Apoptotyczny wpływ polisacharydów Cistanche na białaczkę

Autor:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,i inni.

Mongolia Wewnętrzna, Chiny

Aby zbadać efekt apoptotycznyPolisacharydy Cistanche( CDP) na człowiekuostra białaczkalinia komórkowa komórki Jurkata．MetodyW celu wykrycia wpływu CDP na proliferację komórek zastosowano test MTT, Wykorzystano Western blot do wykrycia aktywacji kaspazy-9 i kaspazy-3, badano również apoptotyczne cząsteczki sygnałowe．wynikiProliferacja limfocytów T została zahamowana o 1 mg/ml i 2 mg/ml CDP, Apoptoza limfocytów T była indukowana przez 5 mg / ml CDP, orazekspresje pro-kaspazy-9 i pro-kaspazy-3 uległy znacznemu zmniejszeniu． Ekspresja receptorów powierzchniowych komórek CD45 i CD71 została znacząco zahamowana przez 5 mg/ml CDP, Indukowano fosforylację EＲK, i fosforylacja JNK została zahamowana．

Wnioski

【Słowa kluczowe】Polisacharydy Cistanche; apoptoza; Ｒeceptor; kaspaza-9; kaspaza-3

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) jest złośliwą chorobą klonalną układu limfatycznego o wysokim stopniu niejednorodności immunofenotypu. , łatwe do nawrotu i tak dalej. Obecnie powszechnie stosowane metody leczenia obejmują przeszczep szpiku kostnego, terapię indukcyjną, immunoterapię, chemioterapię skojarzoną itp. Ze względu na ograniczoną zdolność większości leków chemioterapeutycznych do celowania i zabijania nowotworów, mogą one powodować poważne uszkodzenia układu pokarmowego, układu krwionośnego, sercowo-naczyniowe i mózgowo-naczyniowe itp. Podczas leczenia często towarzyszą mu poważne działania niepożądane, z których niektóre są nawet śmiertelne. W miarę postępu chemioterapii organizm ma tendencję do rozwijania tolerancji na leki chemioterapeutyczne, zwiększając ryzyko nawrotu choroby.

Dlatego też w centrum uwagi znalazły się poszukiwania wysoce skutecznej, niskotoksycznej i wysoce ukierunkowanej terapii białaczki lub terapii adiuwantowej.Cistanchew języku mongolskim nazywa się Chagangaoya. Należy do rodziny Ledangaceae i rodzaju Cistanche. Pasożytuje na korzeniach drzew pustynnych i ma reputację „pustynnego żeń-szenia”.

Główne składniki aktywne Cistanche to glikozydy fenyloetanoidowe, lignany, betainy, sterole, aminokwasy i polisacharydy. Działanie przeciwzapalne, przeciwwirusowe, przeciwutleniające, regulujące odporność i inne.

Badania wykazały, żepolisacharyd Cistanche (CDP),jako jeden z jego głównych składników aktywnych,ma działanie przeciwnowotworowe i immunomodulujące.Naukowcy odkryli, że CDP ma znaczący wpływ na komórki białaczkowe K562 i THP-1 i zasugerowali, że CDP odgrywa pewną rolę wzapobieganie lub leczenie białaczki. Ponadto w tradycyjnej medycynie chińskiej związek cistanche, do leczenia ostrychbiałaczka, Cistancheodgrywa również rolę jako jeden z ważnych składników. Jednak specyficzny mechanizm działaniaCistanchejest nieznany. W tym artykule izolacja i oczyszczanieCistanche CDPzbadano efekt zabijania i powiązany mechanizm CDP na ludzką linię komórkową ostrej białaczki Jurkat.

1.1 Główne odczynniki i instrumenty

Proszek Cistanche został zakupiony w Syczuanie WecistancheGroup Co, Ltd., ludzką linię komórkową ostrej białaczki Jurkat zakupiono z banku komórek Shanghai Institute of Cell Biology, błękit tiazolowy (MTT) i dodecylosiarczan sodu (SDS) zakupiono od Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., płodowa surowica bydlęca (FBS) została zakupiona w Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., kaspaza zawierająca cysteinę-3, kaspaza-9, CD71, CD45, fosforylowana kinaza aminokońcowa c-Jun (p -JNK) i fosforylowane przeciwciała kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (p-ERK) zakupiono od Cell Signaling Technology, USA, a przeciwciała aktynowe zakupiono od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Elektrochemiczny Substrat luminescencyjny (ECL) zakupiono od Thermo Scientific Company ze Stanów Zjednoczonych, a inne odczynniki były krajowej klasy analitycznej. Gel-View 6000 plus inteligentna stacja robocza obrazu (produkt Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), odwrócony mikroskop fluorescencyjny Revolve FL (produkt Echo Laboratories, USA), czytnik mikropłytek EPOCH (produkt Beijing Bo Teng Instrument Co., Sp. z o.o.).

1.2 Oddzielanie i oczyszczanie CDP Weź 500 gProszek z ekstraktu z Cistanche, namoczyć przez noc w 95 procentowym etanolu, przefiltrować przez gazę, zebrać pozostałości po filtrze, gotować w gorącej wodzie o temperaturze 60 stopni przez 2 godziny/raz, w sumie 3 razy. Po zakończeniu przesącze połączono trzykrotnie, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do 2/3 pierwotnej objętości, dodano 3 razy objętość 95 procentowego etanolu i pozostawiono na noc w temperaturze 4 stopni. Następnego dnia wirować przy 4 000 obr/min przez 10 min, zebrać osad, usunąć białko metodą Sevaga, wytrącić etanolem absolutnym, liofilizować w celu uzyskania CDP.

1.3 Hodowla komórkowa Linię komórek ludzkiej ostrej białaczki przechowywano w ciekłym azocie w laboratorium Jurkat. Po zastosowaniu komórki szybko odzyskiwano w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni i hodowano w pożywce RPMI1640 (zawierającej 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny) z 10% FBS. Komórki hodowano w 37-stopniowym inkubatorze z 5% CO2, pasażowano co 2 do 3 dni, a eksperymenty prowadzono, gdy komórki weszły w logarytmiczną fazę wzrostu.

1.4 Eksperyment MTT Komórki Jurkata w fazie wzrostu logarytmicznego pobrano, odwirowano w celu uzyskania osadu komórkowego i zliczono przy 5 x 105 komórek/ml. Wziąć 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zaszczepić 100 ul komórek w każdym dołku, a następnie dodać 100 ul kompletnej pożywki RP-MI1640 jako grupę kontrolną; grupę doświadczalną podzielono na 3 grupy, używając najpierw pożywki RPMI1640 do przygotowania różnych stężeń CDP, a następnie dodając 100 ul pożywki RP-MI1640 do każdego dołka. Użyto ul komórek Jurkat i 100 ul roztworu CDP do uzyskania końcowego stężenia CDP odpowiednio 1, 2 i 5 mg/ml. Każdą grupę założono z 5 duplikatami studzienek i inkubowano w 37-stopniowym inkubatorze komórkowym przez 48 godzin. Po inkubacji dodaj 20 ul MTT (stężenie roztworu podstawowego wynosi 5 mg/ml) do każdego dołka, umieść go z powrotem w inkubatorze komórek i kontynuuj inkubację przez 4 godziny, a na koniec dodaj 100 ul 20 procent SDS do rozpuszczenia formazanu w temperaturze 37 stopni przez noc i użyj go następnego dnia. Absorbancję przy 570 nm każdej grupy wykrywano za pomocą czytnika mikropłytek, a stopień inhibicji różnych stężeń CDP na proliferację komórek Jurkat obliczono ze wzoru.

1.5 Western blot Komórki Jurkat w fazie wzrostu logarytmicznego pobrano i wysiano na płytce 6-dołkowej z gęstością 2 × 105 komórek/ml, 500 ul/dołek i 500 ul kompletnej pożywki RPMI1640 dodano do kontroli Grupa. Skonfiguruj 3 grupy eksperymentalne, 1, 2 i 5 mg/ml grupy leczone polisacharydem, CDP

Rozpuszczone wcześniej w pełnej pożywce RPMI1640, 500 ul komórek i 500 ul roztworów CDP o różnych stężeniach dodano do płytki z dołkami 6- i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 48 godzin. Po hodowli, zawiesiny komórek z każdej grupy zebrano, odwirowano przy 1 500 obr/min przez 5 min w celu uzyskania osadu komórkowego i przemyto dwukrotnie wstępnie schłodzoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Po przemyciu do każdej grupy dodano 20 ul buforu do lizy komórek i komórki poddano lizie na lodzie przez 30 min. Całkowite białko wyekstrahowano i stężenie komórek doprowadzono metodą Bradforda. Z każdej grupy pobrano 20 ug białka do elektroforezy w żelu SDS-poliakrylamidowym (PAGE) i białko przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) przez elektroporację. Zablokowano odtłuszczonym mlekiem w proszku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, dodano królicze przeciwciała przeciwko ludzkiej kaspazie-3 i kaspazie-9 w stosunku rozcieńczenia 1:1 000, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h, płukać 3 razy w wytrząsarce z buforem fosforanowym Tween (PBST) (10 min/czas), dodać drugorzędowe przeciwciało znakowane peroksydazą chrzanową (HRP) (1:1 000), inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, przepłukać 3 razy PBST, 1 raz przepłukać PBS, dodać substrat ECL i użyć Do obrazowania zastosowano stację roboczą inteligentnego obrazu, a zmiany prążków w każdej grupie porównano w celu zbadania apoptozy komórek Jurkat indukowanej przez CDP. W przypadku wykrywania białek związanych ze szlakiem apoptozy warunki hodowli komórek i leczenia CDP były takie same jak powyżej. Po reakcji komórki poddano lizie w celu oznaczenia ilościowego białka. Białko przeniesiono na membranę PVDF przez SDS-PAGE i elektroporację. Po zablokowaniu odtłuszczonym mlekiem w proszku przez 1 godzinę, dodano przeciwciała anty-CD71, CD45, p-JNK i p-ERK (1:1 000) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Znakowane HRP przeciwciało drugorzędowe (1:1 000) inkubowano przez 1 godzinę, a na koniec do obrazowania wykorzystano inteligentną stację roboczą do obrazowania w celu zbadania powiązanych cząsteczek sygnałowych apoptozy komórek Jurkat indukowanej przez CDP. Otrzymane eksperymentalne prążki zostały wyskalowane w skali szarości za pomocą obrazu J (1.8.0).

Kliknij tutaj, aby poznać wpływ Cistanche na działanie przeciwnowotworowe i przeciwnowotworowe

1.6 Analiza statystyczna Oprogramowanie SPSS21.0 zostało użyte do testu t i analizy wariancji

2 wyniki funkcji Cistanche włączonebiałaczka

2.1 Poziom proliferacji komórek

CDP został pomyślnie wyizolowany, mając ponad 9{{20}} procent zawartości cukru i mniej niż 5 procent zawartości białka. Stopień hamowania proliferacji komórek w grupie otrzymującej 1 mg/ml CDP wynosił (19,1 ± 2,1) procent, podczas gdy w grupie 2 mg/ml i 5 mg/ml CDP wynosił (44,2 ±5,2) ) ) procent i (47,8 ± 4,4) procent, co wskazuje, że CDP może znacząco hamować proliferację komórek Jurkat w sposób zależny od dawki. 2.2 W porównaniu z grupą kontrolną (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), poziom apoptozy w komórkach Jurkat traktowanych 5 mg/ml CDP skutkował powstaniem enzymów kaspazy-9 i kaspazy{{30}}. Pro-forma pro-kaspaza-9 ( 0. 09 ± 0. 02) i pro-kaspaza-3 ( {{ 63}}.12 ± {0.01) były znacznie zmniejszone, a grupy 1 mg/ml i 2 mg/ml CDP były znacząco mniej skuteczne w przypadku prokaspazy-3 w komórkach. Zawartość kaspazy-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) i prokaspazy-3 (0,48±0,04, 0,44±0,05) nie miała istotnego wpływu, to znaczy była niska Stężenie CDP nie indukowało apoptoza komórek Jurkat, ale głównie hamowała proliferację komórek, jak pokazano na rycinie 1.

1-4: grupa referencyjna,

grupa 1 mg/ml CDP, grupa 2 mg/ml CDP, grupa 5 mg/ml CDP; taki sam jak na poniższym rysunku!

Rysunek 1 Wpływ CDP na kaspazę-9 i kaspazę-3 w komórkach Jurkata

Wpływ polisacharydów Cistanche Wpływ na białaczkę

2.3 Względne poziomy ekspresji CD71 i CD45 w grupie kontrolnej receptora apoptozy wynosiły 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. Grupa 5 mg/ml CDP może znacząco hamować CD71 (0.05±0.02). 01) i CD45 (0.13 ± {{40}}.03); Grupy CDP 1 mg/ml i 2 mg/ml mogły hamować ekspresję CD71 (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) do pewnego stopnia. Nie stwierdzono istotnego wpływu na ekspresję CD45 (0,51 ±0,01, 0,48±0,02). Zobacz rysunek 2.

Rycina 2 Wpływ CDP na ekspresję receptorów na powierzchni błony komórkowej

2.4 Szlaki związane z apoptozą

Względne poziomy ekspresji p-JNK i p-ERK w grupie odniesienia wynosiły 1,20±0.08 i 0.21±0 .03, odpowiednio. Grupa 5 mg/ml CDP indukowała apoptozę i znacząco obniżała poziom fosforylacji JNK. ( 0, 32 ± 0. 04), znacznie zwiększył poziom fosforylacji ERK (1,13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP zwiększało poziom fosforylacji JNK (1,12 ± 0, 06 , 1,06 ± 0,06) nie miało istotnego wpływu, ale nadal zwiększało poziom fosforylacji ERK (0,54 ± 0,04, 0,63 ± 0,02). Zobacz rysunek 3.

Rysunek 3 Wpływ CDP na fosforylację JNK i ERK

3 Dyskusja

W ostatnich latach badania wykazały, że CDP ma pewien wpływ hamujący na linie komórkowe białaczki, ale specyficzny mechanizm działania nie jest jeszcze znany.

W procesie apoptozy kaspaza-9 jest jedną z cząsteczek sygnalizacyjnych poprzedzających proces apoptozy zależnej od kaspazy. Po stymulacji sygnału prokaspaza-9 jest masowo hydrolizowana, aby wytworzyć aktywowaną formę rozszczepionej kaspazy-9, która kontynuuje przekazywanie sygnałów apoptotycznych w dół, aby promować proces apoptozy. Kaspaza-3 jest cząsteczką kaspazy typu efektorowego i jest kluczową cząsteczką sygnałową w procesie apoptozy komórkowej zależnej od kaspazy. W normalnych warunkach występuje również w postaci proenzymu (prokaspazy-3). Po aktywacji przez hydrolizę powstaje duża ilość rozszczepionej kaspazy. -3 spowoduje lizę różnych kluczowych cząsteczek białka w komórkach i ostatecznie wywoła apoptozę. CDP należy do aktywnych polisacharydów makrocząsteczek biologicznych i nie może swobodnie wnikać do komórek przez błonę komórkową. Dlatego CDP indukuje apoptozę, wpływając na ekspresję i dystrybucję receptorów na powierzchni błon komórkowych Jurkat, tym samym przekazując sygnały do ​​wnętrza komórek i ostatecznie aktywując rodzinę kaspaz. białko, co prowadzi do apoptozy komórek. Badanie to pokazuje, że niskie stężenie CDP nie indukuje apoptozy komórek Jurkat, ale przede wszystkim hamuje proliferację komórek. CD71, znany również jako receptor transferyny, jest transbłonowym receptorem glikoproteinowym typu II zaangażowanym w wchłanianie żelaza oraz regulację wzrostu i rozwoju komórek. CD71 jest silnie wyrażany u pacjentów z ostrą białaczką i jest związany z pierwotną lekoopornością, czyli ekspresją CD71. Im wyższa wartość, tym gorszy efekt pierwszej chemioterapii. Dlatego CD71 jest jednym z markerów diagnostyki pomocniczej. CD45 ulega ekspresji na powierzchni wszystkich typów leukocytów, znanych również jako wspólny antygen leukocytów. Należy do glikoproteiny transbłonowej typu I i jest ściśle związana z rozwojem i różnicowaniem limfocytów T. CD45 ma różne poziomy ekspresji i typy allosteryczne w różnych typach białaczki, dzięki czemu może być stosowany jako jeden z markerów w diagnostyce różnicowej i immunofenotypowaniu białaczki. Przeciwciało monoklonalne CD45 jest szeroko stosowane w leczeniu białaczki, zwłaszcza białaczki lekoopornej. Friesena i in. stwierdził, że radionuklidy

Znakowane mAb CD45 może indukować apoptozę w lekoopornych liniach komórkowych białaczki poprzez aktywację białek z rodziny kaspaz (w tym kaspazy-3, kaspazy-8 i kaspazy-9). CDP indukuje apoptozę komórek Jurkat, najpierw działając na receptory powierzchniowe błony komórkowej CD45 i CD71, wpływając na ekspresję i dystrybucję tych dwóch, przekazując sygnały apoptozy do komórek, a w końcu aktywując kaspazę-9 i kaspazę{{8 }}, wywołując apoptozę. Jednak zarówno kaspaza-9, jak i kaspaza-3 znajdują się poniżej szlaku apoptotycznego i konieczne jest dalsze badanie cząsteczek sygnalizacyjnych powyżej. W tym badaniu CDP w stężeniu 5 mg/ml indukował apoptozę komórek Jurkat, jednocześnie hamując ekspresję CD45, która była podobna do opisanej powyżej przeciwciała monoklonalnego CD45. Dlatego z punktu widzenia receptorów CD45 i CD71 związanych z apoptozą,Cistanchema pewien potencjał do leczenia lub leczenia uzupełniającego białaczki.Systemy kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAPK) ulegają ekspresji we wszystkich komórkach eukariotycznych.

Tabletki Cistanche do poprawy układu odpornościowego w leczeniu białaczki

Jest to bardzo ważny szlak przekazywania informacji, który prowadzi zewnątrzkomórkową transdukcję sygnału stymulującego do wewnątrzkomórkowego i składa się z kinaz białkowych serynowo/treoninowych, w tym ERK, JNK i p38MAPK. Jego fosforylacja i defosforylacja są przełącznikami czynności życiowych komórki i biorą udział w oraz regulują proces wzrostu, proliferacji, różnicowania, aktywacji i apoptozy komórek. Badanie to sugeruje, że defosforylacja JNK jest zaangażowana w apoptozę komórek T indukowaną przez CDP, podczas gdy fosforylacja ERK jest zaangażowana w dwa procesy, w których CDP hamuje proliferację komórek i indukuje apoptozę.

Podsumowując,Cistanche CDPma działanie cytotoksyczne na linię komórkową T-limfocytowej białaczki Jurkat, wykazując, że niskie stężenia (poniżej 2 mg/ml) hamują proliferację komórek, podczas gdy wysokie stężenia (5 mg/ml) indukują apoptozę.Cistanche CDPindukuje apoptozę w komórkach Jurkat głównie poprzez oddziaływanie na komórki i ich zmianę.

Ekspresja związanych z apoptozą receptorów CD71 i CD45 na powierzchni błony przekazuje sygnały do ​​wnętrza komórek, powodując następnie fosforylację ERK i defosforylację JNK, a w końcu aktywację kaspazy-9, która z kolei aktywuje kaspazę{{4} } do wywołania apoptozy.