Jak badać genetyczne zróżnicowanie Herba Cistanches?

Badanie różnorodności genetycznej Herba Cistanches przez RAPD

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Instytut Chińskiej Materii Medica, Chińska Akademia Medycyny Chińskiej, Pekin 100700)

Abstrakcyjny

Zamiar:Aby zbadać populacjęróżnorodność genetycznazCistanche deserticolaorazCistanche tubulosa.

Metody:Dwie dzikie populacjeCistanche deserticolai cztery dzikie populacjeCistanche tubulosazostały przeanalizowane przez RAPD, aróżnorodność genetycznapopulacji analizowano za pomocą oprogramowania POPGENE w wersji 1.31.

Wyniki:Średni procent polimorficznych lociCistanche deserticolawynosiła 47,37 procent, loci polimorficzne obu populacji wynosiły 39,47 procent i 35,53 procent, a średnia różnorodność genów Nei wynosiła 0.135 8. U Shannona było więcej. Indeks informacji o statusie to 0.207 2, a współczynnik różnicowania genów Gst {{1{{20}}}.254 6. Średni odsetek loci polimorficznych w Cistanche wynosił 27,59 proc., a odsetek loci polimorficznych w każdej populacji wahał się od 19,54 proc. do 25,29 proc., z czego populacja Andier miała najwyższe 25,29 proc., a średnia różnorodność genów Nei wynosiła 0. { {21}}, wskaźnik informacji polimorfizmu Shannona wynosi 0,1258, współczynnik różnicowania genów Gst =0.175 5.

Wniosek:Cistanche deserticolaorazCistanche tubulosamają pewne zróżnicowanie między populacjami. Theróżnorodność genetycznaDesert Cistanche jest znacznie wyższa niż Cistanche tubulosa i jest zróżnicowana na dwa ekotypy.

Słowa kluczowe: Cistanche deserticola; Tubulosa Cistanche; RAPD; różnorodność genetyczna

[Numer klasyfikacyjny biblioteki chińskiej] S 567 [Kod identyfikacyjny dokumentu] A [Numer artykułu] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche to pasożytnicza roślina należąca do rodzaju Cistanche z rodziny Lidanaceae, znana również jako Dayun, która jest cennym chińskim materiałem leczniczym. Głównymi roślinami źródłowymi Cistanche deserticola w moim kraju sąCistanche deserticolaYCMa i C.tubulosa (Schenk) R.Wight [1]. Rośliny żywicielskie Cistanche deserticola to Haloxylon ammodendron i Haloxylon ammodendron, które występują głównie w Lidze Alashan w Mongolii Wewnętrznej, północnym Xinjiangu, Qinghai, Gansu i innych miejscach. Rozmieszczenie Cistanche deserticola jest takie samo jak u roślin żywicielskich. W moim kraju Cistanche cistanche jest rozprowadzany tylko w hrabstwach wokół pustyni Taklimakan na południe od gór Tianshan w Xinjiang, a jego dystrybucja nie jest całkowicie zsynchronizowana z gospodarzem Tamarixem. Inne regiony, takie jak północny Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Mongolia Wewnętrzna, Shaanxi i inne miejsca występowania roślin Tamarix nie są pasożytniczymi Tubulami Cistanche [2]. Ze względu na szybki wzrost popytu na Cistanche w ostatnich latach, co spowodowało wymieranie jego zasobów, zasoby dzikiego Cistanche skurczyły się tylko do kilku głównych obszarów produkcyjnych. Oba zostały wpisane na listę zagrożonych gatunków roślin chronionych w moim kraju [3], wśród których znajdują się:Cistanche deserticolazostał uwzględniony w załączniku II CITES [4].

Po kilku latach badań badania nad sztuczną hodowlą Cistanche zakończyły się sukcesem i są na etapie szeroko zakrojonej promocji i nasadzeń. Jednak to, jak zapobiec upadkowi gatunków Cistanche podczas produkcji przemysłowej, jak najszybciej przywrócić ograniczoną dziką populację i zachować cenne zasoby dzikiej plazmy zarodkowej, to klucze do osiągnięcia zrównoważonego wykorzystania. W odniesieniu do chronionego dziedzictwa Cistanche [Data otrzymania], 2004-03-11 [Projekt Funduszu] Ministerstwo Nauki i Technologii Projekt Opieki Społecznej (2001.109); Ministerstwo Nauki i Technologii Projekt „Dziesiąty plan pięcioletni” (2001BA701A09a) [Autor do korespondencji] * Huang Luqi, Tel:(010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Badania nad transmisją wciąż trwają pusty. W tym badaniu wykorzystano technologię RAPD do zbadania 2 dzikich populacjiCistanche deserticolaoraz 4 dzikie populacjeCistanche tubulosai przeanalizuj obie Różnice wróżnorodność genetycznaOczekuje się, że dostarczy ważnej eksperymentalnej podstawy genetycznej dla ochrony Cistanche, drogocennego chińskiego leku.

cistanche

1. Materiał i metody

1.1 Materiały

Cistanche deserticolazostał zebrany z hrabstwa Jimsar w Xinjiang i obszaru Jilantai starożytnej Ligi Alxa w Mongolii Wewnętrznej. Populacje Cistanche zostały zebrane z okręgów Minfeng i Yutian w prowincji Xinjiang. Okręg Minfeng jest obecnie obszarem o największym plonowaniu Cistanche cistanche, o największym zagęszczeniu i stosunkowo kompletnych zbiorowiskach lasów naturalnych. Punkty pobierania próbek Andil, Sawuzek, Yatongguz i Daheyan w okręgu Yutian to główne obszary produkcyjne, które znajdują się w rzece Andir, Yeyike, Yatongguzi i Kelaniya W dolnym biegu rzeki odległość między populacjami wynosi ponad 50 km. W każdej populacji losowo pobrano 19-30 osoby. Próbki szybko osuszono w żelu krzemionkowym i wykorzystano do ekstrakcji DNA (tabela 1).

Tabela 1 Populacje pobierające próbki i obszary produkcji Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa

1.2 Ekstrakcja DNA

Metoda ekstrakcji całkowitego DNA wykorzystuje metodę o wysokim stężeniu soli i niskim pH [5]. Próbkę DNA poddano spektrofotometrowi w celu wykrycia stężenia matrycy DNA, następnie elektroforezę w 1% żelu agarozowym, barwienie EB, obserwację i fotografię w świetle ultrafioletowym, elektroforezę DNA z czystymi prążkami i mniejszą ilość ogonków zastosowano do analizy RAPD.

1.3 Badanie przesiewowe starterów RAPD

Ponieważ eksperyment wykazał, że ten sam starter ma niezadowalający wpływ na jednoczesną amplifikację obuCistanche deserticolai Cistanche tubulosa, startery przeszukiwano niezależnie. Do amplifikacji i badań przesiewowych użyto 150 losowych starterów (10 pz), 25 µl systemu reakcyjnego firmy Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.; każdy starter wykorzystywał 2 matryce populacyjne i 1 sterylizowaną wodę podwójnie destylowaną jako ślepą kontrolę i uzyskał 10 starterów do amplifikacji Cistanche deserticola z wyraźnymi prążkami, silnym polimorfizmem i dobrą powtarzalnością: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 podkładów zCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 Amplifikacja PCR i detekcja produktu

Wybrane startery zastosowano do amplifikacji matrycowego DNACistanche deserticolaorazCistanche tubulosametodą PCR. Genomowy DNA rozcieńczono do 50 ng·μl -1 zgodnie ze zmierzonym stężeniem jako matrycą. Całkowita objętość reakcji wynosi 25 μl, z czego 10 × bufor PCR 2,5 μl, Mg2 plus 1,5 μl, Taq (5 U·μl -1) 0,2 μl, mieszanina dNTP (każda 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, matryca DNA 1 μL, sterylizowana woda podwójnie destylowana 18,8 μL, powyższy roztwór do amplifikacji PCR jest produktem firmy Shanghai Sangon. Amplifikację przeprowadzono na termocyklerze PTC-100. Program amplifikacji obejmował predenaturację 94 stopni przez 5 minut, a następnie 40 cykli. Każdy cykl obejmował 94 stopnie 45 s, 34 stopnie 1 min, 72 stopnie 1 min 30 s, a na koniec Wydłużenie w 72 stopniach przez 5 min. Amplifikowane produkty poddano elektroforezie na 2,0 procentowym żelu agarozowym (zawierającym EB) w buforze 1xTAE i obserwowano i fotografowano w systemie obrazowania żelu SYNGENE.

1.5 Statystyka i analiza danych

W widmie elektroforezy porównuje się odpowiednią pozycję produktu reakcji na żelu zgodnie ze standardem masy cząsteczkowej i szacuje się masę cząsteczkową amplifikowanego produktu. Prążek z prążkiem jest zapisywany jako 1, a prążek bez prążka jest zapisywany jako 0, tworząc wykres macierzowy 0/1 i wprowadzany do komputera, używając POPGENE32 do obliczenia procentu miejsc polimorficznych (PPL) każdej populacji, wskaźnik zróżnicowania genów Nei (H), wskaźnik informacji polimorfizmu Shannona (I), współczynnik zróżnicowania genów (Gst), zróżnicowanie genów (Ht),Różnorodność genetyczna(Hs), tożsamość genetyczną Nei (1978) (I) i dystans genetyczny (D) w obrębie populacji, a analizę skupień przeprowadzono metodą UPGMA.

2. Wyniki i analiza

2.1 Genetyczna różnorodność Cistanche

Wszystkie próbki uzyskały prążki o masie cząsteczkowej w zakresie od 200 do 2 200 pz (Rysunek 1, 2). Łącznie wykryto 76 loci w 60 próbkach z 2 populacjiCistanche deserticola, z czego 36 to loci polimorficzne, stanowiące 47,37 procent , H=0.135 8, I=0.207 2. Wśród nich PPL Jimsara wynosi 39,47 proc., a Gilanty 35,53 proc. H to 0. 0 95 3 i 0.1 070 odpowiednio, a ja to odpowiednio 0.15 12 i 0.163 7. W sumie wykryto 87 loci u {{20} osobników z 4 populacji Cistanche, z których 24 były loci polimorficzne, co stanowiło 27,59 procent, H=0.084 8,=0.1278. Najwyższy PPL był Andil (25,29 proc.), natomiast niższy PPL był w Savuzek i Yatungusi (oba po 19,54 proc.). H to 0.062 1 -0.080 0, I to 0.095 0 -0.116. Wielkość H i I jest zgodna z trendem wielkości PPL każdej populacji, a współczynniki są największe w Andier, po którym następuje Dayan. W przypadku tego samego PPL, H Savuzka=0.{{40}} Suma I=0.097 0 jest nieco wyższa niż 0.{{44 }} i 0.095 0 Yatunguski (tabela 2).

Rysunek 1 Wzmocnione pasma RAPD niektórych próbek pustyniCistanche deserticola, elementarz S490 1-10. Próbki gwarancji; 11-20. Próbki Jimpstera Marker M-DNA (200 - 2 000 pz)

Figura 2 Prążki amplifikowane przez RAPD niektórych próbek Cistanche Tubulosa, starter S2 042 1-20. Próbka Xinjiang Andier Marker M-DNA (200 - 2 000 pz)

Tabela 2różnorodność genetycznazCistanche deserticolaorazCistanche tubulosapopulacje

2.2 Analiza zmienności genetycznej Cistanche

Zgodnie z poziomemróżnorodność genetycznaw populacjach (Hs), zróżnicowaniu między populacjami (Dst) i proporcji różnic genetycznych między populacjami w całkowitych różnicach genetycznych (Gst), można zauważyć, że całkowita różnorodność genetyczna Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, gdzie Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, w tym Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabela 3). Powyższe wyniki wskazują na pewien stopień zróżnicowania genetycznego populacji. Zmienność między pustynnymi populacjami Cistanche deserticola stanowiła 25,46% całkowitej zmienności, a zmienność populacji Cistanche tubulosa stanowiła 17,55% całkowitej zmienności.

Tabela 3 Analiza zmienności genetycznejCistanche deserticolaorazTubulosa Cistanche.

2.3 Odległość genetyczna i analiza skupień wśród populacji Cistanche deserticola

Dystans genetyczny dwóch populacjiCistanche deserticolato {{0}}.080 0, a tożsamość genetyczna to 0.9231. Dystans genetyczny czterech populacji Cistanche wynosił 0.012 0-0.031 5, a tożsamość genetyczna wynosiła 0.9690-0.988 1 (Tabela 4) . Grupowanie osobników Cistanche deserticola i cistanche tubulosa pokazuje, że Cistanche deserticola można podzielić na dwie odrębne grupy w zależności od populacji, podczas gdy różnych osobników Cistanche tubulosa nie można podzielić na grupy, co wskazuje również, że zróżnicowanie genetyczne wśród Cistanche deserticola populacji jest stosunkowo wysoka. Duże, ale zróżnicowanie genetyczne między populacjami Cistanche tubulosa jest niewielkie.

Tabela 4 Tożsamość genetyczna (na dole po lewej) i dystans genetyczny (na górze po prawej)Cistanche tubulosa.

3. Dyskusja

3.1 Genetyczna różnorodność Cistanche

Poziom czegośróżnorodność genetycznaroślin jest nierozerwalnie związana z ich cechami biologicznymi, siedliskami, pochodzeniem i ewolucją. Wśród nich największy wpływ ma system hodowli, zasięg występowania, forma życia oraz metody rozprzestrzeniania pyłku i nasion [6]. Zgodnie z wynikami statystycznymi danych allozymowych 499 gatunków roślin w 165 rodzajach Ge Song i in. [7] polimorfizm Cistanche na poziomie gatunku powinien wynosić około 50 procent, a polimorfizm na poziomie populacji powinien wynosić około 40 procent. Około 0,17. Wszystkie poziomy polimorfizmu uzyskane w tym eksperymencie są niższe niż te średnie wartości. Jednocześnie w porównaniu z poziomami loci polimorficznych uzyskanymi metodami RAPD dla kilku powszechnie zagrożonych roślin, takich jak 32 procent zagrożonych gatunków jodły srebrnej[18], 22,5% piwonii karłowatej i 27,6 procent piwonii purpurowej [9] ] Można zauważyć, że różnorodność genetycznaCistanche deserticola jest nieco niższy od średniego, a różnorodność genetyczna Cistanche tubulosa jest już bardzo niska.

3.2 Przyczyny niskiej różnorodności genetycznej Cistanche

Cistanche to specyficzna roślina pasożytnicza, występująca jednocześnie na wąskich obszarach pustynnych. Dlatego wyjątkowy styl życia i stosunkowo wąska powierzchnia mieszkalna mogą być nieodłącznym powodem, dla któregoróżnorodność genetycznaCistanche jest na ogół niższy niż zwykłych roślin.

Różnica wróżnorodność genetycznamiędzy Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa może być związana z różnicą w zakresie występowania tych dwóch gatunków i tym, czy są one zsynchronizowane z dystrybucją gospodarza. Obszar występowania Cistanche tubulosa jest znacznie mniejszy niż Cistanche deserticola, a jego dystrybucja jest skrajnie niezsynchronizowana z rośliną żywicielską. Badania wykazały, że wśród gatunków Tamarix występuje bogactwo różnorodności. Na przykład Zhang Juan i in. donosi, że różnorodność genetyczna Tamarix sibiricus wynosiła aż 98,7 procent [10], podczas gdy różnorodność genetyczna Cistanche jest wyjątkowo słaba, co wskazuje na długoterminową ewolucję. W historii Cistanche tubulosa mogły wystąpić poważne wąskie gardła, które skutkowały utratą dużej ilościróżnorodność genetyczna.

Jednocześnie, zgodnie z śledztwami, stwierdzono, że żaden zCistanche deserticolaw promieniu 20 km od osiedli ludzkich można było odkopać i normalnie kwitnąć. Wykopano duże i małe doły Cistanche, zwłaszcza w głównych obszarach produkcji kwiatu rurowego Cistanche. W związku z tym było to spowodowane dużą ilością wykopów. Brak proweniencji i zniszczenie siedliska mogą być głównymi przyczynami niskiego stanu, spowodowanymi przez człowiekaróżnorodność genetycznaCistanche.

3.3 Genetyczne zróżnicowanie Cistanche

Ze względu na odległość geograficzną między Sinciangiem a Mongolią Wewnętrzną izolacja geograficzna spowodowała zróżnicowanie i izolację międzyCistanche deserticolapopulacje, a obie populacje utworzyły różne genetycznie różne ekotypy ze względu na ich adaptację do lokalnych warunków siedliskowych. Ze względu na wąski zasięg występowania i częstą wymianę genów między populacjami, zróżnicowanie genetyczne między populacjami jest mniejsze niż w przypadku Cistanche deserticola.

3.4 Zalecenia dotyczące ochrony Cistanche

Różnorodność genetycznajest warunkiem długofalowego przetrwania gatunków, aby uniknąć wyginięcia. Redukcjaróżnorodność genetycznazmniejszy zdolność populacji do adaptacji do zmian środowiskowych zarówno w perspektywie krótko-, jak i długoterminowej [11]. Dlatego ochrona różnorodności genetycznej Cistanche jest bardzo ważna dla ochrony tej rzadkiej i cennej medycyny chińskiej. Ponieważ Cistanche jest gatunkiem o szczególnym typie ekologicznym, należy go chronić głównie in situ, a bazę ochrony przyrodniczej Cistanche należy tworzyć zgodnie z jego różnorodnością genetyczną. Na przykład dlaCistanche tubulosa, ponieważ różnorodność genetyczna pochodzi głównie z populacji, populacje o dużym zróżnicowaniu genetycznym będą priorytetowymi obiektami ochrony [12], takie jak Minfeng's Angier i Yutian's Daheyan mogą być wymienione jako naturalna baza ochrony dla Cistanche. Jeśli chodzi oCistanche deserticola, populacje Mongolii Wewnętrznej i Sinciang uległy znaczącym zmianom, dlatego badania eksperymentalne powinny być dalej wzmacniane w celu określenia populacji, które są priorytetowe dla ochrony. Jednocześnie prowadzić podstawowe badania z zakresu biologii rozrodu i ekologii zapylania Cistanche w celu dostarczenia informacji do jego dalszej ochrony.

Bibliografia

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. IdentyfikacjaCistancheoraz badanie komercyjnych materiałów medycznych. Chińskie materiały lecznicze, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mintinga. Kompleksowe badania i ogólne zastosowanie roślin Tamarix. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.

[3] Fu Guoli. Czerwona Księga Roślin Chińskich. Pekin: Science Press, 1992.

[4] Biuro Zarządu ds. Importu i Eksportu Gatunków Zagrożonych Wyginięciem Chińskiej Republiki Ludowej, Komitet Naukowy ds. Gatunków Zagrożonych Wyginięciem Chińskiej Republiki Ludowej. Konwencja o międzynarodowym handlu dzikimi zwierzętami i roślinami gatunków zagrożonych wyginięciem (CITES), załącznik II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding i in. Ekstrakcja i identyfikacja całkowitego DNA kilku zagrożonych roślin i ich krewnych. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. System hodowli roślin, struktura genetyczna i ochronaróżnorodność genetyczna. Bioróżnorodność, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Biologia ewolucyjna roślin. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming i in. Analiza RAPD różnorodności genetycznej jodły pospolitej. Chińska nauka (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen i in. Wstępny raport na temat analizy RAPD piwonii karłowatej i purpurowej. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Wstępne badanie naRóżnorodność genetycznanaturalnych populacji lancetowatych Tamarix. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam DR. Konsekwencje genetyki populacji małej wielkości populacji: Implikacje dla ochrony roślin. Annual Review Ecology and Systematics, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Zasada genetyki populacyjnej i jej zastosowanie w ochronie roślin rzadkich i zagrożonych. Bioróżnorodność, 1999, 7(4): 340.

Od: China Journal of Chinese Materia Medica; Tom. 29, wydanie 8 sierpnia 2004 r.