Wpływ Cistanche na apoptozę neuronów dopaminergicznych indukowanych przez neurotoksynę 1-metylo-4 -fenylopirydynium (MPP)
Mar 10, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Tian Jiyu, Chen Jianzong
(Centrum Badań Tradycyjnej Medycyny Chińskiej i Chińskiej Materia Medica Szpitala Xijing, FMMU, Xi'an 710032)
Abstrakcyjny
Cel: Aby zbadać skutkiCistanche na pierwotnej hodowli komórek apoptozy neuronów dopaminergicznych indukowanej przez 1-metylo-4-fenylopirydynium (MPP plus ). metoda: Do przygotowania surowicy króliczej składającej się zCistanchewykorzystuje metodę farmakologii surowicy. Następnie zbadaj wpływ Cistanche na apoptozę komórek neuronów DA zMPP plusmodele indukowane przy użyciu morfologii, cytometrii przepływowej, barwienia TUNEL.Wynik: Leczenie 200 μmol/LMPP plusprzez 24 godziny lub dłużej indukowana apoptoza w neuronach DA. PóźniejMPP plusleczonych, współczynnik apoptozy w grupie zawierającej równoważną dawkę surowicy Cistanche wynosi 6,3 procent, grupaMPP plusleczona samodzielnie wynosi 30,2 proc. Liczba komórek apoptozy w grupie B i C jest istotnie mniejsza niż w grupie E (P<0.05).>Wniosek: Zawarte serumCistanchechronione neurony DA w apoptozie indukowane przezMPP plus.
Słowa kluczowe: Cistanche;1-metylo-4-fenylopirydynium (MPP plus ); neurony dopaminergiczne; apoptoza
Obecnie główna terapia dlaChoroba Parkinsonato terapia zastępcza złożonymi preparatami lewodopy (L-dopa), która nie może kontrolować rozwoju choroby. W miarę postępu choroby dawkowanie zwiększa się i ogólnie rzecz biorąc, w ciągu 3 do 5 lat działanie lecznicze zmniejsza się, objawy motoryczne zmieniają się i pojawiają się dyskinezy polekowe. Ostatnie badania wykazały, że L-dopa ma działanie indukujące apoptozę neuronów hodowanych in vitro[1, 2], a następnie zaproponowano, że neurotoksyczne działanie endogennej dopaminy prowadzi do utraty neuronów dopaminergicznych wChoroba Parkinsona. Jeden z powodów [3]. W wieloletniej praktyce klinicznej stosowaliśmy medycynę chińską ododżywia wątrobę i nerkiw połączeniu z preparatami lewodopy w leczeniu PD i osiągnięto dobre wyniki [4-6]. Eksperyment ten badał ochronny wpływ tradycyjnej medycyny chińskiej na apoptozę neuronów dopaminergicznych i jej mechanizm na poziomie molekularnym i komórkowym.
1. Materiały i metody
1.1 Materiały
pożywka DMEM,1-metylo-4-fenylopirydyna, MPP plus, płodowa surowica bydlęca zakupiona od firmy Gibco.Cytarabina, poli-l-lizyna, PLLzostały zakupione od firmy Sigma. 24-płytka do hodowli dołków, 25cm2
Plastikowe kolby do hodowlizostały zakupione od firmy NUNC.Medycyna chińskazostaliśmy wykorzystani został zakupiony od Xi'an Decoction Piece Factory. Zwierzęta, z których korzystaliśmy, są dostarczane przez szkolne centrum zwierząt.https://www.xjcistanche.com/products
1.2 Przygotowanie i eksperymentalne grupowanie surowicy leczniczej
Cistanche jest przygotowywany w postaci liofilizowanego proszku do konserwacji i rozcieńczany wodą destylowaną, gdy jest używany. Surowicę zwierzęcą przygotowano z białego królika wielkousznego z Nowej Zelandiiserum, z których wszyscy byli zdrowymi mężczyznami o masie ciała 2,5-3.0 kg. Równoważną dawkę zwierząt przelicza się zgodnie z powierzchnią ciała i losowo dzieli na surowicę ślepej grupy kontrolnej; 1/2 równoważnika surowicy z grupy dawek (dawka przez zgłębnik surowca leczniczego Cistanche 0,8 g/kg); grupa dawki równoważnejserum(Dawka przez zgłębnik to oryginalny materiał leczniczy Cistanche cistanche 1,6 g/kg); 2 razy równoważna dawkaserum(dawka zgłębnika to oryginalny materiał leczniczy Cistanche 3,2 g/kg). Zgłębnik dwa razy dziennie przez łącznie 3 dni, 1 godzinę po ostatnim zgłębniku, upuszczanie krwi do tętnic szyjnych, przez noc w 4 stopniach, wirowanie przy 2500 obr/min przez 25 minut, staranne oddzielenie surowicy, inaktywacja w 56 stopnia przez 30 minut i odessać przez membranę filtrującą 0,22 μm Odfiltrować bakterie i przechowywać w -20 stopniu. W tych samych warunkach przez zgłębnik przygotowano ślepą króliczą surowicę kontrolną z równą objętością normalnej soli fizjologicznej. Eksperyment podzielono na 5 grup. Grupa A była pustym królikiemserumgrupa kontrolna kultury; Grupa B byłahodowla surowicy plus MPPgrupa leczona zawierająca 2 razy równoważną dawkę; Grupa C byłahodowla surowicy plus MPPgrupa leczona zawierająca równoważną dawkę; Grupa D była grupą kontrolną hodowli surowicy zawierającą 1/2 równoważnej dawki hodowli surowicy plus grupa leczona MPP; Grupa E to pusta hodowla surowicy królika plus grupa leczona MPP.
Zasiłek Cistanche
1.3 Hodowla neuronów dopaminergicznych śródmózgowia
Wyselekcjonowano trzy szczury SD w 14 dniu ciąży i zabito przez bezpośrednie wstrzyknięcie zatoru powietrznego do serca; embrionalne szczury wyjęto w warunkach aseptycznych i umieszczono na szalce Petriego wypełnionej lodowym roztworem D-Hanksa. Tkankę mózgową płodu szczura wycięto i oddzielono pod stereomikroskopem. Nieznacznie poprawiono metodę referencyjną [7]. Opony i tkankę naczyniową zostały zerwane, a tkanki w obszarach A8, A9 i A10 brzusznego śródmózgowia zostały oddzielone. Dodać 1 ml 0,125 procent pankreatyny i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 stopni na około 20 minut, dodać odpowiednią ilość pożywki zawierającej 10 procent płodowej surowicy bydlęcej, aby zakończyć trawienie i zastosować aspirację
Odpipetować probówkę do jednorodnej zawiesiny komórek, wirować z prędkością 1500 obr/min przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant, pipetować 15 razy za pomocą pipety z cienką szyjką i odstawić na 5 minut. W 24-dołkowej płytce hodowlanej z lizyną, dodaj pożywkę hodowlaną do każdego dołka, aby dostosować gęstość komórek do 2 x 105 komórek/ml, dodaj pożywkę hodowlaną do 0,5 ml na dołek i dodaj cytarabinę po 3 dniach hodowli ( końcowe stężenie wynosi 10 μmol/L), hamuje wzrost nieneuronów.
1.4 Barwienie immunocytochemiczne hydroksylazy tyrozynowej (TH)
Stosując metodę SABC rozcieńczalnik przeciwciał zawiera albuminę surowicy bydlęcej 1g/100ml (Boster Company, Wuhan), 0,3% Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ 100mL, rozcieńczony PBS do 100mL, doprowadź pH do 7,6. Hodowlę zakończono 7 dnia, przemyto 3 razy D-PBS przez 5 minut, świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd utrwalono w temperaturze pokojowej przez 30 minut i przemyto 3 razy D-PBS przez 5 minut; z roztworem nadtlenku wodoru 1:1:8, metanolem i PBS Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, płukać D-PBS przez 5 minut, dodać 5% blokującą surowicę kozią przez 30 minut w temperaturze pokojowej, płukać D-PBS przez 5 minut i dodać kozie przeciwciało przeciwko mysiemu TH rozcieńczone rozcieńczalnikiem przeciwciał (rozcieńczenie 1:1000, Calbiochem)), przez noc w 4 stopniach, płukać D-PBS przez 3 min 3 razy, dodać biotynylowaną mysią anty-szczurze IgG rozcieńczoną przeciwciałem rozcieńczalnik (rozcieńczony 1:200, Sigma USA), działać w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, płukać D-PBS przez 3 min 3 razy, Dodać kompleks HRP rozcieńczony rozcieńczalnikiem przeciwciał przez 2h w temperaturze pokojowej i płukać D-PBS przez 3 minuty 3 razy. Przepłucz rozcieńczalnik DAB przez 3 minuty, dodaj gotowy do użycia odczynnik chromogeniczny DAB (Wuhan Boster Company) do komórek i obserwuj kolor pod mikroskopem odwróconym.https://www.xjcistanche.com/
1.5 Postępowanie z narkotykami
Obserwacje morfologiczne hodowanych neuronów prowadzono codziennie pod mikroskopem z kontrastem fazowym, a zmiany rejestrowano na zdjęciach. Po hodowli przez 12 godzin komórki obserwowano pod mikroskopem odwróconym, a leki dodawano tuż przed konfluencją. Zawartość surowicy w każdej grupie wynosiła 10 procent. Po hodowli przez 3 dni dodano MPP plus do końcowego stężenia 200 μmol/L. Po inkubacji w 37-stopniowym inkubatorze z 5% CO2 przez 24 godziny, wykonaj różne inspekcje.
Cistanche
1.6 Wykrywanie metodą cytometrii przepływowej
Leczenie farmakologiczne było takie samo jak wcześniej. Po potraktowaniu każdej grupy przylegające komórki PC12 trawiono 00,125% trypsyną i pobierano około 1 x 106 PBS. Komórki przemyto dwukrotnie i dodano 490 µl buforu wiążącego, komórki dokładnie wymieszano i dodano 5 µl aneksyny V. FITC i 10 µl rozpuszczonego PI w zawiesinie komórek, delikatnie wymieszaj, ustaw probówkę na 4 stopnie, inkubuj 10 min w ciemności i wykonaj test na cytometrze przepływowym COULTER EPICS (Beckman Coulter, USA).
1.7 Znakowanie końca in situ (TUNEL) w celu wykrycia apoptozy komórek
Do znakowania końców DNA hodowanych neuronów in situ używa się zestawu do wykrywania apoptozy firmy Boster (MK1022), a kroki są następujące: Weź neurony dopaminergiczne z każdej grupy po leczeniu MPP plus (slajd przed hodowlą pierwotną jest wstępnie hodowany z traktowaniem polimerem lizyną), utrwalany za pomocą 4{{30}}g/l paraformaldehydu przez 1h, świeżym 3% kwasem octowym (pH2,5) w temperaturze pokojowej przez 10min, zneutralizować alkaliczną fosfatazę, dodać 0,1mol/L TBS (pH7,5) 1:200 świeżo rozcieńczoną proteinazą K, trawienie w 37oC przez 20s, dodać 1µl TdT i DIG-d-UTP do każdego szkiełka i 18µl roztworu buforowego przez 2h w 37oC; do każdego szkiełka dodać 50 µl roztworu blokującego w temperaturze pokojowej przez 30 min; dodać 50 µl biotynylowanego przeciwciała anty-digoksygeniny rozcieńczonego roztworem blokującym; reagować przez 30 min w mokrej skrzyni w 37 stopniach; dodać 50 μl SABC-AP rozcieńczonego 0,1 mol/l TBS do każdego szkiełka; BCIP/NBT (0,1 mola pH9,5/l TBS rozcieńczonego 1:20) dodano do próbki w celu wywołania koloru przez 30 minut; w tym samym czasie alternatywną kontrolę (zastosowano bufor TdT zamiast mieszaniny TdT/biotyna-dUTP) do fotomikrografii i mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym (200x) Obserwować komórki apoptotyczne. Zliczyć komórki dodatnie pod mikroskopem z kontrastem fazowym, zliczyć 5 pól na dołek w każdej grupie, łącznie 6 dołków.
2. Wyniki eksperymentalne
2.1 Morfologiczna obserwacja hodowanych neuronów
Obserwowane przez mikroskop z kontrastem fazowym OlympusIX70: 5 godzin po zaszczepieniu większość komórek przylega do ściany, komórki są rozproszone, korpus komórki jest okrągły, jądro jest niewidoczne, a współczynnik załamania światła jest silny. Po hodowli przez 24 godziny wypukłości komórkowe rosły i stopniowo wydłużały się. Po 48 godzinach większość komórek wystawała z rozgałęzionymi nitkowatymi wypukłościami. Morfologia komórek była zróżnicowana, dwubiegunowa, trójbiegunowa i wielobiegunowa, i stopniowo tworzyła rzadką sieć. Ciało komórki było powiększone, okrągłe i eliptyczne. Po urazie MPP plus komórki najpierw spuchły, współczynnik załamania wzrósł, komórki znajdowały się w stanie zwyrodnieniowym, a komórki w końcu skurczyły się i odpadły. Różne dawki złożonej surowicy zawierającej medycynę chińską mają działanie ochronne na MPP i urazy. Po wybarwieniu hodowli komórkami immunologicznymi TH zaobserwowano, że komórki TH-dodatnie były brązowe z odrostem neurytów. Po dodaniu równoważnej dawki surowicy tradycyjnej medycyny chińskiej, proporcja TH-dodatniegoneuronymoże osiągnąć 55 procent -60 procent .
2.2 Analiza wyników badań cytometrii przepływowej (patrz Rysunek 1)
Fosfatydyloseryna (PS) znajdująca się wewnątrz błony komórkowej we wczesnym stadium apoptozy migruje na zewnątrz błony komórkowej. Białko wiążące fosfatydyle V (aneksyna V) to zależne od wapnia białko wiążące fosfolipidy, które ma wysokie powinowactwo do PS. Dlatego aneksynę V można stosować jako sondę do wykrywania PS eksponowanego na powierzchni błony komórkowej. W tym samym czasie w połączeniu z metodą wykluczania PI dla doublebarwiącykomórek apoptotycznych, komórki apoptotyczne można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej. W prawym dolnym kwadrancie Ryc. 1 (FITC plus /PI-) wyświetlane są szczegóły apoptozy każdej grupy. Odsetek komórek, wskaźnik apoptozy w każdej grupie wynosił 4,1 procent, 5,8 procent, 6,3 procent, 28,6 procent, 30,2 procent.
2.3 Analiza wyników barwienia TUNEL
Te z niebiesko-fioletowymi cząsteczkami w jądrze są komórkami dodatnimi, to znaczy komórkami apoptotycznymi. Proporcję komórek apoptotycznych w każdej grupie zliczono pod mikroskopem świetlnym. Liczba komórek apoptotycznych na pole widzenia w każdej grupie wynosiła: Grupa A 2,13±0,34; Grupa B 4,92±0,67; Grupa C 6,20±1,47; Grupa D 10,33±1,51; Grupa E 12,74±2,51. Późniejanaliza testu t,grupy B i C porównano z grupą E (P<0.05). the="">wynikisą zasadniczo zgodne zwyniki cytometrii przepływowej.
3. Dyskusja
Choroba Parkinsonanależy do kategorii „zespołu drżenia” w medycynie chińskiej. Tradycyjna medycyna chińska uważa, że początek choroby Parkinsona to głównie szereg objawów stopniowego wyczerpywania się wątroby i nerek u osób starszych oraz utraty odżywienia meridianu szpiku mózgowego. Głównym leczeniem jest:odżywiają wątrobę i nerki, uspokoić wątrobę i wyeliminować wiatr. Tradycyjna medycyna chińska może odgrywać rolę „zmniejszenie toksyczności i zwiększenie skuteczności" w leczeniuChoroba Parkinsona, ale jego mechanizm działania nie jest obecnie bardzo jasny. Duża liczba dowodów eksperymentalnych we współczesnej medycynie wskazuje, że stres oksydacyjny jest jednym z czynników powodujących śmierć komórek nerwowych PD [3]. Badania wykazały, że całkowite glikozydy cistanche mogą skutecznie usuwać różne reaktywne wolne rodniki tlenowe i chronić DNA przed utlenianiem powodowanym przez OH[8]. Wyciąg z Cistanche tubulozyd B może osłabiać cytotoksyczność wywołaną przezMPP plus ,osłabiają akumulację reaktywnych form tlenu w komórce i mają antagonistyczny wpływ na apoptozę i stres oksydacyjny wywołany przezMPP plus[9]. Tradycyjna medycyna chińska może aktywować i wzmacniać własną ścieżkę sygnału ochronnego, przeciwdziałać uszkodzeniom zewnętrznym i przywracać równowagę. To jeden z celów modernizacji tradycyjnej medycyny chińskiej. Po dopaminowej terapii zastępczej ludzie na ogół cenią sobie terapię neuroprotekcyjną, która nazywana jest drugą rewolucją w leczeniuChoroba Parkinsona. W tym eksperymencie wyizolowane dopaminergiczne komórki nerwowe śródmózgowia były hodowane z chińską medycyną zawierającą surowicę i stwierdzono, że Cistanche ma pewne działanie neuroprotekcyjne. W tym eksperymencie zastosowano dwie metody wykrywania cytometrii przepływowej i barwienia TUNEL w celu jednoczesnego stwierdzenia, że równoważna grupa dawki surowicy i 2-krotność równoważnej grupy dawki surowicy posiewu surowicy leczniczej Cistanche mogą zmniejszyć pierwotny wyhodowany nerw dopaminowy śródmózgowia spowodowany przezMPP plusLiczba komórek apoptotycznych ma pewien wpływ ochronny na komórki apoptotyczne. Tradycyjna medycyna chińska może chronić neurony dopaminergiczne przed uszkodzeniem we wczesnym stadium, co jest ważniejszym środkiem niż inne terapie. W tym sensie holistyczne leczenie medycyny chińskiej jest lekarstwem na pierwotną przyczynę i może być uważane za jedną z obecnie cenionych przez ludzi terapii neuroprotekcyjnych.
Bibliografia
1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Lewodopa indukuje apoptozę w hodowanych komórkach nerwowych – możliwy akcelerator zwyrodnienia nigrostriatalnego w chorobie Parkinsona? Mov Disord, 1997, 12(1):17
2. Jenner PG, Brin MF. Neurotoksyczność lewodopy: badania eksperymentalne a znaczenie kliniczne.Neurology,1998,50(6 Suppl 6): S39
3. Maruyama W, Naoi M. Śmierć komórek w chorobie Parkinsona. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): II6
4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian i in. Obserwacja kliniczna leczenia choroby Parkinsona z czynnością wątroby i nerek: doniesienie o 60 przypadkach. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22(3): 14
5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang itd. Obserwacja kliniczna 40 przypadków choroby Parkinsona leczonych metodą odżywiania wątroby i nerek. Badania w medycynie chińskiej, 1998, 14(3): 10
6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron i in. Pingchan No. 1 płyn doustny w leczeniu 40 przypadków choroby Parkinsona. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9
7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Wysoka procentowa wydajność komórek dodatnich pod względem hydroksylazy tyrozynowej z hodowli komórek śródmózgowia szczura E14. Mózg Res,1992,586 (2):319
8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming i in. Wymiatanie wolnych rodników in vitro i ochronny wpływ na uszkodzenia DNA indukowane przez OH wywołane przez całkowite glikozydy cistanche. Chiński Dziennik Farmaceutyczny, 2001, 36(1): 29
9. Sheng G, Pu X, Lei L i in. Tubulozyd B z Cistanche salsa Ratuje komórki neuronalne PC12 przed apoptozą indukowaną jonami 1-metylo-4-fenylopirydyniowymi i utlenianiem. Stress.Planta Med,2002,68(11):966