4'-O-kafeoilową w części 8-O- -d-glukopiranozylowej, takie jak akteozyd, cistanozyd C, kamneozyd II, osmantuzyd zmniejszyły się po przetworzeniu, podczas gdy PhG z 6'- Grupa O-kafeoilowa w części 8-O- -d-glukopiranozylu, taka jak izoacetozyd, izocystanozyd C, izokamneozyd I, izomartynozyd, wzrosła, zwłaszcza w grupie CD-NP. Wzrosła również intensywność echinakozydu i cistanozydu B, których struktura zawiera ugrupowanie 6'-O- -d-glukopiranozylu. W badaniu in vivo w osoczu, kale i moczu szczurów wykryto 10 prototypowych składników i 44 metabolity. Uzyskane wyniki wykazały, że przetwarzanie prowadzi do znacznego zróżnicowania składu chemicznego CD i wpływa na dyspozycję związków in vivo, a procesy metaboliczne fazy II są kluczowymi kaskadami każdego związku, a większość metabolitów jest związana z echinakozydem lub acetonidem.
Po więcej informacji:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Wnioski:Jest to pierwsze globalne badanie porównawcze surowych i przetworzonych płyt CD. Odkrycia te poszerzają naszą wiedzę na temat wpływu przetwarzania CD i dostarczają ważnych danych do przyszłych badań skuteczności.
Słowa kluczowe:Cistanche deserticola, Przetwarzanie, UPLC-Q-TOF-MSE, Profile chemiczne, Metabolity in vivo
Wstęp
Przetwarzanie chińskiej materia medica (CMM) wykazało znaczące zastosowanie w praktyce klinicznej Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM) i było uważane za opłacalne leczenie przez kilka stuleci. Jest to unikalna technologia farmaceutyczna wywodząca się z teorii TCM. Zidentyfikowano następujące przetwarzanie, znaczące różnice w wyglądzie, składnikach chemicznych, właściwościach i znaczeniu medycznym wszystkich typów TCM, co prowadzi do przypuszczenia, że przetwarzanie może poprawić skuteczność lub zmniejszyć toksyczne działanie TCM.
Od setek lat Cistanche deserticola (po chińsku Roucongrong, CD) jest powszechnie stosowana w praktyce klinicznej TCM w celu uzupełnienia funkcji nerek. Pomaga również w nawilżaniu jelit, co prowadzi do rozluźnienia jelit [1]. Cistanche został po raz pierwszy nagrany w ShenNongBencaoJing. Występuje powszechnie w suchych i półpustynnych siedliskach w całej Eurazji i Afryce Północnej, w tym w Iranie, Chinach, Indiach i Mongolii [2]. Obróbka CD została przeprowadzona poprzez gotowanie na parze z winem ryżowym pod normalnym ciśnieniem, co jest metodą przygotowania udokumentowaną w chińskiej farmakopei (Jiucongrong po chińsku, zwaną dalej „CD-NP”). A gotowanie na parze CD z winem ryżowym pod wysokim ciśnieniem jest bardziej efektywną metodą przygotowania (zwaną dalej „CD-HP”) [3, 4]. Kilka badań wykazało, że efekty farmakologiczne CD różnią się od jej przetworzonych produktów [5]. CD może tonizować yang nerki i rozluźniać jelita, podczas gdy po parzeniu z winem ryżowym efekt uzupełnienia yang nerki byłby wzmocniony. W naszym wcześniejszym badaniu stwierdzono, że CD-NP może wzmacniać sonifikację nerek i wspierać yang oraz łagodzić skutki nawilżania jelit i wypróżniania [6–8]. W praktyce klinicznej najczęściej stosowaną formą są produkty przetworzone.
Do chwili obecnej w kilku badaniach przeanalizowano składniki chemiczne CD, a następnie wyizolowano i zidentyfikowano ponad 100 związków [9-11], takich jak glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), irydoidy, lignany i oligosacharydy jako główne składniki chemiczne . Donoszono również, że istnieje wiele działań farmakologicznych PhG, w tym immunomodulujące, neuroprotekcyjne, hepatoprotekcyjne, przeciwzapalne, przeciwutleniające itp. [12–14]. Irydoidy wykazują działanie przeciwzapalne [15, 16]. We wcześniejszych badaniach wykazano również, że niektóre składniki chemiczne wykazywały zmiany w trakcie przetwarzania [17–20]. Na podstawie tych doniesień można założyć, że zmiany w składzie chemicznym po obróbce prowadzą do różnych efektów farmakologicznych, które należy dalej badać.
W obecnym badaniu przeprowadzono czułą i skuteczną metodę, tj. ultrawysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), do analizy porównawczej oraz przeprowadzono badania in vitro w celu jakościowej analizy ekstraktów CD, CD-NP i CD-HP w celu wyjaśnienia ich profili chemicznych. Ogólnie rzecz biorąc, egzogenne substancje chemiczne o wysokim narażeniu w narządach docelowych uznano za skuteczne składniki. Dlatego u szczurów CD i jego przetworzone produkty podawano odpowiednio doustnie, a następnie charakteryzowano. Istniejące badanie po raz pierwszy ujawnia badanie porównawcze (zarówno in vitro, jak i in vivo) surowej i przetworzonej płyty CD. Uzyskane wyniki poszerzyłyby naszą wiedzę na temat wpływu przetwarzania płyt CD, co może być pomocne w dalszych badaniach.
Materiały i metody
Materiały
Standardowe związki ajugolu (180120) i 2'-actyloacetoside (M0601AS) zostały dostarczone przez Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Chiny). Cistanozyd F (MUST{5}}), echinakozyd (D1105AS), cistanozyd A (M0906AS) i izoakteozyd (M0106AS) zostały dostarczone przez firmę Must (Sichuan Chiny); akteozyd (O0618AS), salidrozyd (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozyd (A0407AS) i kwas geniposydowy (MB{13}}S) uzyskano od Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Chiny). 8-Kwas epideoksyloganowy (B31123) otrzymano z firmy Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Chiny. Metanol i acetonitryl były klasy MS i otrzymano je z firmy Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy. Kwas metanowy (CH2O2) czystości HPLC dostarczyła firma Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy). Woda użyta w istniejącym badaniu została przetworzona za pomocą systemu Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Wino ryżowe dostarczyła firma Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Chiny).
Cistanche deserticola została zebrana z Neimenggu wangyedi cistanche Co. Ltd. Próbki zidentyfikował prof. Yanjun Zhai (szkoła farmacji, Liaoning University of TCM). Próbki zostały przesłane do Uniwersytetu Liaoning Tradycyjnej Medycyny Chińskiej.
Zwierząt
Samce szczurów Sprague-Dawley (klasa SPF) o całkowitej masie ciała 180–220 g zostały dostarczone przez Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource
Centrum prowincji Liaoning, numer licencji: SCXK- 2015–0001). Szczury te trzymano w pomieszczeniu hodowlanym z dobrze utrzymaną temperaturą i wilgotnością, tj. 20-26 stopni, 50-70 procent przez jeden tydzień. Szczury karmiono zwykłym pokarmem laboratoryjnym i wodą przed eksperymentami. Zwierzęta pościły przez noc, jednak przed doświadczeniem zapewniono im wodę ad libitum. Szczury uśmiercono za pomocą 10% anestetyku wodzianu chloralu. Institutional Animal Ethics Committee of Liaoning Provincial Hospital of Chinese Medicine zatwierdziła wszystkie protokoły eksperymentalne (2019.3.25, 2019015).
Przygotowanie ekstraktu CD, CD‑NP i CD‑HP
CD-NP i CD-HP otrzymano z tej samej partii Cistanch deserticola. Aby przygotować CD-NP, suche kawałki CD (o grubości 5 mm, 100 g) zwilżono winem ryżowym (30 ml) i gotowano na parze w temperaturze 100 stopni przez 16 godzin, a następnie suszono w suszarce w temperaturze 55 stopni. Podczas gdy CD-HP przygotowano przez infiltrację suchych kawałków CD (grubość 5 mm, 100 g) winem ryżowym (30 ml), a następnie gotowanie na parze pod ciśnieniem 1,25 atmosferycznego przez 4 godziny. a następnie wysuszono w suszarce w temperaturze 55 stopni.
W kolbie miarowej o pojemności 100 ml jeden gram proszku przesiano przez sito nr 4, a następnie dodano 50% metanolu (50 ml), a następnie szczelnie przykryto i wymieszano. Tę mieszaninę zważono, a następnie pół godziny. maceracja. Po maceracji mieszaninę poddawano działaniu ultradźwięków (moc 250 W, częstotliwość 35 kHz) przez 40 min, następnie chłodzono i ponownie ważono. Ubytek masy uzupełniono 50% metanolem, odpowiednio wymieszano i pozostawiono do odstania, a następnie przesączono supernatant i otrzymany przesącz wykorzystano jako roztwór testowy.
Analiza MSE składników aktywnych
Przygotowanie substancji standardowych: tableside-A (3,0}2 mg), echinakozyd (3,00 mg), 2'-acetyloakteozyd (2,34 mg), acetonid (2,45 mg), izoakteozyd (0,61 mg) mg), cistanozyd-F (2,14 mg), salidrozyd (3,39 mg), genipozyd (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalog (2,39 mg), kwas tenipozydowy (2,56 mg) i kwas 8- epideoksyloganowy (2,34 mg) dodano do 10 ml kolby miarowej, dodano stałą objętość metanolu w skali, skonfigurowano do odpowiedniego stężenia roztworu wzorcowego. Każde ze 100 μl skonfigurowano jako mieszany roztwór odniesienia.
Warunek analizy MS: Wartość masy te została skorygowana przed eksperymentem i zastosowano tryb jonów ujemnych. Zakres mas wynosił 50–1200 Da, a próbkę wstrzykiwano przez kilka pomp wtryskowych. Szybkość stożka wynosiła 100 l/h, szybkość przepływu rozpuszczalnika ustawiono na 800 l/h. Napięcia kapilarne i stożkowe ustalono odpowiednio na 2500 i 40 V. Temperatura źródła jonów i gazu rozpuszczającego wynosiła odpowiednio 100 stopni i 400 stopni, a częstotliwość pozyskiwania sygnału wynosiła 0,5 S-1.
Analiza UPLC-Q-TOF-MSE ekstraktu CD
Oceny chromatograficzne przeprowadzono w systemie Waters ACQUITY I-CLASS UPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA). W tym kolumna ACQUITY UPLC® BEH C18 (50x2,1 mm, 1,7 µm, Waters). Faza ruchoma składała się z wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego (A) i acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego (B), warunki elucji były następujące: 97 procent do 85 procent A (0–5 min), 85–75% A (5–15 min), 75–65% A (15–16 min), 65–55% A (16–18 min) . Natężenie przepływu wynosiło 0,3 mL min-1, podczas gdy temperatura pomieszczenia autosamplera i kolumny wynosiła oddzielnie 30 stopni i 8 stopni. Objętość wstrzyknięcia wynosiła 1,0 μl.
Ocenę spektrometrii mas przeprowadzono za pomocą Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), zawierającego źródło ESI. Natężenie przepływu gazowego azotu ustalono na 800 l·h-1 przy temperaturze 400 stopni, temperaturę źródła ustalono na 100 stopni, a gaz stożkowy na 50 l·h-1. Napięcie stożka i kapilary ustawiono odpowiednio na 40 i 2000 V. Energia zderzenia rampy została wykorzystana w zakresie 20–30 V. Dane centroidalne wszystkich próbek uzyskano od 50 do 1200 Da, przy 5- czasie skanowania 0,5 s w czasie analizy 10 min . LockSpray TM został wykorzystany do walidacji dokładności masy. Jon [M-H]- enkefaliny leucyny (200 pg·μL-1 szybkość przepływu wlewu 10 μl min-1) przy m/z 554,2615 zastosowano jako masę blokującą. Oprogramowanie MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) zastosowano do dokładnego obliczenia masy, składu jonów prekursorowych i jonów fragmentacyjnych.
Analiza danych w platformie Masslynx
Ponadto na podstawie literatury utworzono własną bibliotekę zawierającą nazwę związku, jego strukturę i wzór cząsteczkowy (w molach). Wszystkie związki zostały odnotowane w specjalnym szablonie, sporządzonym w programie Excel. Ponadto pliki mol (ChemDraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) i pliki Excel wszystkich poszczególnych struktur związków zostały również zapisane na lokalnym komputerze PC. Stworzyliśmy arkusz Excel zawierający ważne dane bezpośrednio importowane do biblioteki naukowej w UNIFI.
UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK zastosowano do oceny cech strukturalnych, w szczególności dla charakterystycznych fragmentów i fragmentacji MS. Minimalna powierzchnia piku została ustawiona na 500 dla wykrywania pików 2D. Podczas ujawniania pików 3D wybrano intensywność piku o niskiej energii wynoszącą ponad 300 zliczeń i podwyższoną intensywność piku energii o ponad 80 zliczeń. Stwierdzono, że błąd masy dla znanych związków wynosił do ±10 ppm, a tolerancję czasu retencji ustalono w zakresie ±0,1 min. Wybraliśmy ujemne addukty zawierające –H plus HCOOH. Przetwarzanie surowych danych uzyskanych z MS zostało przeprowadzone za pomocą usprawnionego oprogramowania UNIFI w celu szybkiego wskazania składników chemicznych, które spełniały standardy, za pomocą własnej bazy danych i wewnętrznej Biblioteki Medycyny Tradycyjnej.
Następnie, aby zweryfikować budowę chemiczną każdego docelowego związku, wyodrębniono izomery na podstawie ich charakterystycznych wzorców fragmentacji MS, które ujawniono w zgłoszonych badaniach, oraz porównując czasy retencji wzorców odniesienia.
Analiza metabolomiczna oparta na wielowymiarowej analizie statystycznej
Przed obróbką surowych danych zostały ustawione parametry, takie jak masa w zakresie od 150 do 12{6}}0 Da, zakres czasu retencji (0 do 20 min), intensywność progowa ( 2000 zliczeń), tolerancja masy, tj. 5 mDa, podczas gdy okno masy i czasu retencji wynosiło odpowiednio 0,20 min i 0,05 Da. W kolejnym zestawieniu bazy danych identyfikatorem jonów były pary RT-m/z dotyczące czasów ich elucji. Te same wartości RT i m/z w różnych partiach próbek uznano za ten sam związek.
Multivariate statistical analysis was conducted to evaluate effective biomarkers that considerably contributed to variations among different groups. During the analysis, principal component analysis (PCA) was employed to indicate the maximum differences and pattern recognition for obtaining an overview and classification. The OPLS-DA is a modeling tool that provides visualization of the OPLS-DA predictive component loading to assist model evaluation. Variable importance for the projection (VIP) was used for assessing the evaluation of various components, and the metabolites with VIP values>1.0 i wartość P<0.05 were regarded as effective markers. Furthermore, a permutation test was conducted for providing reference distributions for the R2/Q2 values that could show statistical significance.
Eksperymenty na zwierzętach
Szczury podzielono losowo na cztery grupy (n=6 dla każdej grupy), a następnie podawano im doustnie różne ekstrakty: (1) Ślepa grupa kontrolna: szczurom podano normalną sól fizjologiczną (2 ml/100 g); (2) grupa CD: szczurom podano ekstrakt CD (2 ml/100 g); (3) grupa CD-NP: szczurom podano ekstrakt CD-NP (2 ml/100 g); (4) grupa CD-HP: szczurom podano ekstrakt CD-HP (2 ml/100 g). Dalszą kategoryzację wszystkich grup przeprowadzono odpowiednio na trzy podgrupy dla osocza, moczu i kału. Dwie godziny później każdemu szczurowi podano doustnie taką samą i równą ilość ekstraktów.
Po podaniu, próbki krwi pobierano po 1.0 godzinie, 2.{3}} godzinie i 4.{5}} godzinie do heparynizowanych probówek polietylenowych o pojemności 1,5 ml (z żył oczodołowych) , a następnie odwirowano (przy 4500 obr./min) wszystkie próbki przez 15 minut.
W przypadku próbek moczu i kału szczury trzymano w klatkach metabolicznych, a następnie pobierano próbki moczu i kału przez 24 godziny po podaniu. Próbki moczu wirowano przy 45{3}}0 obrotach na minutę przez 15 minut, podczas gdy próbki kału suszono w cieniu i mielono na proszek, następnie pobierano 0,2 g i dodawano do 0,5 ml roztworem soli, ultradźwiękami przez 5 min i wirowano przy 12 000 obrotach na minutę przez 15 min. Wszystkie biopróbki trzymano w temperaturze -80 stopni do czasu analizy.
Przygotowanie próbek biologicznych
Dodawanie próbek osocza, moczu i kału przeprowadzono za pomocą 3 objętości metanolu, a następnie wirowano przez 3 minuty. Następnie mieszaniny wirowano (przy 12,{3}} rpm) przez 10 min, po czym supernatant przeniesiono do probówki EP i suszono azotem w 37 st. Ponadto przeprowadzono dodanie 200 μl roztworu HCN-H2O (50 proc.). Następnie do mieszania zastosowano wirowanie (1 min), a następnie wirowanie (przy 12, 000 obr./min) przez 5 min. Supernatant (5 μl) traktowanych próbek wstrzyknięto do systemu UPLC-Q-TOF-MSE.
Warunki chromatografii cieczowej i spektrometrii mas
Analizę metabolitów przeprowadzono również za pomocą instrumentu Waters UPLC za pośrednictwem interfejsu ESI. Rozdziały przeprowadzono stosując kolumnę Aquity UPLC HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm), fazą ruchomą był 0,1 procent kwasu mrówkowego (A): Acetonitryl (B), warunki elucji gradientowej wynosiły 0–3 min (99,8 proc. →98 proc. A), 3–5 min (98 proc. →95 proc. A), 5–8 min (95 proc. →90 proc. A), 8 –12 min (90 proc. →85 proc. A), 12–17 min (85 proc. →70 proc. A), 17–22 min (70 proc. →60 proc. A), 22–23 min (60 proc. →58 proc. A) , 23–25 min (58 procent A), 25–32 min (58 procent →45 procent A) i 32–37 min (45 procent →35 procent A), 0,4 ml min-1 było szybkością przepływu. Temperaturę kolumny i pomieszczenia z próbkami ustawiono odpowiednio na 40 stopni i 8 stopni. Zastosowano wyżej wymienione warunki spektrometrii mas.
Strategia systematycznej analizy metabolitów w biopróbkach
Do przetwarzania danych wykorzystano oprogramowanie UNIFI (1.8.2). Do identyfikacji efektywnych metabolitów wykorzystano funkcję Binary Compare. Oceniane metabolity nie występowały w równoważnej próbce kontrolnej lub występowały przy niskim natężeniu jonów. Względny próg intensywności ustalono na 3 lub 5 i można było ocenić metabolity, które spełniały podkreślone kryteria. Powszechne i przewidywalne metabolity zostały następnie określone za pomocą EIC. Do poszukiwania metabolitów dwufazowych zastosowano funkcję NLF. Na przykład w oprogramowaniu UNIFI można ustawić parametry na 176,0321 w celu wyszukania możliwych koniugatów kwasu glukuronowego. Po przetworzeniu w metodzie można ustawić lub zidentyfikować neutralną stratę. MassFragment został użyty do określenia lub scharakteryzowania struktur wykrytych metabolitów, funkcja interpretacji spektralnej UNIFI jest główną funkcją używaną do analizy wtórnej fragmentacji składników macierzystych. Tej funkcji można użyć do rozsądnej szybkiej weryfikacji ścieżki fragmentacji.
Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
