Abstrakcyjny

Wstęp: Propolis jest naturalną żywiczną substancją zbieraną przez pszczoły miodne z pąków i wydzielin różnych drzew i roślin; powszechnie przyjmuje się, że skład propolisu zależy od cech fitogeograficznych miejsca zbioru.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniem DNA spowodowanym przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silne zdolności wymiatania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA oraz mają pewien ochronny wpływ na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołanych przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u eksperymentalnie starzejących się myszy Eksperymenty wykazały, że zwyrodnienie morfologiczne komórek Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i może wychwytywać reaktywne formy tlenu, zapobiegać degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ na naprawę uszkodzeń anionów wolnych rodników tyminy.

Kliknij Suplement Cistanche Tubulosa

【Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Cele: To badanie miało na celu określenie składu fitochemicznego ekstraktów etanolowych z ośmiu partii propolisu zebranych w różnych regionach Beninu (północny, środkowy i południowy) oraz Konga w Afryce.

Materiał i metody:Charakterystykę próbek propolisu przeprowadzono za pomocą różnych metod chromatograficznych z łącznikiem połączonych z dereplikacją atomowego rezonansu magnetycznego (13C NMR) za pomocą oprogramowania MixONat. Ich działanie przeciwutleniające lub produkt końcowy przeciwdziałający zaawansowanej glikacji (przeciw AGE) oceniano następnie, stosując odpowiednio testy difenylopikrylohydrazylu i albuminy surowicy bydlęcej.

Wyniki: Analizy chromatograficzne połączone z dereplikacją 13C NMR wykazały, że dwie próbki z centrum Beninu wykazywały oprócz ogromnej ilości pentacyklicznych triterpenów, metoksylowane stilbenoidy lub fenantreny, odpowiedzialne za działanie przeciwutleniające ekstraktu za ten pierwszy. Wśród nich kombretastatyna może być cytotoksyczna. Po drugie, prenylowane flawanony znane z propolisu typu Macaranga były odpowiedzialne za ich znaczące działanie przeciw AGE. Próbka z Konga składała się z wielu pochodnych triterpenów należących do gatunku Mangifera indica.

Wniosek: Dlatego propolis z centrum Beninu wydaje się być szczególnie interesujący ze względu na swoje właściwości przeciwutleniające i przeciwstarzeniowe. Niemniej jednak, ponieważ standaryzacja propolisu jest trudna w strefach tropikalnych ze względu na jego dużą różnorodność chemiczną, wymagana jest systematyczna analiza fitochemiczna przed promowaniem stosowania propolisu w żywności i produktach zdrowotnych w Afryce.

SŁOWA KLUCZOWE

Dereplikacja 13C NMR, metoksylowane stilbenoidy lub fenantreny, pentacykliczne triterpeny, prenylowane flawanony, propolis

1. WSTĘP

Propolis jest naturalną żywiczną substancją zbieraną przez pszczoły z pąków i wydzielin różnych drzew i roślin, zmieszaną z woskiem pszczelim i enzymami śliny1. Służy pszczołom do zabezpieczania wejść przed intruzami, zatykania otworów, wygładzania ścian wewnętrznych, mumifikowania martwych zwierząt (małe owady) wewnątrz ula i równoważą ekstremalną wilgotność lub warunki suszy.2,3 Propolis był szeroko stosowany w medycynie ludowej od czasów starożytnych ze względu na szeroki zakres właściwości terapeutycznych.4 Propolis składa się na ogół z żywicy (50 procent) , wosk (30 procent), oleje (10 procent), pyłki (5 procent) i dodatkowe związki fenolowe, takie jak flawonoidy.5,6 Wiadomo, że skład chemiczny propolisu jest złożony i różni się w zależności od gatunku rośliny rosnącej wokół ula , z których pszczoły zbierają wydzieliny7. Przyjmuje się, że kilka czynników, takich jak skład florystyczny terenu, miejsce i czas zbioru, pora roku, rodzaj zbieracza, dostępność i wysokość nad poziomem morza oraz aktywność pokarmowa rozwinęło się podczas eksploatacja propolisu ma wpływ na skład chemiczny propolisu.8,9 Istnieją różne rodzaje propolisu, w zależności od obszaru geograficznego produkcji, pochodzenia botanicznego i składu chemicznego. Najpopularniejsze rodzaje propolisu to umiarkowany, brzozowy, tropikalny, śródziemnomorski i pacyficzny.10 Propolis z umiarkowanych stref klimatycznych, takich jak Europa, Ameryka Północna czy nietropikalne regiony Azji, pochodzi głównie z wysięków z pąków gatunków Populus ( Salicaceae) i dlatego jest bogata we flawonoidy i kwasy fenolowe oraz ich estry; jednak propolis tropikalny, pochodzący z regionów, w których nie rośnie ani topola, ani brzoza, jest bogaty w prenylowane pochodne kwasów p-kumarowych, benzofenonów lub terpenoidów.11 Propolis pacyficzny, zwykle bogaty w prenylowane flawanony, jest kolejnym ważnym rodzajem propolisu występującym na Tajwanie , Japonii i na Wyspach Salomona, a propolis brzozowy występuje szczególnie w Rosji.12 Badania propolisu z tropikalnej Azji doprowadziły do ​​odkrycia Macaranga denarius L. i Mangifera indica L. jako roślinnych źródeł indonezyjskiego propolisu.13 Na z drugiej strony gatunki iglaste z rodziny Cupressaceae są głównym botanicznym źródłem propolisu w regionach śródziemnomorskich.14 Analizy chemiczne wykazały, że propolis zawiera ponad 300 różnych produktów naturalnych (NP), w tym pochodne kwasu fenolowego, kumaryny, flawonoidy, seskwiterpeny, diterpeny, triterpeny, steroidy, lignany lub prenylowane benzofenony.15 Biologiczne działanie propolisu zostało opisane głównie w odniesieniu nie tylko do jego przeciwutleniaczy,16-18 przeciw AGE (tj. - przeciwzapalne,20 i przeciwnowotworowe,21-23, ale także przeciwbakteryjne,24-26 przeciwgrzybicze,15 przeciwwirusowe,27 i przeciwpasożytnicze28. Wiadomo również, że propolis stymuluje produkcję przeciwciał, co sugeruje jego potencjalne zastosowanie jako adiuwanta w szczepionkach.29 Szczególne zainteresowanie budzi coraz większe zastosowanie tej naturalnej substancji o zróżnicowanym składzie, a co za tym idzie, różnej aktywności biologicznej w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i spożywczym w badaniach naukowych, zwłaszcza jeśli chodzi o określenie jego składu chemicznego. Większość badań przeprowadzono na próbkach z Europy19,30-33 i Ameryki Łacińskiej, a dokładniej z Brazylii,20,23,34-36, natomiast niewiele badań przeprowadzono w Afryce.37-41 Informacje na temat propolisu benińskiego i kongijskiego42 są wciąż skąpe.

Dlatego badanie to miało na celu scharakteryzowanie głównych związków z próbek propolisu pobranych w różnych strefach fitogeograficznych Beninu i Konga (Afryka) przy użyciu dereplikacji jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) 13C za pomocą oprogramowania MixONat.43,44 Wstępne badanie z wykorzystaniem bazy danych (DB) zawierającej Nanocząstki podawane wcześniej dla propolisu wraz z ich przewidywanymi przesunięciami chemicznymi (δC) dla 13C nie dostarczyły żadnych użytecznych danych w porównaniu z zadowalającymi wynikami zwykle uzyskiwanymi z ekstraktów roślinnych.43-45 Można to wytłumaczyć składem chemicznym propolisu, który jest w dużym stopniu zależny na lokalną florę, uniemożliwiając skonstruowanie chemotaksonomicznej bazy danych. Tak więc, aby rozszyfrować główne związki propolisu benińskiego i kongijskiego, w niniejszej pracy wykonaliśmy wysokosprawną chromatografię cieczową połączoną ze spektrometrią mas z detekcją rozpraszania światła ultrafioletowego i parowania (HPLC-UV-ELSD-MS) oraz chromatografię gazową połączoną ze spektrometrią mas ( GC-MS) na surowych ekstraktach propolisu w celu zidentyfikowania ich głównych cech strukturalnych i zbudowania odpowiednich baz danych NP odpowiednich dla oprogramowania MixONat.46 Następnie, po zgrubnym frakcjonowaniu próbek propolisu wybranych zgodnie z ich profilem chemicznym, umożliwiono dereplikację opartą na 13C NMR identyfikacja głównych NP bez dalszego oczyszczania. Przeprowadzono również testy antyoksydacyjne i anty-AGE.

2. PROCEDURY DOŚWIADCZALNE

2.1 Chemikalia

1,1-difenylo-2-pikrylhydrazyl (DPPH), odczynnik Folina-Ciocalteu, kwas mrówkowy i kwas galusowy, wszystkie o czystości analitycznej, zakupiono od Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francja). Kwas 6-hydroksy-2,- 5,7,8-tetrametylochroman{9}}karboksylowy (Trolox®) i 50 - kwas kawoilochinowy (kwas chlorogenowy) zostały uzyskany z Acros Organics (Geel, Belgia).

2.2 Próbki propolisu

Osiem próbek benińskiego propolisu pobrano przez zeskrobanie z uli w trzech strefach fitogeograficznych (tabela 1 i rysunek SI-1). Próbkę kongijskiego propolisu pobrano w sztucznym lesie drzew akacji na płaskowyżu Bateke w centrum Republiki Konga (tab. 1).

2.3 Ekstrakcja propolisu

Etanolowe ekstrakty propolisu (EEP) zostały początkowo przygotowane przy użyciu następującego protokołu ekstrakcji.19 Surowy propolis najpierw jednorodnie sproszkowano w obecności ciekłego azotu. Dla wszystkich próbek 1 g proszku propolisowego macerowano w 20 ml 95% etanolu. Po mieszaniu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, mieszaninę przesączono stosując filtr lejkowy ze spiekanego szkła (wielkość porów 16–40 μm). Pozostałość ponownie ekstrahowano dwukrotnie stosując te same etapy. Następnie trzy zebrane przesącze utrzymywano w temperaturze 18°C ​​przez noc, przesączono w celu usunięcia wosków i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem (40°C, 10 barów), otrzymując EEP.

Ilości 8,0 g proszku propolisowego BC1 (1) i BC2 (2) lub 10,3 g CG (3) ponownie wyekstrahowano 95-procentowym EtOH (UAE, 4 x 80 ml, 15 min) w celu dalszego chromatografia flash.

2.4 Oznaczanie całkowitej zawartości fenoli

Całkowitą zawartość fenoli określono metodą kolorymetryczną Folina-Ciocalteu, jak opisano wcześniej, 19 i ostatnio dostosowano ją do bezpośredniego stosowania w mikropłytkach. W skrócie, 10 ul każdego ekstraktu propolisu w MeOH (3,5 mg/ml dla BC1, 5 mg/ml dla BN2, BC2 i CG, 7,5 mg/ml dla BN1, BS1a, BS1b i BS2 oraz 10 mg/ml dla BS3) zmieszano z 20 μl wody destylowanej i 10 μl odczynnika Folina-Ciocalteu w 96-dołkowej mikropłytce. Po 3 minutach dodano 120 ul wody destylowanej i 40 ul 20% wodnego roztworu węglanu sodu. Absorbancję mierzono na spektrofotometrze do mikropłytek TECAN® (V6.5) przy 760 nm po 30 minutach w ciemności w temperaturze pokojowej. Próbę ślepą przygotowano w ten sam sposób, stosując MeOH zamiast roztworu ekstraktu, a do obliczenia krzywej kalibracji użyto kwasu galusowego (0,04–0,328 mg/ml; y=2,7241x 0,0039; r2=0 .9982). Każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach. Całkowitą zawartość fenoli wyrażono w równoważnikach kwasu galusowego (mg) na gram ekstraktu (mg GAE/g).

2.5 Wstępne analizy chromatograficzne

2.5.1 Analityczna TLC

Analityczną chromatografię cienkowarstwową (TLC) przeprowadzono na TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Niemcy), stosując jako eluent mieszaninę cykloheksan: AcOEt. Plamy na chromatogramie wizualizowano najpierw w świetle UV (254 nm), a następnie przez spryskiwanie odczynnikiem wanilina-kwas siarkowy (2 ml stężonego kwasu siarkowego w 98 ml 1: 99 w/v wanilina: 95 procentowy roztwór etanolu) i ogrzewanie chromatogramów do 110 stopni C przez 5 min.

2.5.2 Procedura GC-MS

Analizę GC-MS przeprowadzono na próbkach niederywatyzowanych przy użyciu chromatografu gazowego Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Francja) przy napięciu jonizacji 70 eV (elektroniczny Uderzenie). Próbki przygotowano w dichlorometanie (DCM) w stężeniu 2 mg/ml dla ekstraktów i 1 mg/ml dla frakcji. Rozdziały przeprowadzono stosując kolumnę Phenomenex ZB5 (30 m x średnica wewnętrzna 0,250 mm z warstwą o grubości 0,25 mm; Phenomenex, Le Pecq, Francja). Temperaturę programowano następująco: 180 st. C (3 min), 180–280 st. C z szybkością 10 st. C/min oraz 280 st. C (27 min). Hel stosowano jako gaz nośny przy natężeniu przepływu 2,0 ml/min. Temperatury wtryskiwacza i detektora ustawiono odpowiednio na 250 stopni C i 280 stopni C. Metabolity zidentyfikowano przez porównanie ich czasów retencji (Rt), nominalnej masy i/lub wzorców fragmentacji z autentycznymi próbkami i/lub tymi zawartymi w bibliotekach wzorców fragmentacji sprzętu (NIST11, NIST11s i FFNSC2).

2.5.3 Procedura HPLC-DAD-ELSD

Analizy chromatograficzne przeprowadzono przy użyciu chromatografu cieczowego Shimadzu 2030C 3D (Noisiel, Francja) wyposażonego w matrycę diodowądetektor (DAD) i ELSD (Sedere®) z kolumną Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Niemcy ) zabezpieczone wkładem ochronnym Lichrocart® 4–4 (4 mm*4 mm śr. wew.), stosując prędkość przepływu 1 ml/min. Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (rozpuszczalnik A) i metanolu (rozpuszczalnik B), a rozdział prowadzono według następującego gradientu liniowego: 25–100% B (0–40 min), 100% (40–45 min.). Widma UV-vis rejestrowano w zakresie 190–600 nm, a chromatogramy uzyskiwano przy 254 i 280 nm. ELSD ogrzewano w temperaturze 30°CstopieńC, a do sygnału zastosowano wzmocnienie 4. Próbki przygotowano w stężeniu 10 mg/ml w MeOH i wirowano przy 13,{3}} g przez 10 minut przed wstrzyknięciem (10 ul) w celu usunięcia śladów zawieszonych materiałów.

2.5.4 Procedura HPLC-UV-MS

Analizy HPLC-UV-MS przeprowadzono stosując moduł rozdzielania Waters 2795 (Guyancourt, Francja) wyposażony w detektor Dual λ 2487 Waters. Kolumna, fazy ruchome i gradient były takie same jak opisano powyżej dla HPLC-DAD-ELSD. Chromatogramy uzyskano przy 254 i 280 nm. Analizy masowe przeprowadzono na urządzeniu Bruker (Bremen, Niemcy) jonizacja przez elektrorozpylanie/jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus w obu trybach dodatnim i ujemnym w następujący sposób: gaz kolizyjny, He; amplituda energii zderzenia, 1,3 V; nebulizator i gaz suszący, N2, 7 l/min; ciśnienie gazu nebulizatora, 3 0 psi; temperatura suszenia 340°C; szybkość przepływu, 1,0 ml/min; stosunek rozdziału rozpuszczalnika, 1:9; zakres skanowania, m/z 100–1,000. Próbki przygotowano w stężeniu 10 mg/ml w MeOH, odwirowano przy 13 000 g przez 10 min i przesączono przez filtr strzykawkowy z membraną 0,45-}μm z politetrafluoroetylenu (PTFE) przed wstrzyknięciem (20 ul) w celu usunięcia śladów zawieszonych materiałów.

2.6 Frakcjonowanie EEP metodą szybkiej chromatografii

Najpierw 3,8 g BC1 (1), 3,5 g BC2 (2) lub 4,0 g CG (3) EEP rozpuszczono w minimalnej objętości DCM i acetonu i zmieszano z żelem krzemionkowym (krzemionka żel: stosunek ekstraktu, 2:1). Dla wszystkich rozpuszczalnik pozostawiono do odparowania aż do uzyskania drobnego suchego proszku. Dla każdego EEP przeprowadzono następnie frakcjonowanie przy użyciu aparatu CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, USA) z kolumną z żelem krzemionkowym (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Francja) przy szybkości przepływu 25 ml/min cykloheksanem (rozpuszczalnik A) i octanem etylu (EtOAc) (rozpuszczalnik B) stosując następujący gradient elucji: (1) dla BC1 EEP, 5 procent B (0-10 min), 5-20 procent B (10-30 min), 20-30 procent B (30-60 min), 30-50 procent B (60-85 min) i 50-100 procent B (85–110 minut); Zebrano 160 probówek po 20 ml i połączono w 14 frakcji (BC1_}F1 do BC{43}}F14) na podstawie ich profili chromatograficznych TLC (stosunek cykloheksan:EtOAc, 90:10 do 50:50 ); (2) dla BC2 EEP, 5% B (0–10 min), 5–10% B (10–20 min), 10–30% B (20–40 min), 30–40% B (40–55 min) i 40-100% B (55-70 min); Zebrano 100 probówek po 20 ml i połączono w 8 frakcji (BC2_}F1 do BC{75}}F8) na podstawie ich profili chromatograficznych TLC (stosunek cykloheksan:EtOAc, 90:10 do 60:40 ); (3) dla CG EEP, 5% B (0–10 min), 5–10% B (10–30 min), 10–20% B (30–50 min), 20–40% B (50–70 min), 40–60 proc. B (70–80 min) i 60–100 proc. B (80–90 min); Zebrano 135 probówek po 20 ml i połączono w 23 frakcje (CG_}F1 do CG{110}}F23) na podstawie ich profili chromatograficznych TLC (stosunek cykloheksan:EtOAc, 80:20 do 60:40 ).

Dodatkowy etap frakcjonowania przeprowadzono na frakcji BC{{0}}F7: 200 mg rozpuszczono w minimalnej objętości MeOH i zmieszano z żelem krzemionkowym C18- (C18-krzemionka żel: stosunek ekstraktu, 2:1). Rozdział prowadzono na kolumnie C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Francja) przy szybkości przepływu 15 ml/min z wodą (rozpuszczalnik A) i MeOH (rozpuszczalnik B) stosując następujący gradient elucji: 50– 70 proc. B (0–30 min) i 70–100 proc. B (30–40 min); Zebrano 80 probówek po 8 ml i połączono w 5 frakcji (BC2_F7-1 do BC2_F7-5) na podstawie ich profili HPLC-UV (280 nm) .

2.7 1 analizy H i 13C NMR

Widma NMR (1D i 2D) frakcji propolisu (7–58 mg) lub czasami NP rejestrowano w deuterowanym chloroformie (CDCl3) lub deuterowanym metanolu (CD3OD) (500 ul) na spektrometrze JEOL NMR przy 400 MHz przez 1 H i 100 MHz dla 13C. Eksperymenty NMR (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT{14}} i 2D NMR) na frakcjach i czystych NP przeprowadzono w 298 K na spektrometrze JEOL 400 MHz H (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Francja) wyposażony w odwróconą sondę 5-mm (ROYAL RO5). Przesunięcia chemiczne (δH i δC) wyrażono w ppm, a wartości J w Hz.

Dla widm 13C NMR (100 MHz) zastosowano sekwencję odsprzęgania WALTZ{2}} z czasem akwizycji 1,04 s (32 768 punktów danych zespolonych) i opóźnieniem relaksacji 2 s. Zebrano od 1500 do 11 000 skanów, aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu. Filtr rozszerzający linię wykładniczą o częstotliwości 1 Hz zastosowano do każdego zaniku swobodnej indukcji (FID) przed transformacją Fouriera. Widma zostały ręcznie podzielone na fazy i skorygowane do linii bazowej za pomocą oprogramowania MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Hiszpania) i odniesione do centralnego rezonansu deuterowanego rozpuszczalnika przy δC 77,16 ppm (CDCl3) i δC 49,00 ppm (CD3OD). Aby uzyskać wzmocnienie bez zniekształceń za pomocą eksperymentów z transferem polaryzacji (DEPT), wymagane było od 512 do 5500 skanów i wykonano wyrównania z widmami 13C przy użyciu danego δC. Następnie zastosowano minimalny próg intensywności, aby ręcznie zebrać dodatnie sygnały 13C NMR i DEPT{25}} oraz dodatnie i ujemne sygnały DEPT{26}}, unikając przy tym potencjalnych artefaktów szumowych.

Propolis DB1 został najpierw zbudowany przez poszukiwanie związków opisanych w propolisie na SciFindern 47, co dało DB 1471 NP; Wartości δ C przewidywano przy użyciu predyktorów NMR Advanced Chemistry Development (ACD) (C, H). Z takich baz danych zawierających NP wraz z ich wartościami δC-SDF, procedura CTypeGen zawarta w MixONat stworzyła odpowiednią bazę danych: odczytała plik danych przestrzennych (SDF) i posortowała przesunięcia chemiczne według rodzaju węgla. Następnie utworzono wymagany SDF typu c, tj. Propolis typu c DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 został utworzony. Wyszukiwanie substancji przy użyciu słów kluczowych stilbenoids i phenantrenes w bazie danych LOTUS zawierającej 276 518 NP48 (LOTUS, 2022) pozwoliło uzyskać Stilbenoids_fenantrenoidy DB2 o 2681 NP jako SDF. Następnie utworzono bazę danych Flavanones DB3: wyszukiwanie w SciFindern47 przy użyciu 2-fenylochromanu-4-jednej podstruktury pozwoliło wybrać spośród 56 679 cząsteczek. Zostały one dodatkowo zredukowane do 2893 w odniesieniu do „Występowania produktów naturalnych” przy użyciu analizy substancji z filtrem „Rola referencyjna” zaproponowanym przez SciFindern. Po dodatkowej rafinacji przez etap filtrowania w oparciu o oczekiwaną masę cząsteczkową (MW) (tj. 340 do 424 Da), wszystkie odpowiednie flawanony następnie eksportowano jako SDF w celu uzyskania NP z Flavanones DB3 (684 NP). Dla każdego NP DB2 i DB3 przewidywano wartości δ C-SDF przy użyciu oprogramowania predykcyjnego ACD NMR (C, H), jak również metodologii opisanej wcześniej przez Nuzillard46 w celu bezpośredniego uzyskania SDF typu c gotowego do użycia przez MixONat. Ta ostatnia zawiera dla każdego związku DB przewidywane wartości δC zorganizowane jako węgle metylowe, metylenowe, metynowe lub czwartorzędowe.

Triterpeny DB4 zostały zbudowane z PNMRNP3 DB49,50 zaimportowanego jako SDF w oprogramowaniu predykcyjnym ACD NMR (C, H) poprzez wyszukiwanie triterpenów o MW między 100 a 500 Da (tj. Dane wyszukiwania: triterpeny; Szukaj MW: 100 do 500) aby bezpośrednio uzyskać bazę danych zawierającą 6623 triterpenów w wymaganym formacie pliku typu c.

Alk (en) yl rezorcynol i pochodne fenolu DB5 zostały zbudowane z PNMRNP3 DB49,50 zaimportowanego jako SDF w oprogramowaniu predykcyjnym ACD NMR (C, H) poprzez przeszukiwanie NP za pomocą rusztowania m-alk (en) ylofenolowego i sklasyfikowane jako fenole (tj. 3-(hexadec-8-en-1-yl)phenol Substructure search; Search Classyfire class: phenol), aby bezpośrednio uzyskać bazę danych zawierającą 44 NP w wymaganym formacie pliku typu c.

2.8 13Dereplikacja oparta na C NMR przy użyciu oprogramowania MixONat

Lista pików i dane dotyczące intensywności uzyskane z każdego widma eksperymentalnego (13C NMR, DEPT{1}} i DEPT-90) zostały wyeksportowane jako plik . csv za pomocą oprogramowania Microsoft Excel (Microsoft 16.45) i używany jako plik wejściowy w oprogramowaniu MixONat. Pliki takie składają się z listy wartości δC uporządkowanych malejąco w zależności od ich intensywności w tej samej linii, oddzielonych przecinkiem.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0,70. Następnie porównano dane eksperymentalne NP z najlepszymi wynikami z literaturą.

2.9 Oczyszczanie

2.9.1 Preparatywna HPLC

Oczyszczanie frakcji BC{{0}}F6 i BC1_F8 (40 mg w 2 ml MeOH) przeprowadzono stosując preparat Shimadzu LC-20AP chromatograf cieczowy wyposażony w detektor UV–vis SPD-40 (Noisiel, Francja), pętlę iniekcyjną 2 ml i kolektor frakcji FRC-10A, przy użyciu kolumny preparatywnej C18 (25{{39 }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Francja) przy szybkości przepływu 21,24 ml/min. Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (rozpuszczalnik A) i metanolu (rozpuszczalnik B), a rozdział przeprowadzono stosując następujący gradient: (1) dla BC1_}F6, 40% B (0–5 min), 40–70 proc. B (5–20 min) i 70–90 proc. (20–30 min); (2) dla BC1_F8, 40–70 procent B (0–15 min) i 70–90 procent (15-25 min). Chromatogramy uzyskano przy 254 i 280 nm.

2.9.2 Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

Aby otrzymać najbardziej polarną frakcję BC2-EPP (200 mg w 5 ml MeOH zmieszanego z 350 mg żelu krzemionkowego C18- po odparowaniu) przeprowadzono oczyszczanie na kolumnie ekstrakcyjnej do fazy stałej C18 (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Francja) z wodą: MeOH 7:3 (10 ml) i wodą: MeOH 6:4 (10 ml). Probówki 4–10 połączono, aby utworzyć polarną frakcję BC2 (BC{19}}SPE) na podstawie ich profili HPLC-UV (330 nm).

2.10 Testy antyoksydacyjne i anty-AGE

2.10.1 Zmiatanie rodników DPPH

Ocenę wychwytywania wolnych rodników przez DPPH benińskich EEP przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem.51 Pokrótce, badane próbki rozcieńczono w absolutnym EtOH o 0.02 mg/ml z roztworów podstawowych o stężeniu 1 mg/ml w sulfotlenku dimetylu (DMSO). Porcje (100 ul) tych rozcieńczonych roztworów umieszczono w 96-płytkach studzienkowych w trzech powtórzeniach. Około 25 ul świeżo przygotowanego roztworu DPPH (1 mM) dodano do 75 ul absolutnego EtOH przy użyciu iniektora czytnika mikropłytek (Infinite® 200, Tecan, Francja) do uzyskania końcowej objętości 200 ul na studzienkę. Po 30 minutach w ciemności w temperaturze otoczenia określono absorbancję przy 517 nm. EtOH zastosowano jako ślepą próbę, podczas gdy 10, 25, 50 i 75 µM roztwory Trolox (hydrofilowy analog tokoferolu) zastosowano do krzywej kalibracji. Jako wzorzec kontroli jakości zastosowano próbkę etanolowego roztworu kwasu chlorogenowego (0,02 mg/ml). Wyniki wyrażono jako ekwiwalenty Troloxu (mikromole TE na g ekstraktu).

2.10.2 Test anty-AGE

Wpływ ekstraktów propolisu i pięciu głównych wyizolowanych pochodnych naringeniny na powstawanie AGE określono w sposób opisany wcześniej.51 Pokrótce, albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (10 mg/ml) inkubowano z D-rybozą ({{ 13}},5 M) razem z badanym związkiem (3 μM do 3 mM) lub ekstraktem (1 ug do 1 mg) w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,4 (NaN3, 0,02 procent). Roztwory inkubowano w 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania w 37 stopniach C przez 24 godziny w układzie zamkniętym przed pomiarem fluorescencji AGE. Dla każdego pomiaru odejmowano fluorescencję z próbki inkubowanej w identycznych warunkach bez D-rybozy. Fluorescencję AGE podobną do pentozydyny (wzbudzenie przy 335 nm, emisja przy 385 nm) zmierzono fluorescencją AGE.52 Wartości IC50 zdefiniowano jako ilość ekstraktu (ug/ml) lub kontroli pozytywnej (μM) wymaganą do zmniejszenia powstawania AGE o 50 procent względem kontroli negatywnej. Zgodnie z testem walidacji statystycznej,53 pojedyncza analiza jest wystarczająca do dokładnego określenia IC50.

3. WYNIKI I DYSKUSJA

3.1 Profilowanie chromatograficzne

Ogólne profilowanie LC ośmiu benińskich i kongijskich EPP przy użyciu quasi-uniwersalnego detektora ELSD wykazało, że wszystkie próbki zawierały związki niepolarne, eluowane na końcu chromatogramów (ryc. 1). BC1 zawierał również dużą ilość bardziej polarnych związków, a BC2 wykazywał niektóre średnio polarne związki w mniejszych ilościach. Związki niepolarne w CG EEP okazały się zupełnie inne niż związki benińskie.

W ten sposób profilowanie ELSD doprowadziło do powstania trzech różnych i oryginalnych próbek, których skład był dalej badany: BC1, BC2 i CG.

Najpierw przeprowadzono analizy GC-MS, porównując fragmentację MS z NIST DB, aby scharakteryzować klasy chemiczne i, jeśli to możliwe, zidentyfikować składniki. Przypuszczalna identyfikacja (na podstawie procentowej zgodności z bazą danych NIST) i klasy chemiczne związków przedstawiono w tabeli 2 (dane profilowania GC – całkowity prąd jonowy [TIC] przedstawiono na rysunku SI-2).

Wszystkie EEP benińskie przedstawiały te same profile związków niepolarnych, oznaczone literami od A do F, ale ich ilości mogły się różnić. Przypuszczalnie zidentyfikowano je jako - lub -amrinon (A), -amyrin (B), lupenon (C), -amyrin (D), - lub -octan amyryny (E) i octan lupeolu (F) (por. Ryc. SI -3), już opisane jako główne NP w meksykańskim propolisie.54 Zhang et al. (2014) oraz Tamfu i in. (2020) również opisali triterpenoidy jako octany amyryny/lupeolu i amyryny/lupeolu w różnych próbkach afrykańskiego propolisu.41,55 Tylko BC1 prezentował dodatkowe NP eluowane między Rt 10 a 15 min, sugerowane jako metoksylowane stilbenoidy lub fenantreny zgodnie z ich wzorcami fragmentacji. Kongijski EEP wykazywał inny profil niż beniński, z estrami etylowymi kwasów C16 i C18 jako bardziej lotnymi związkami związanymi z dobrym wynikiem dopasowania 94 procent, pochodną fenolu przy Rt 13,1 min, trzema pochodnymi rezorcyny w zakresie 14- 17 min, a różne rodzaje pochodnych triterpenowych po Rt 21 min.

Ponadto EPP analizowano za pomocą HPLC-DAD-MS w celu wizualizacji nielotnych NP (por. Rysunek SI -4). Różne profilowanie wykazało, że BC1 EEP wykazywał dużą ilość średnio polarnych związków z chromoforami absorbującymi przy 280 nm, jak również BC2 w mniejszych proporcjach, a CG miał bardzo słaby profil UV przy 280 nm.

3.2 Skład chemiczny BC1 i BC2

Aby zidentyfikować ich główne NP przy użyciu dereplikacji 13C NMR w oparciu o MixONat i odpowiednie DB, następnie uzyskano zgrubne frakcjonowanie BC1 i BC2 EEP za pomocą chromatografii flash. Rzeczywiście, w przypadku BC1 analiza GC-MS ujawniła obecność metoksylowanych stilbenoidów lub fenantrenów, co zainspirowało nas do zbudowania specyficznych stilbenoidów_fenantrenoidów DB2. Dla BC2, z wyjątkiem bardziej polarnych związków przy Rt 3,8 min, wszystkie związki wykazywały widma UV flawanonów-dihydroflawonoli, co sugerowało tworzenie Flawanonów DB3.

Jak przedstawiono w tabeli 3, dihydrofenantreny 1 i 3–5, fenantreny 2 i 6 oraz dihydrostilben 7 (ryc. 2) zostały zasugerowane w BC1 EEP przez MixONat i potwierdzone przez porównanie z danymi literaturowymi (por. informacje uzupełniające). W razie potrzeby stosowano filtr MW w oparciu o dane HPLC-MS.

Dokładniej, spośród 9,10-pochodnych dihydrofenantrenu spośród 2681 NP w DB2, MixONat zasugerował 6-metoksyceloninę (2,7-dihydroksy-3,5-dimetoksy{ {10}},10-dihydrofenantren; 3, ranga 1, wynik 0,75, liczby SI-13 i SI-14) w BC{{ 18}}F5 i jego obecność została potwierdzona przez porównanie z opublikowanymi danymi NMR. Został on dotychczas zidentyfikowany u gatunków Combretaceae56 oraz u storczyka Bulbophyllum vaginatum; 57 i 2,7-dihydroksy-3,4,6-trimetoksy- 9,10-dihydrofenantren (4, ranga 1, wynik 0,88, liczby SI{{33 }} i SI-16) postawiono w BC1_F2. Związek 4 został już opisany w senegalskim propolisie58, a jego obecność została potwierdzona na podstawie danych zgłoszonych przez Pettit et al. z afrykańskiego drzewa Combretum caffrum59 oraz Lu et al. z Dioscorea nipponica Makino.60

Proces dereplikacji oparty na 13C NMR przewidział również 2,6-dihydroksy-3,4,7-trimetoksy-9,10-dihydrofenantren (5, ranga 8, wynik 0.76, rysunki SI-15 i SI-16) w BC1_F2 i 2,6,7-trihydroksy{{2{26}} }},4-dimetoksy-9,10-dihydrofenantren (1, ranga 2, wynik 0,5, liczby SI-5 i SI-6 ) w BC{{30}}F{31}}, gdy zastosowano filtr molekularny o MW 288 Da. Dla 1 wynik był dość niski (0,5); w związku z tym przeprowadzono dodatkowe eksperymenty 2D NMR (heterojądrowe wielokrotne korelacje kwantowe [HMQC], heterojądrowa łączność wiązań wielokrotnych [HMBC], jądrowa spektroskopia efektu Overhausera [NOESY], por. rysunki SI-7–SI-10) wykonane w celu potwierdzenia struktury; dla 5 wynik wyniósł 0,76, tj. był wyższy niż 0,70. Te dwa NP (1 i 5) zostały po raz pierwszy wspomniane przez Letchera i in. w gatunku Combretum61,62 i 1 stwierdzono już w senegalskim propolisie.58

Wśród pochodnych fenantrenu MixONat postawił hipotezę 2,6,7-trihydroksy-3,4-dimetoksyfenantrenu (2, ranga 1, wynik 0,88, liczby SI-11 i SI{{10}}) w BC1_F8-1, co zostało potwierdzone przez porównanie z danymi spektralnymi opisanymi przez Letchera i in. w Combretum apiculatum. 61 2,7-dihydroksy-3,4,6-trimetoksyfenantren (6, ranga 5, wynik 0,94, liczby SI-17 i SI-18) wcześniej wyizolowany z Photolida Chinensis63 sugerowano w BC1_F4.

Combretastatin B{{0}} (7), dihydrostilben, został zasugerowany przez MixONat w pierwszym rzędzie (ocena 1,0, rysunki SI-17 i SI-19) w BC1 EPP podczas stosowania filtr MW (MW 304 Da) i zweryfikowano przez porównanie z danymi NMR opisanymi przez Pettit et al. w Combretum caffrum. 59

Związki 2, 6 i 7 zostały już zidentyfikowane w senegalskim propolisie.58

Dane 1H i 13C NMR 1–7 są dostępne w informacjach pomocniczych.

W przypadku BC2 zidentyfikowano siedem związków należących do dwóch klas strukturalnych polifenoli, pochodnych chromonu-C-glukozydu i prenylflawanonu (8–14), z których niektóre opisano po raz pierwszy w propolisie (ryc. 3).

Proces oparty na 13C NMR przy użyciu MixONat i DB1 do DB5 nie dał odpowiednich wyników sugerujących oryginalne NP. Dwa główne produkty (8–9) zostały w pełni scharakteryzowane jako mieszanina przy użyciu widm masowych oraz danych 1D i 2D NMR (1H, 13C, HMQC, HMBC, por. Rysunek SI-20–SI-23) i zidentyfikowane jako florin (8) i izobiflorin (9), dwa chromanono-Cglukozydy nowo opisane w propolisie, wcześniej opisane odpowiednio w Pancratium biflorum64 i goździkach Eugenia caryophyllata.65

Jeśli chodzi o pochodne flawanonu, spośród 688 NP w DB3, MixONat zaproponował 6-prenylonaringeninę (10, ranga 1, wynik 0,95, liczby SI- 24 i SI{{8 }}) opisane już w nigeryjskim czerwonym propolisie66 w pne {{10}}F7-1 p.n.e. 6,8-diprenylaromadendryna (12, pozycja 1, punktacja 1.0, liczby SI-28 i SI-29) oraz 6,8-diprenylonaringenina (lonchocarpol A ) (13, ranga 10, wynik 0,84, liczby SI-30 i SI-31), znalezione wcześniej w próbkach propolisu z Kamerunu, 42 zostały potwierdzone w BC2_F{ odpowiednio {30}} i BC{31}}F5. 6-Geranylnaringenina (14, ranga 1, wynik 0,84, liczby SI-32 i SI-33), opisana wcześniej w propolisie z Wysp Salomona,67 została postawiona hipoteza i potwierdzona w BC{{41 }}P7-5. Wreszcie, 6-dimetyloallilo naringenina (11) została zasugerowana na drugiej pozycji przez MixONat w BC2_F6 (ranking 2, wynik 0,65, rysunki SI-26 i SI- 27). Izomer w pozycji 8 zaproponowano w pierwszej pozycji, ale porównanie z danymi literaturowymi 68,69 wykazało, że jest to izomer w pozycji 6. Związek 11 był nowy w propolisie, ale już opisany w organicznych ekstraktach z Monotes africanus. 70 1 Dane H i 13C NMR 8–14 są dostępne w informacjach pomocniczych.

【Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】