Okrągły RNA CircDVL1 hamuje progresję raka jasnokomórkowego nerki przez oś MiR-412-3p/PCDH7

Abstrakcyjny

Rak jasnokomórkowy nerek (ccRCC) jest pierwotnym rakiem nerki o wysoce agresywnym fenotypie i wyjątkowo złym rokowaniu. Coraz więcej dowodów sugeruje, że koliste RNA (circRNA) odgrywają kluczową rolę w występowaniu i rozwoju różnych ludzkich nowotworów. Jednak ekspresja, znaczenie kliniczne i rola regulacyjna circRNA w ccRCC pozostają w dużej mierze niejasne. Tutaj informujemy, że circDVL1 jest zmniejszony w surowicach i tkankach pacjentów z ccRCC i ujemnie koreluje ze złośliwymi cechami ccRCC. Nadekspresja circDVL1 hamuje proliferację, indukuje zatrzymanie G1 / S, wyzwala apoptozę oraz zmniejsza migrację i inwazję w różnych komórkach ccRCC in vitro. Odpowiednio, nadekspresja circDVL1 hamuje rakotwórczość ccRCC w mysim modelu heteroprzeszczepu. Mechanicznie circDVL1 służy jako gąbka dla onkogennego miR-412-3p, zapobiegając w ten sposób represji docelowej protokadheryny 7 (PCDH7) za pośrednictwem miR-412-3p w komórkach ccRCC. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że circDVL1 wywiera działanie hamujące guz podczas progresji ccRCC przez oś circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 i sugeruje, że circDVL1 może być nowym markerem diagnostycznym i prognostycznym oraz celem terapeutycznym dla ccRCC.

Słowa kluczowe

cyrkDVL1; Rak nerkowokomórkowy; miR-412-3p; PCDH7; biomarker

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się, jakie są zalety Cistanche

Wstęp

Rak nerkowokomórkowy (RCC) jest niezwykle śmiercionośnym nowotworem złośliwym układu urologicznego, mającym poważny wpływ na zdrowie człowieka [1]. Częstość występowania RCC wzrosła w ostatnich dziesięcioleciach, w 2020 roku w Stanach Zjednoczonych zdiagnozowano 73 750 nowych przypadków [2, 3]. RCC jasnokomórkowy (ccRCC), najczęstszy i najbardziej agresywny podtyp RCC, odpowiada za 70–75 procent przypadków RCC [4]. Co ważne, ponad 30 procent pacjentów z ccRCC ma przerzuty w początkowej fazie diagnozy. Co więcej, chociaż radykalna operacja jest główną opcją leczenia pierwotnego ccRCC, nadal około 40 procent pacjentów doświadczyło nawrotu i przerzutów z 5-}letnim całkowitym przeżyciem poniżej 10 procent [5, 6]. Te dylematy podkreślają pilną potrzebę zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju ccRCC, zarówno jako biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych, jak i potencjalnych celów terapeutycznych.

Okrągłe RNA (circRNA) to niekodujące RNA o jednołańcuchowej strukturze zamkniętej pętli, która czyni je wysoce stabilnymi [7, 8]. Ostatnie badania wykazały, że circRNA występują obficie we krwi [9, 10], ślinie [11] i egzosomach [12], co wskazuje, że mogą one służyć jako nowe biomarkery diagnostyczne [13]. Biorąc pod uwagę, że płynna biopsja jest mniej inwazyjna niż tradycyjna biopsja tkanki [14], circRNA uznano za cenne narzędzia prognostyczne w medycynie precyzyjnej [15-17]. W szczególności kilka circRNA, takich jak cricNOX4, circEGLN3 i circPRRC2A, może działać jako potencjalne biomarkery do diagnozy i/lub rokowania RCC, co podsumowano w naszym ostatnim przeglądzie [18]. Ponadto obecne badania koncentrują się głównie na naprzemienności ekspresji circRNA w tkankach ccRCC [19, 20], jednak ich poziomy w biopsji płynnej pozostają w dużej mierze nieznane, co utrudnia eksplorację potencjalnych biomarkerów. Ponadto, chociaż wykazano, że kilka circRNA, w tym circHIAT1 [21], circ-AKT3 [22] i cRAPGEF5 [23], odgrywa ważną rolę w inicjacji i progresji ccRCC [18], systematyczne badanie circRNA zaangażowanych w ccRCC rozwoju, jak również leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych, wciąż brakuje.

Tutaj najpierw określiliśmy ekspresję circRNA w próbkach surowicy od pacjentów z ccRCC i zdrowych kontroli za pomocą mikromacierzy circRNA. Co istotne, zidentyfikowaliśmy nowy związany z ccRCC circRNA circDVL1 (identyfikator tuszy: hsa_circ_ 0009267), który jest zakodowany w genie DVL1. CircDVL1 jest znacznie zmniejszony w surowicy od pacjentów z ccRCC, a jego ekspresja jest odwrotnie skorelowana z oceną ccRCC Fuhrmana, co sugeruje potencjał jako biomarkera. Ponadto CircDVL1 zmniejsza się w tkankach nowotworowych ccRCC. Odpowiednio, circDVL1 może hamować proliferację, indukować zatrzymanie cyklu komórkowego, wyzwalać apoptozę i zmniejszać migrację i inwazję komórek ccRCC. Z mechanicznego punktu widzenia circDVL1 działa jak gąbka miR-412-3p do regulacji w górę ekspresji PCDH7. Łącznie odkrycia te identyfikują circDVL1 jako supresor guza dla ccRCC i sugerują jego potencjał zarówno jako biomarkera diagnostycznego, jak i celu terapeutycznego.

Suplement Cistanche

Materiały i metody

1. Próbki kliniczne

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Zhejiang (2021-104). Osiemnaście dopasowanych próbek ccRCC i przylegających tkanek nienowotworowych pobrano od pacjentów z ccRCC. Po zabiegu preparaty szybko zakonserwowano w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w -80 stopniach do dalszego wykorzystania. Pobrano próbki surowicy od 60 pacjentów z ccRCC i 66 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Następnie próbki poddano obróbce odpowiednimi metodami, a otrzymaną surowicę przechowywano w temperaturze -80 stopni do dalszego wykorzystania.

2. Linie komórkowe i hodowla komórkowa

Wszystkie linie komórkowe zakupiono z National Collection of Authenticated Cell Cultures (Chiny). Komórki 786-O i Caki-1 hodowano w RPMI 1640 (HyClone), komórki ACHN hodowano w MEM (HyClone), a komórki 293T hodowano w pożywce DMEM (Gibco). Wszystkie pożywki do hodowli komórkowych uzupełniono 10% płodową surowicą bydlęcą (Gibco) i 1% mieszaniną penicyliny i streptomycyny (Gibco). Hodowle komórkowe utrzymywano w nawilżanym inkubatorze w 37 stopniach i 5% CO2₂.

3. Analiza mikromacierzy CircRNA

Profilowanie mikromacierzy CircRNA w próbkach surowicy przeprowadzono przy użyciu Arraystar human CircRNA Array V2 (Capital Biotechnology, Chiny). Do podsumowania danych, normalizacji i kontroli jakości mikromacierzy użyto oprogramowania GeneSpring V13.0 (Agilent Technologies). CircRNA z progiem krotności zmiany Większy lub równy 2 i Mniejszy niż lub równy -2 i wartość P < 0, 05 uznano za statystycznie istotne. Hierarchiczną analizę skupień przeprowadzono przy użyciu znormalizowanej odległości euklidesowej z pełnym powiązaniem.

4. Sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) i analiza danych

Sekwencja RNA nowej generacji została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem [24, 25]. Do sekwencjonowania RNA zastosowano miR-412-3p i kontrolne komórki 786-0 transfekowane mimikiem. Budowa biblioteki i analizy bioinformatyczne surowych danych zostały przeprowadzone przez Novogene Co., Ltd. (Pekin, Chiny). Dane seq RNA zdeponowano w Gene Expression Omnibus (GEO) pod numerem dostępu GSE175492.

5. Ekstrakcja RNA i ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

RT-qPCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [26, 27]. Całkowity RNA wyizolowano z surowicy, komórek i tkanek nowotworowych przy użyciu odczynnika AG RNAex Pro (AG, Hunan, Chiny). W celu wykrycia circRNA, 1 μg całkowitego RNA trawiono RNazą R (3 U/μg, Epicenter Technologies, Madison, USA, nr kat. RNR07250) w 37 stopniach przez 10 min i wygenerowano komplementarny DNA (cDNA) przy użyciu HiScript II 1st Zestaw do syntezy nici cDNA (Vazyme). Poziomy ekspresji circRNA i mRNA znormalizowano do -aktyny. Aby określić ekspresję miRNA, przeprowadzono odwrotną transkrypcję za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici miRNA miR-XTM (Takara Bio USA, CA, USA, nr kat. 638313) z ekspresją U6 (Rnu6–1) jako kontrolą endogenną. Względny poziom ekspresji RNA określono metodą 2-ΔΔCt. Wszystkie sekwencje starterów do analizy qRT-PCR przedstawiono w Tabeli S2.

6. Konstrukcja plazmidu i stabilna transfekcja

W celu skonstruowania wektora nadekspresyjnego circDVL1 i circDVL1-MUT, sekwencję circDVL1 i zmutowaną sekwencję circDVL1 sklonowano do wektora egzonowego pcDNA 3.1(plus) Laccase 2 MCS, który zamówiono w firmie Addgene (nr 69893) [28]. Komórki ACHN i 786- O transfekowano circRNA i wektorami kontroli negatywnej przy użyciu Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Po 48 godzinach stabilnie transfekowane komórki eksprymujące circDVL1 selekcjonowano przez dodanie 800 ug/ml G418 do pożywki hodowlanej.

7. Żywotność komórek

Test żywotności komórek określono za pomocą zestawu CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonia, nr kat. CK04), jak opisano wcześniej [29]. Komórki 786-O i ACHN circDVL1 z nadekspresją i komórki kontrolne wysiano w 96- płytkach studzienkowych. Roztwór CCK8 (10 μl) dodano we wskazanym czasie i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 2 godziny, a absorbancję zmierzono za pomocą spektrofotometru.

Herba Cistanche

8. Tworzenie kolonii

Testy tworzenia kolonii przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [24]. ACHN (800 komórek/dołek) i 786-O (400 komórek/dołek) hodowano przez 10 dni, a następnie utrwalano 4% paraformaldehydem przez około 30 minut, a następnie barwiono 0,1% roztwór fioletu krystalicznego przez około 15 min. Klony zawierające więcej niż 50 komórek liczono jako pojedynczą kolonię.

9. Analiza cyklu komórkowego

Komórki synchronizowano w pożywce RPMI 1640 bez FBS przez noc i przełączano na pożywkę z 10% FBS na następne 48 godzin. Komórki przemyto, ponownie zawieszono w 70% etanolu w PBS i przechowywano w -20 stopniach przez noc. Następnie komórki barwiono roztworem jodku propidyny (PI) zawierającym RNazę A do analizy cyklu komórkowego.

10. Analiza apoptozy

Analizę apoptozy komórek ACHN i 786-O przeprowadzono za pomocą zestawu do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC/PI (Beijing Biosea Biotechnology, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta.

11. Testy migracji i inwazji komórek

In vitro zdolność migracji komórek oceniano przy użyciu komór transwell z membranami poliwęglanowymi o porach 8 μm (Millipore, MA, USA). Testy inwazji komórek przeprowadzono z komorami transwell pokrytymi 100 μl Matrigel (BD Biosciences, USA). 786- Komórki O (2 x 104) lub komórki ACHN (4 x 104) zawieszono w 200 μl RPMI 1640 bez surowicy i wysiano do górnych komór transwell, a następnie dodano 600 μl pożywki zawierającej 20% FBS do dolnych komór. Następnie komórki hodowano przez 24 godziny, aby zmierzyć migrację i przez 48 godzin, aby ocenić inwazję. Komórki w górnej komorze ostrożnie zeskrobano, a komórki w dolnym przedziale utrwalono 4% paraformaldehydem i zabarwiono fioletem krystalicznym. Uzyskano obrazy i komórki zliczono pod mikroskopem.

12. Western blot

Całkowite białko ekstrahowano, oznaczano ilościowo i rozdzielano na 10% żelach SDS-PAGE, a następnie przenoszono na membrany z difluorku poliwinylidenu (Millipore, MA, USA), które inkubowano z pierwszorzędową dehydrogenazą fosforanową 3- anty-gliceraldehydu (GAPDH) (Proteinch, 60004-1-}Ig), pierwszorzędowe przeciwciała anty-PCDH7 (Abcam, ab139274) w 4 stopniach przez noc.

13. Barwienie immunofluorescencyjne

Komórki wysiano na szkiełka nakrywkowe na 24 godziny i utrwalono 4% paraformaldehydem, przepuszczano 0,2% Triton X{4}} przez 20 minut i inkubowano z 5% albuminą surowicy bydlęcej. Następnie komórki inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla Ki67 (1:400, ab48027, Abcam) w 4 stopniach przez noc, a następnie inkubowano z 488- skoniugowaną kozią anty-króliczą IgG (1:150, D110088, Sangon ) w temperaturze 37 stopni przez 1 godzinę. Komórki barwiono 4',6-diamidyno{21}}fenyloindolem (DAPI) i uzyskano obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica (DM4000).

14. Tworzenie guza in vivo i barwienie Ki67

Sześciotygodniowe samce nagich myszy BALB / c (zakupione od Shanghai SLAC) podzielono na 2 grupy (n {3}} dla każdej grupy). Myszy zaszczepiono w przybliżeniu 3 x 106 komórek kontrolnych lub komórek ACHN z nadekspresją circDVL1 przez wstrzyknięcie podskórne. Wielkość guza mierzono suwmiarką co 3 dni, począwszy od dnia 6 po wstrzyknięciu. Objętość guza obliczono jako długość × szerokość × wysokość/2. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (publikacja NIH 80-23, poprawiona w 1996 r.) i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Zhejiang w Hangzhou w Chinach.

Kapsułki Cistanche

15. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

Zsyntetyzowano sondę circDVL1 z podwójną digoksygeniną (DIG) - peroksydazą chrzanową (HRP) (Exon Biotechnology, Guangzhou, Chiny). Kontrolne i nadeksprymujące circDVL1 komórki ACHN hodowano na szkiełkach nakrywkowych i inkubowano ze znakowaną sondą w 37 stopniach przez 24 godziny. Po przemyciu szkiełka inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem anty-DIG w 37 stopniach przez 1 godzinę. Metodę amplifikacji sygnału tyraminy zastosowano do wykrywania sygnałów circDVL1, a komórki barwiono kontrastowo DAPI. W przypadku współ-FISH szkiełka nakrywkowe inkubowano ze znakowanym DIG circDVL1 i znakowanym biotyną miR-412-3p.

16. Test immunoprecypitacji RNA (RIP).

Testy RIP przeprowadzono za pomocą zestawu Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit (Millipore, MA, USA). 786-} Komórki O poddano lizie w kompletnym buforze do lizy RIP, a następnie inkubowano z buforem do immunoprecypitacji zawierającym kulki magnetyczne, które skoniugowano z AGO2 (Abcam, MA, USA) lub kompleksem przeciwciał IgG w 4 stopniach przez noc. Następnie immunoprecypitowane RNA testowano metodą RT-qPCR.

17. Test reporterowy z podwójną lucyferazą

Sekwencje CircDVL1, PPM1H-3'UTR i PCDH7-3'UTR, które zawierały zmutowane miejsca wiązania miR{4}}p i odpowiadające im zmutowane sekwencje, zsyntetyzowano, a następnie subklonowano do reportera lucyferazy wektor psiCHECK-2 (Promega) w celu utworzenia circDVL1-WT, circDVL1-Mut1, circDVL1-Mut2, PPM1H-3'UTR-WT, PCDH{ {14}}'UTRWT, PCDH7-3'UTR-Mut1 i PCDH7-3'UTR-Mut2 wektory. Różne sekwencje 3'UTR PPM1H i PCDH7 zawierają fragment o długości 500 bp zawierający potencjalne miejsca wiązania miR-412-3}p (oflankowane przez 250 bp). Względną aktywność lucyferazy oceniono za pomocą testu reporterowego z podwójną lucyferazą (Promega, USA). Wszystkie oznaczenia przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach.

18. Analiza statystyczna

Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia). Różnice między grupami oceniono za pomocą testu t-Studenta lub jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Różnice między grupami uznano za statystycznie istotne, gdy wartości P były <0,05.

Dyskusja

Zaproponowano i oceniono eksperymentalnie różne typy biomarkerów ccRCC, w tym mRNA [32], miRNA [33], lncRNA [34] i circRNA [35]. Jednak żaden z nich nie został potwierdzony jako dokładne biomarkery diagnostyczne do rutynowego stosowania klinicznego u pacjentów z ccRCC. Tutaj nasze badanie pokazało, że circDVL1 odgrywa ważną rolę w progresji ccRCC. Najpierw przeszukaliśmy surowicę od pacjentów z ccRCC i zdrowych kontroli, aby zidentyfikować circRNA o różnej ekspresji za pomocą mikromacierzy circRNA. Dane RT-qPCR ujawniły, że circDVL1 był dramatycznie obniżony w próbkach ccRCC. Wcześniejsze badania wykazały, że circRNA mogą służyć jako utajone biomarkery surowicy w różnych nowotworach [36, 37]. Na przykład Bei i in. wykazali, że egzosomalny has-circ-0004771 był zwiększony w surowicy pobranej od pacjentów z rakiem jelita grubego [38]. Niemniej jednak badania nad specyficzną rolą circRNA jako nieinwazyjnego biomarkera w ccRCC są nadal ograniczone. Nasze badanie ujawniło, że poziom circDVL1 był znacząco obniżony w surowicy od pacjentów z ccRCC i że zmniejszona ekspresja circDVL1 w surowicy może pochodzić z guza. Ponadto poziom circDVL1 w surowicy miał istotną wartość diagnostyczną w różnicowaniu pacjentów z guzami stopnia I-II Fuhrmana i III-IV stopnia Fuhrmana. Dlatego circDVL1 w surowicy może być obiecującym markerem diagnostycznym dla ccRCC. Jednak kilku zdrowych pacjentów wykazało niski poziom circDVL1 w surowicy, co wskazuje, że monitorowanie pacjenta wyłącznie na podstawie analizy tego krążącego RNA może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami. Dlatego wartość circDVL1 jako pojedynczego markera diagnostycznego jest nieco ograniczona i może być konieczne przeanalizowanie kombinacji różnych krążących RNA w celu uzyskania wiarygodnej prognozy rozwoju nowotworu i przerzutów.

Jako nowo zidentyfikowany circRNA, biologiczna i patologiczna rola circDVL1 nie została zbadana. W tym badaniu oceniliśmy rolę i mechanizm regulacyjny circDVL1 w ccRCC. Testy funkcjonalne wykazały, że nadekspresja circDVL1 może zmniejszać proliferację komórek ccRCC, zdolność tworzenia kolonii i potencjał rakotwórczy, prawdopodobnie z powodu zwiększonej apoptozy komórek in vitro i zahamowania rozwoju guza in vivo. Dane sugerowały, że circDVL1 może pełnić funkcję supresora guza w ccRCC.

CircRNA mogą promować inicjację i progresję nowotworu, działając jak gąbki miRNA. Dlatego zbadaliśmy, czy circDVL1 może regulować biogenezę miRNA podczas karcynogenezy ccRCC. Korzystając z oprogramowania miRanda i miRWalk, odkryliśmy, że circDVL1 ma potencjalne miejsce wiązania dla miR -412-3 p. Testy reporterowe lucyferazy wykazały bezpośredni związek między circDVL1 i miR-412-3p. Wcześniejsze badania wykazały, że miR-412-3p bierze udział w patogenezie różnych nowotworów poprzez różne mechanizmy molekularne [31, 39, 40]. Na przykład miR-412-3p odgrywał rolę onkogenną w raku okrężnicy, promując migrację, inwazję i proliferację komórek macierzystych raka [31]. Ponadto ekspresja miR{11}}p była zwiększona w pęcherzykach pozakomórkowych pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym jamy ustnej (OSCC) [39]. Podobnie, nasze wyniki sugerują, że miR-412-3p był ważnym promotorem nowotworu w ccRCC.

Cistanche w proszku

Ponadto zidentyfikowano również cel circDVL1/miR-412-3p. Protokadheryny (PCDH) to białka transbłonowe należące do nadrodziny kadheryn, które odgrywają istotną rolę w adhezji komórek i szlakach sygnałowych. PCDH7 jest członkiem rodziny PCDH i ma ugruntowaną rolę w rozpoznawaniu komórka-komórka i adhezji komórek [41]. Powszechnie wiadomo, że utrata adhezji jest wczesnym etapem inwazji komórek nowotworowych i tworzenia przerzutów. Pojawiające się dowody sugerują, że PCDH7 ulega nieprawidłowej ekspresji w różnych typach nowotworów. Na przykład, w ludzkim niedrobnokomórkowym raku płuc, PCDH7 był często nadeksprymowany i funkcjonował jako onkogen do indukowania transformacji komórkowej i promowania nowotworu płuc poprzez wzmacnianie sygnalizacji MAPK [42]. Odwrotnie, PCDH7 hamował migrację i inwazję komórek raka żołądka poprzez E-kadherynę [43]. Ponadto zmniejszoną ekspresję PCDH7 stwierdzono w raku jelita grubego [44] i pęcherza moczowego [45]. Dane te wskazują, że PCDH7 pełnił różne funkcje w różnych typach nowotworów. W tym badaniu wykazaliśmy, że poziomy PCDH7 były zmniejszone w próbkach guza ccRCC. Co ciekawe, funkcjonalne eksperymenty ratunkowe ujawniły, że właściwości circDVL1 w zakresie tłumienia nowotworów wynikają częściowo z jego wpływu na PCDH7. Nasze badanie silnie sugeruje znaczenie osi regulacyjnej circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 w progresji ccRCC.

To badanie ma kilka ograniczeń. Przetestowaliśmy trzy specyficzne siRNA dla endogennego circDVL1, ale niestety wszystkie te siRNA nie zdołały znokautować circDVL1 prawdopodobnie z powodu unikalnej struktury tego circRNA, jak również jego niskiej podstawowej ekspresji w komórkach ccRCC. Ponadto nasze wyniki wykazały, że circDVL1 może być celem terapeutycznym u pacjentów z ccRCC, wymagane są badania kliniczne z dużymi kohortami pacjentów, aby dodatkowo wykazać jego znaczenie kliniczne. W naszym badaniu nie badaliśmy przyczyny obniżenia poziomu circDVL1 w zmianach ccRCC. Doniesiono, że białka wiążące RNA (RBP), w tym quaking (QKI), białko regulujące splicing nabłonka 1 (ESRP1) i białko fuzyjne w mięsaku (FUS) biorą udział w potranskrypcyjnym tworzeniu circRNA [{{10 }}]. Ponadto niektóre czynniki transkrypcyjne (np. ZEB1, c-Myb i c-Jun) są również zaangażowane w biogenezę specyficznych circRNA [49-52]. Ponadto badania wykazały, że modyfikacja m6A pośredniczy w degradacji circRNA. Park i in. donieśli, że circRNA zmodyfikowane m6A były również regulowane w dół przez oś YTHDF2- HRSP12-RNazy P/MRP [53]. To, czy te RBP, czynniki transkrypcyjne i metylacja m6A są zaangażowane w obniżenie poziomu circDVL1, pozostaje niepewne. W naszych przyszłych badaniach postaramy się zbadać mechanizm regulacyjny circDVL1 w górę w rozwoju ccRCC i nowotworzeniu.

Podsumowując, wykazaliśmy, że poziom circDVL1 był obniżony w surowicy pacjentów z ccRCC. Warto zauważyć, że dalej badaliśmy mechanizmy regulacyjne circDVL1 i wykazaliśmy, że circDVL1 hamował powstawanie nowotworów ccRCC, promując ekspresję PCDH7 przez gąbkowanie miR -412-3 p. Dlatego nasze badanie wykazało, że circDVL1 może być potencjalnym celem terapeutycznym dla przyszłych terapii ccRCC.

Bibliografia

1.Cheng SK, Chuah KL. Przerzutowy rak nerkowokomórkowy do trzustki: przegląd. Archiwa patologii i medycyny laboratoryjnej. 2016; 140: 598-602.

2. Jonasch E, Walker CL, Rathmell WK. Jasnokomórkowy rak nerkowokomórkowy ontogenezy i mechanizmy śmiertelności. Nat Rev Nephrol. 2021; 17: 245-61.

3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Statystyki raka, 2020. CA Cancer J Clin. 2020; 70.

4. Shuch B, Amin A, Armstrong AJ, Eble JN, Ficarra V, Lopez-Beltran A, et al. Zrozumienie patologicznych wariantów raka nerkowokomórkowego: destylacja możliwości terapeutycznych ze złożoności biologicznej. urologia europejska. 2015; 67: 85-97.

5. Koul H, Huh JS, Rove KO, Crompton L, Koul S, Meacham RB i in. Molekularne aspekty raka nerkowokomórkowego: przegląd. Am J Rak Res. 2011; 1: 240-54.

6. Sanchez-Gastaldo A, Kempf E, Gonzalez Del Alba A, Duran I. Systemowe leczenie raka nerkowokomórkowego: kompleksowy przegląd. Leczenie raka Rev. 2017; 60: 77-89.

7. Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. Biogeneza, biologia i charakterystyka okrągłych RNA. Nature Recenzje Genetyka. 2019; 20: 675-91.

8. Patop IL, Wüst S, Kadener S. Przeszłość, teraźniejszość i przyszłość circRNA. Czasopismo EMBO. 2019; 38: e100836.

9. Perez de Acha O, Rossi M, Gorospe M. Okrągłe RNA w nowotworach krwi. Front Mol Biosci. 2020; 7: 109.

10. Zhang SJ, Chen X, Li CP, Li XM, Liu C, Liu BH i in. Identyfikacja i charakterystyka okrągłych RNA jako nowej klasy domniemanych biomarkerów w retinopatii cukrzycowej. Okulistyka śledcza i nauki wizualne. 2017; 58: 6500-9.

11. Bahn JH, Zhang Q, Li F, Chan TM, Lin X, Kim Y i in. Krajobraz mikroRNA, RNA oddziałującego z Piwi i kolistego RNA w ludzkiej ślinie. Chemia kliniczna. 2015; 61: 221-30.

12. Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, Zhao J i in. Okrągły RNA jest wzbogacony i stabilny w egzosomach: obiecujący biomarker w diagnostyce raka. Badania komórkowe. 2015; 25: 981-4.

13. Li S, Han L. Okrągłe RNA jako obiecujące biomarkery w raku: wykrywanie, funkcja i nie tylko. Medycyna genomowa. 2019; 11:15.

14. Ye Q, Ling S, Zheng S, Xu X. Płynna biopsja w raku wątrobowokomórkowym: krążące komórki nowotworowe i krążące DNA nowotworu. Mol Rak. 2019; 18:114.

15. Wen G, Zhou T, Gu W. Potencjał wykorzystania kolistego RNA krwi jako płynnego biomarkera biopsyjnego dla chorób człowieka. Komórka Białkowa. 2020.

16. Zhang Z, Yang T, Xiao J. Okrągłe RNA: obiecujące biomarkery dla chorób człowieka. eBioMedycyna. 2018; 34: 267-74.

17. Wang S, Zhang K, Tan S, Xin J, Yuan Q, Xu H i in. Okrągłe RNA w płynach ustrojowych jako biomarkery raka: nowa granica płynnych biopsji. Mol Rak. 2021; 20:13.

18. Wang Y, Zhang Y, Wang P, Fu X, Lin W. Okrągłe RNA w raku nerki: implikacje dla powstawania nowotworów, diagnozy i terapii. Mol Rak. 2020; 19: 149.

19. Chen D, Chen W, Xu Y, Zhu M, Xiao Y, Shen Y i in. Zwiększony immunologiczny punkt kontrolny HHLA2 w jasnokomórkowym raku nerkowokomórkowym: nowy biomarker prognostyczny i potencjalny cel terapeutyczny. J Med Genet. 2019; 56: 43-9.

20. Lv Q, Wang G, Zhang Y, Shen A, Tang J, Sun Y i in. CircAGAP1 promuje progresję nowotworu poprzez nakładanie miR-15-5p gąbką w raku jasnokomórkowym nerki. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40: 76.

21. Wang K, Sun Y, Tao W, Fei X, Chang C. Receptor androgenowy (AR) promuje migrację i inwazję jasnokomórkowego raka nerkowokomórkowego (ccRCC) poprzez zmianę circHIAT1/miR-195-5p/29a{{ 4}}p/29c-3sygnały p/CDC42. Listy raka. 2017; 394: 1-12.

22. Xue D, Wang H, Chen Y, Shen D, Lu J, Wang M i in. Circ-AKT3 hamuje przerzuty jasnokomórkowego raka nerkowokomórkowego poprzez zmianę sygnałów miR-296-3p/E-kadheryny. Rak molekularny. 2019; 18: 151.

23. Chen Q, Liu T, Bao Y, Zhao T, Wang J, Wang H i in. CircRNA cRAPGEF5 hamuje wzrost i przerzuty raka nerkowokomórkowego poprzez szlak miR-27a-3p/TXNIP. Listy raka. 2019; 469: 68-77.

24. Guo X, Lin W, Wen W, Huyghe J, Bien S, Cai Q i in. Identyfikacja nowych genów podatności na ryzyko raka jelita grubego na podstawie badania asocjacyjnego obejmującego cały transkryptom, obejmującego 125 478 osób. Gastroenterologia. 2021; 160.

25. Wang J, Nie W, Xie X, Bai M, Ma Y, Jin L i in. MikroRNA-874-3p/ADAM (dezintegryna i metaloproteaza) 19 Pośredniczy w aktywacji makrofagów i zwłóknieniu nerek po ostrym uszkodzeniu nerek. Nadciśnienie. 2021; 77: 1613-26.

26. Kun-Peng Z, Chun-Lin Z, Jian-Ping H, Lei Z. Nowe krążące hsa_circ_0081001 działają jako potencjalny biomarker do diagnozowania i prognozowania kostniakomięsaka. Int J Biol Sci. 2018; 14: 1513-20.

27. Yuan Y, Bao J, Chen Z, Villanueva AD, Wen W, Wang F i in. Analiza multiomiczna w celu identyfikacji genów podatności na raka jelita grubego. Hum Mol Genet. 2021.

28. Kramer MC, Liang D, Tatomer DC, Gold B, March ZM, Cherry S i in. Kombinatoryczna kontrola ekspresji kolistego RNA Drosophila przez powtórzenia intronowe, hnRNP i białka SR. Geny Dev. 2015; 29: 2168-82.

29. Guo X, Lin W, Bao J, Cai Q, Pan X, Bai M i in. Kompleksowa analiza cis-eQTL ujawniła docelowe geny w loci podatności na raka piersi zidentyfikowane w badaniach asocjacyjnych całego genomu. Am J Hum Genet. 2018; 102: 890-903.

30. Zhong S, Wang J, Zhang Q, Xu H, Feng J. CircPrimer: oprogramowanie do opisywania circRNA i określania specyficzności starterów circRNA. BMC Bioinformatyka. 2018; 19: 292.

31. Zhu K, Wang Y, Liu L, Li S, Yu W. Długie niekodujące RNA MBNL{2}}AS1 reguluje proliferację, migrację i inwazję nowotworowych komórek macierzystych w raku okrężnicy poprzez interakcję z MYL9 za pośrednictwem gąbczastego mikroRNA -412-3str. Kliniki i badania w dziedzinie hepatologii i gastroenterologii. 2020; 44: 101-14.

32. Schrödter S, Braun M, Syring I, Klümper N, Deng M, Schmidt D, et al. Identyfikacja transportera dopaminy SLC6A3 jako biomarkera dla pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym. Rak molekularny. 2016; 15:10.

33. Ran L, Liang J, Deng X, Wu J. miRNA w przewidywaniu rokowania w jasnokomórkowym raku nerkowokomórkowym. Biomed Res Int. 2017; 2017: 4832931.

34. Li JK, Chen C, Liu JY, Shi JZ, Liu SP, Liu B i in. Długi niekodujący RNA MRCCAT1 promuje przerzuty jasnokomórkowego raka nerkowokomórkowego poprzez hamowanie NPR3 i aktywację sygnalizacji p38-MAPK. Rak molekularny. 2017; 16: 111.

35. Sheng JQ, Liu L, Wang MR, Li PY. Okrągłe RNA w raku układu pokarmowego: potencjalne biomarkery i cele terapeutyczne. Am J Rak Res. 2018; 8: 1142-56.

36. Vea A, Llorente-Cortes V, de Gonzalo-Calvo D. Okrągłe RNA we krwi. Adv Exp Med Biol. 2018; 1087: 119-30.

37. Vo JN, Cieślik M, Zhang Y, Shukla S, Xiao L, Zhang Y, et al. Krajobraz kołowego RNA w raku. Komórka. 2019; 176.

38. Pan B, Qin J, Liu X, He B, Wang X, Pan Y i in. Identyfikacja egzosomalnego has-circ{2}} surowicy jako nowego biomarkera diagnostycznego raka jelita grubego. Genet z przodu. 2019; 10: 1096.

39. Gai C, Camussi F, Broccoletti R, Gambino A, Cabras M, Molinaro L, et al. MiRNA związane z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi śliny jako potencjalne biomarkery w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej. Rak BMC. 2018; 18:439.

40. Lenherr SM, Tsai S, Silva Neto B, Sullivan TB, Cimmino CB, Logvinenko T i in. Profil ekspresji mikroRNA identyfikuje guzy pęcherza moczowego o wysokim stopniu złośliwości, nieinwazyjne do mięśni, z podwyższonym ryzykiem progresji do fenotypu inwazyjnego. Geny (Bazylea). 2017; 8.

41. Yoshida K. Kształt i adhezja komórek fibroblastów in vitro jest zmieniana przez nadekspresję izoform 7a i 7b protokadheryny 7, ale nie izoformy 7c. Cell Mol Biol Lett. 2003; 8: 735-41.

42. Zhou X, Updegraff BL, Guo Y, Peyton M, Girard L, Larsen JE i in. PROTOCADHERIN 7 Działa poprzez SET i PP2A, wzmacniając sygnalizację MAPK przez EGFR i KRAS podczas nowotworu płuc. Rak Res. 2017; 77: 187-97.

43. Chen HF, Ma RR, He JY, Zhang H, Liu XL, Guo XY i in. Protokadheryna 7 hamuje migrację i inwazję komórek przez E-kadherynę w raku żołądka. Biol guza. 2017; 39: 1010428317697551.

44. Bujko M, Kober P, Mikula M, Ligaj M, Ostrowski J, Siedlecki JA. Zmiany ekspresji genów związanych z adhezją komórka-komórka w guzach jelita grubego. Onkol Lett. 2015; 9: 2463-70.

45. Lin YL, Wang YL, Fu XL, Li WP, Wang YH, Ma JG. Niska ekspresja protokadheryny7 (PCDH7) jest potencjalnym biomarkerem prognostycznym dla pierwotnego raka pęcherza moczowego nieinwazyjnego. Oncotarget. 2016; 7: 28384-92.

46. ​​Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, Conn VM, Salmanidis M, Phillips CA i in. Trzęsienie białka wiążącego RNA reguluje tworzenie circRNA. Komórka. 2015; 160: 1125-34.

47. Errichelli L, Dini Modigliani S, Laneve P, Colantoni A, Legnini I, Capauto D i in. FUS wpływa na ekspresję kolistego RNA w neuronach ruchowych pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Nat Komuna. 2017; 8: 14741.

48. Yu CY, Li TC, Wu YY, Yeh CH, Chiang W, Chuang CY i in. Okrągły RNA circBIRC6 uczestniczy w obwodach molekularnych kontrolujących ludzką pluripotencję. Nat Komuna. 2017; 8: 1149.

49. Lee YH, Kim HS, Kim JS, Yu MK, Cho SD, Jeon JG i in. C-my reguluje autofagię dla witalności miazgi w stresie oksydacyjnym glukozy. J Dent Res. 2016; 95: 430-8.

50. Li Q, Wang Y, Wu S, Zhou Z, Ding X, Shi R i in. CircACC1 reguluje montaż i aktywację kompleksu AMPK w warunkach stresu metabolicznego. Metabolizm komórkowy 2019; 30.

51. Ren C, Zhang Z, Wang S, Zhu W, Zheng P, Wang W. Circular RNA hsa_circ{2}} ułatwia inwazję i przerzuty raka jelita grubego poprzez regulację w górę ZEB1 poprzez gąbczaste wiele miRNA. Biol Chem. 2020; 401: 487-96.

52. Zeng K, Chen X, Xu M, Liu X, Hu X, Xu T i in. CircHIPK3 promuje wzrost i przerzuty raka jelita grubego poprzez nakładanie miR{2}} gąbką. Śmierć komórkowa Dis. 2018; 9: 417.

53. Park OH, Ha H, Lee Y, Boo SH, Kwon DH, Song HK i in. Rozszczepianie endoribonukleolityczne RNA zawierających mA przez kompleks RNazy P/MRP. Komórka Mol. 2019; 74.

Ying Wang1,2, Yunjing Zhang1,2, Xinwan Su3, Qiongzi Qiu4, Yuan Yuan2, Chunhua Weng2, Sailan Zou5, Yan Tian5, Weidong Han6, Pengyuan Liu4, Xingyi Guo7, Jianhua Mao8, Xianghui Fu5, Ping Wang3, Weiqiang Lin1

1. The Fourth Affiliated Hospital i International Institutes of Medicine, Zhejiang University School of Medicine, Jinhua 322000, Zhejiang, Chiny.

2. Centrum Chorób Nerek, pierwszy stowarzyszony szpital i Instytut Medycyny Translacyjnej, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, Chiny.

3. Klinika Urologii, Pierwszy Szpital Stowarzyszony, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, Chiny.

4. Oddział Medycyny Układu Oddechowego, Szpital Sir Run Run Shaw i Instytut Medycyny Translacyjnej, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Zhejiang, Hangzhou 310016, Zhejiang, Chiny.

5. Oddział Endokrynologii i Metabolizmu, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center of Biotherapy, Chengdu 610041, Syczuan, Chiny.

6. Oddział Onkologii Medycznej, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310016, Zhejiang, Chiny.

7. Division of Epidemiology, Department of Medicine, Vanderbilt Epidemiology Center i Vanderbilt-Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville 37203, TN, USA.

8. Oddział Nefrologii, Narodowe Centrum Badań Klinicznych ds. Zdrowia Dziecka, Szpital Dziecięcy, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, Chiny.