Cistanche Deserticola poprawia uszkodzenie komórek nerwowych hipokampu u szczurów choroby Parkinsona poprzez regulację szlaku przeciwutleniającego KEAP1/nrf2/ho -1

Abstrakcyjny:

 

Cel zbadania efektuCistanche Deserticola o uszkodzeniu komórek nerwowych w chorobie Parkinsona (PD)szczury i jego powiązany mechanizm. Metody szczury Sprague-Dawley (SD) losowo podzielono na trzy grupy (1 0 w każdej grupie): grupa kontrolna, grupa modelowa i grupa cistanche. Szczury w grupie modeli i grupie leczonej wstrzyknięto wewnątrzczaszkowo za pomocą 6- hydroksydopaminy (6- OHDA). Szczury w grupie cistanche podawano 0,216 g/ ml roztworu cistanche, szczurom w grupie ślepej i grupie modelowej podawano normalne nawadnianie soli fizjologicznej, ilość nawadniania wynosiła 1 ml/ (100 g · d) przez dwa tygodnie. Morfologia i ultrastruktura komórek nerwowych w Hippocampusowi zaobserwowano za pomocą stałego hematoksyloino-eozyny i nadmiernej pomocy elektronowej. Morfologię ciał Nishi w regionie Hemimani zaobserwowano przez barwienie Nishi. Poziomy malondialdehydu (MDA) i dysmutazy nadtlenkowej (SOD) wykryto metodą kwasu tiobarbiturowego i metody tetrazolium nitroblue. Zmiany białka 1 ech-kelcha 1 (KEAP 1), czynnika nuklearnego E 2- czynnika 2 (NRF 2) i hemowych cyklooksygenazy 1 (HO -1}) analizowano za pomocą Western blot. Wyniki Po leczeniu leku po pustynnie Cistanche ulepszono strukturę tkanki hipokampa szczurów PD, poprawiono morfologię neuronów, piretoza jądrową została zwolniona, zawartość ekspresji enzymu enzymu przeciwutleniającego była stopniowo zwiększona. Ekspresja białka NRF 2 i HO -1 wzrosła. Wnioski Cistanche Deserticola może poprawić uszkodzenie neuronów hipokampa i zmniejszyć poziom odpowiedzi na stres oksydacyjny u hipokampa szczurów PD. .Wpływ Cistanche DeserticolawLeczenie PDSzczury są ściśle powiązane z regulacją KEAP -1 /nrf 2 /ho -1 ścieżka sygnałowa.

 

 

 

Wysokiej jakości cistanche do leczenia PD

 

Słowa kluczowe: Cistanche Deserticola;Choroba Parkinsona; Stres oksydacyjny; hipokamp; neurony; Keap1; NRF2; Ho -1

 

Według statystyk z globalnego badania danych chorób choroby neurologiczne stały się główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie. W tej dziedzinie choroba Parkinsona (PD) stała się jedną z najszybciej rozwijających się chorób ze znacznym wzrostem rozpowszechniania wieku, rosnącymi przypadkami niepełnosprawności i rosnącym wskaźnikiem śmiertelności. jeden.
W latach 1990–2020 liczba pacjentów z PD na całym świecie wzrosła o 118%, osiągając 6,2 miliona, a występowanie wciąż rośnie z roku na rok [1-2]. Pacjenci z PD zwykle występują objawy ruchowe, takie jak drżenie, sztywność mięśni, bradykinezja i trudność równowagi na późnym etapie. Jednak objawy inne niż motory, takie jak spadek poznawczy, mogą wystąpić we wczesnym stadium choroby. W miarę postępu choroby upośledzenie poznawcze stopniowo się pogarsza i stanie się poważniejsze.

Wysokiej jakości cistanche do leczenia PD

Wpływać na jakość życia pacjentów [3]. Hipokamp jest ważną organizacją w mózgu dla uczenia się przestrzennego i otrzymywania informacji zewnętrznych. Jest to główna struktura realizacji ludzkich funkcji poznawczych. Dysfunkcja hipokampa jest ściśle związana z początkiem dysfunkcji poznawczej u pacjentów z PD. Stres oksydacyjny bierze udział w rozwoju komórek nerwowych w tkance hipokampa. Obrażenia [4-5]. Dlatego jeśli neurony hipokampa są chronione u pacjentów z PD, może to poprawić poznanie pacjenta i opóźnić postęp choroby.
W ostatnich latach udowodniono, że różnorodne chińskie leki ziołowe są skuteczne w leczeniu chorób neurologicznych [6]. Cistanche Deserticola to tradycyjna medycyna chińska, która może odżywić nerek Yang i uzupełniać esencję i krew. Zastosowano go w leczeniu chorób neurologicznych, takich jak udar niedokrwienny i zapalenie neuromyeliczne [7]. Poprzednie badania przeprowadzone przez grupę badawcze wykazały, że Cistanche Deserticola może poprawić zachowanie szczurów modelowych PD i zmniejszyć apoptozę komórek nerwowych dopaminy w strefie istoty czarnej środkowej [{3}}]. Nie jest jednak jasne, czy Cistanche Deserticola może poprawić uszkodzenie tkanki hipokampa u szczurów modelowych. Dlatego badanie to ustanowiło model szczurów PD w celu obserwowania wpływu Cistanche Deserticola na uszkodzenie tkanki hipokampa i zbadać jej mechanizm, aby zapewnić nowe pomysły na leczenie PD. Tian Biological Company); Nissl Garding Reagent (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isoflurane (Shanghai Yaji Biological Company).

 

1 Materiały i metody

1.1 Materiały

1.1.1 Zwierzęta eksperymentalne

30 6- Zastosowano tygodniowe szczury SD Waże 210-230 g. Eksperymentalne centrum zwierząt z Fujian University of Tradycyjna medycyna chińska zapewniła zwierzęta eksperymentalne i ogólne medyczne środowisko dla zwierząt. Eksperyment został zatwierdzony przez komisję etyki zwierząt tej instytucji, a numer rejestracji etyki to 1N2023019.

1.1.2 Odczynniki eksperymentalne
Granulki Cistanche Deserticola (Fujian Trzeciego Szpitala); 6- hydroksydopamina (6- OHDA) Odczynnik (Beijing BioLabor Technology Co., Ltd.); Odczynnik barwienia hematoksylinowy-eozyna (HE) (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Lizat białka tkanek zwierzęcych (Beijing Solebao Biological Company); Inhibitory fosfatazy białkowej (Wuhan Pujian Biological Company); Inhibitory proteazy (Hunan Yunbang Biotechnology Company); Białko związane z ECH podobne do Kelcha -1 (KEAP1) przeciwciało monoklonalne (Wuhan Saniing Biotechnology Company); Gliceraldehyd 3- dehydrogenaza fosforanowa (gapdh) przeciwciało monoklonalne (biologiczne biologiczne Wuhan Huamei); Czynnik jądrowy E2 powiązany z czynnikiem 2 (NRF2), heme tlengaza 1 (HemoxYgenas -1, ho -1) przeciwciało monoklonalne (Wuhan pjian biotechnology Co., Ltd.); Zestawy detekcyjne od dysmutazy nadtlenkowej (SOD) i malondialdehyd (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Nissl Garding Reagent (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Instrumenty

JEA3001 Bilans elektroniczny (Shanghai Puchun Momiar Instrument Co., Ltd.); Bilans elektroniczny BSA224S (Sartorius, Niemcy); Shaker o niskiej temperaturze Stab S2T (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 W pełni automatyczny Parafin Slicer (Leica, Niemcy); PECTRAMAX I3X Multifunkcyjny czytnik mikropłytek (Molecular Devices, USA); BX63
Mikroskop fluorescencyjny (Olympus, Japonia); DLAB Handheld Centrifuge D1008/D1008E (Beijing Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); Cryocube F740HI Ultra-niską temperaturę lodówkę (EPEND, Niemcy); Minipro epbasic podstawowy elektroforeza zasilacza instrumentu (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); Suszone temperatury piekarnik (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max Ductless Fume Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Metody

1.2.1 Modelowe zakładanie i grupowanie zwierząt

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0, które uznano za udane modelowanie. Następnie szczury w grupie Cistanche Deserticola wpadano codziennie 0,216 g/ml Cistanche Deserticola, a grupa i grupa modelowa i grupa modelowa i grupa modelowa zaczepiono normalną solą fizjologiczną. Objętość zniesienia trzech grup szczurów wynosiła 1 ml/(100 g · d) przez dwa tygodnie [9]. Po zakończeniu leczenia każdej grupy szczurów szczury poddano eutanazji przez 2% znieczulenie inhalacji izofluranu i zebrano tkanki mózgowe do kolejnych badań eksperymentalnych.

 

1.2.2 Obserwacja zmian patologicznych w tkance hipokampa przez barwienie hematoksyliną-eozyną

 

Tkanki hipokampa szczurów w każdej grupie zebrano, umieszczono w roztworze formaldehydu, odwodniono gradientem etanolu, upieczonym w suszonym piecu, rozpuszczonym woskiem, suszonym, zysteczkowanym, wybarwionym przez przezroczystym ksylenem, zapieczętowanym gumą neutralną i obserwowaną pod mikroskopem.

 

1.2.3 Obserwacja transmisyjnej mikroskopii elektronowej ultrastruktury komórek nerwowych hipokampa

Tkankę hipokampa umieszczono w 3% utrwalaniu glutaraldehydu, odwodniono gradientowym etanolem, osadzonym (żywicą epoksydową) i przygotowano skrawki ultracienowe. Barwienie octanem ołowiu i octanu uranylu zastosowano do obserwacji ultrastrukturalnych zmian komórek nerwowych hipokampa (pod transmisyjną mikroskopią elektronową).

 

1.2.4 Barwienie NISSL w celu obserwowania zmian ciał NISSL w tkance hipokampa

Wyżej wymienione skrawki parafinowe tkanki hipokampa nawilżono odpowiednio w bezwodnym etanolu, odpowiednio 95% i 70% gradientu. Po przemyciu wody destylowanej 3 razy barwienie roztworem barwienia NISSL przez 5 minut, a następnie przemyć odwodniony alkohol gradientu i wodą destylowaną i wyczyść ksylen. Skrawki uszczelniono neutralnym klejem i obserwowano i zarejestrowano pod mikroskopem optycznym po zestalaniu.

 

1.2.5 Chemiczna metoda kolorymetryczna w celu wykrywania zawartości MDA i SOD w tkance hipokampa

Po homogenizacji tkanek hipokampa różnych grup eksperymentalnych, odwirowano one na 1000 g przez 20 minut i zebrano supernatant każdej grupy eksperymentalnej. Zgodnie z instrukcjami zestawu, zestawy do testu MDA i SOD zastosowano do wykrycia zawartości MDA i SOD w każdej grupie próbek eksperymentalnych.

 

1.2.6 Immunoblot białkowy w celu wykrycia specyficznej ekspresji białek KEAP1, NRF 2 i HO -1 w tkance hipokampa

Tkanki hipokampa każdej grupy dodano z buforem lizy i wirowano przy 12, 000 r · min -1 przez 15 minut. Supernatant został zebrany do użytku w trybie gotowości. Stężenie białka określono metodą BCA. Zgodnie z wynikami kwantyfikacji białka dodano odpowiednią objętość całkowitego białka i obciążono elektroforezą żelową białkową. Próbki denaturowano w 95 stopnie przez 10 minut, przeniesiono do błony, wycięte i zablokowano roztworem blokujące przez 1 godzinę. Dodano rozcieńczone podstawowe przeciwciała Keap1, Nrf 2, Ho -1 i GAPDH (1: 500), zareagowano przez noc w 4 stopnie, przemyto 1 × TBST, inkubowano z wtórnymi przeciwciałami (1: 4000) i przemyto 1 × TBST.

 

1.3 Analiza statystyczna

Dane zliczające wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe. Dane zgodne z rozkładem normalnym i jednorodnością wariancji zostały poddane testowi t, dane zgodne z rozkładem normalnym i nierówną wariancją zostały poddane poprawionemu testowi t; Dane, które nie były zgodne z rozkładem normalnym, zostały poddane testowi nieparametryczne. Do porównania różnic między różnymi grupami zastosowano jednokierunkową ANOVA, a następnie zastosowano metodę LSD do porównania obu grup. P <0. 05 uznano za statystycznie istotny.

 

2 wyniki

2.1 Wpływ desercoli cistanche na strukturę morfologiczną regionu hipokampa CA1 u modelowych szczurów PD Wyniki barwienia wykazały, że neurony w obszarze CA1 hipokampa szczurów grupy pustej były starannie i ściśle ułożone, przy regularnej morfologii i jednolitej dystrybucji, i nie ma oczywistego uszkodzenia komórek neuronalnych; Komórki neuronalne w grupie modelowej zostały ułożone bardziej nieuporządkowane, jądra komórkowe zostały skurczone, barwienie jądrowe zostało pogłębione, a uszkodzenie komórek neuronalnych było oczywiste; Komórki neuronalne w grupie Cistanche Deserticola zostały ułożone bardziej regularnie niż w grupie modelowej, liczba kondensacji jądrowej była stosunkowo zmniejszona, a uszkodzenie komórek neuronowych zostało złagodzone. Wyniki pokazano na rycinie 1.

 

 

Rycina 1 Wpływ Cistanche Deserticola na strukturę patologiczną w regionie CA1 hipokampu u szczura Parkinsona (HE, × 400) Uwaga: A: Grupa kontrolna; B: Grupa modelowa; C: Cistanche Group. Czarne strzałki wskazują uszkodzone komórki nerwowe.

 

2.2 Wpływ Cistanche Deserticola na ultrastrukturę neuronów hipokampa u szczurów modelowych PD

W grupie pustej, obserwując neurony hipokampa, można zaobserwować, że struktura komórki utrzymuje wyraźną morfologię, jądro ma regularny okrągły lub owalny kształt, błona jądrowa pozostaje gładka i nienaruszona, a chromatyna w jądrze jest równomiernie rozłożona, a nie ma agregacji chromatyny jądrowej. Natomiast neurony hipokampa w grupie modelowej wykazały oczywiste zmiany: ogólna gęstość elektronów komórek wzrosła, jądro skondensowało, chromatyna w jądrze agregowana i przyłączona na dno błony jądrowej błony jądrowej pogrubiono, a wakuole zaobserwowano w cytoplazmie. Po interwencji z Cistanche Deserticola, w porównaniu z grupą modelową, neurony hipokampa z grupy Cistanche Deserticola wykazały pewien trend odzyskiwania: rozmiar ciała komórki neuronalnej został przywrócony, błonę komórkową pozostała nienaruszona, liczba krawędzi chromatyny jądrowej chromatyny została zalogowana, a liczba czanna jest wyważona, a liczba czujnych chromatyny jądrowej została zalogowana. Cytoplazma zmniejszyła się, co wskazuje, że Cistanche Deserticola ma pewien wpływ ochronny lub naprawy na komórki nerwowe. Patrz Rysunek 2.

 

Ryc. 2 Wpływ pustynnej Cistanche na ultrastrukturę neuronalną w hipokampie szczurów choroby Parkinsona (× 7000) Uwaga: A: Grupa kontrolna; B: Grupa modelowa; C: Cistanche Group.

 

2.3 Wpływ Cistanche Deserticola na ciała NISSL w neuronach hipokampa szczurów PD szczurów

Wyniki barwienia NISSL wykazały, że neurony w grupie pustej były ściśle ułożone, z regularną morfologią, obfitymi ciałami NISSL i ciemnym barwieniem; Neurony w grupie modelowej zostały luźno ułożone, spuchnięte, a większość ciał NISSL rozpuszczono i lekko wybarwiono; Neurony w grupie Cistanche Deserticola zostały ściśle ułożone, z regularną morfologią, a liczba i barwienie ciał NISSL zostały poprawione w porównaniu z grupą modelową. Wyniki pokazano na rycinie 3.

 

Rycina 3 Wpływ Cistanche Deserticola na ciało NISSL komórek nerwowych hipokampa u szczura choroby Parkinsona (NISSL, × 200) Uwaga: A: grupa kontrolna; B: Grupa modelowa; C: Cistanche Group.

 

2.4 Wpływ Cistanche Deserticola na zawartość SOD i MDA w hipokampie szczurów choroby Parkinsona

 

W porównaniu z grupą pustą zawartość SOD w hipokampie grupy modelowej zmniejszyła się, podczas gdy zawartość MDA wzrosła; W porównaniu z grupą modelową zawartość SOD w hipokampie grupy Cistanche Deserticola wzrosła, podczas gdy zawartość MDA spadła. Patrz Tabela 1.

 

Patka. 1 Wpływ Cistanche Deserticola na zawartość SOD i MDA w hipokampie szczurów choroby Parkinsona

Grupa	SOD (PG/ML)	MDA (PG/ML)
Kontrola	12.36±2.75	2.85±0.83
Model	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Uwaga: w porównaniu z grupą kontrolną, *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Wpływ Cistanche Deserticola na ekspresję białek KEAP1, NRF2 i HO -1 w hipokampie szczurów choroby Parkinsona

Wyniki eksperymentów Western blot wykazały, że ekspresja białek Nrf2 i Ho -1 w hipokampie szczurów w grupie modelowej zmniejszyła się, podczas gdy ekspresja białka KEAP1 wzrosła; W porównaniu z grupą modelową ekspresja białek Nrf2 i Ho -1 w hipokampie szczurów w grupie deserticola Cistanche wzrosła, podczas gdy ekspresja białka KEAP1 zmniejszyła się. Patrz rysunek 4 i tabela 2.

Rycina 4 Wpływ Cistanche Deserticola na ekspresję KEAP1, NRF2 i HO -1 w hipokampie szczurów choroby Parkinsona

Uwaga: A: Grupa kontrolna; B: Grupa modelowa; C: Cistanche Group

 

 

Patka. 2 Wpływ Cistanche Deserticola na ekspresję KEAP1, NRF2, HO -1 w hipokampie szczurów choroby Parkinsona

 

Grupa	KEAPL	NRF2	Ho -1
Grupa pusta	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Grupa modelowa	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Grupa pozytywna	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Uwaga: w porównaniu z grupą kontrolną, *p <{{0}}. 05; W porównaniu z grupą modelową, #p <0,05.