Cistanche Deserticola Polisacharydy osłabia nefropatię cukrzycową u myszy, wpływając na florę jelitową i hamując szlak sygnałowy receptora 4/czynnika jądrowego κB

Streszczenie: Celem tego badania było zbadanie efektu poprawy iPotencjalny mechanizm polisacharydów Cistanche Deserticola (CDP)NANefropatia cukrzycowa (DN)u myszy. Model myszy DN został ustalony przez dietę o wysokiej zawartości tłuszczu (HFD) karmienia w połączeniu z dootrzewnowym wstrzyknięciem streptozotocyny (STZ). Trzydzieści sześć myszy C57BL/6N losowo podzielono na sześć grup (n=6). Wszystkie grupy podawano doustnie wodą destylowaną (kontrolą i modelem), dapagliflozyną lub CDP przez 4 tygodnie. Zmiany w indeksach fizjologicznych, funkcja nerek,czynniki zapalnei oceniano mikroflorę jelit. Wyniki wykazały, że CDP znacznie poprawiły ogólny stan i osłabiłyZmiany histopatologiczne nerki, Izmniejszył poziom glukozy we krwi, Białko w moczuIczynniki zapalneU myszy DN. Ponadto CDP wpłynęło na równowagę mikroflory jelitowej, zwiększył liczebność korzystnych bakterii i zmniejszyły potencjalne bakterie patogenne, co z kolei poprawiło funkcję bariery jelitowej. CDP hamowało również aktywację szlaku sygnałowego receptora Toll-podobnego 4/czynnika jądrowego κB (TLR4/NF-κB) i zmniejszyło uwalnianie lipopolisacharydu (LPS). Podsumowując, CDP wykazują poprawek na DN u myszy, wpływając na mikroflorę jelit i hamując zapalne szlaki sygnałowe. To odkrycie oferuje nowy wgląd w leczenie DN.

 

Słowa kluczowe: Cistanche Deserticola Polysacharydy;Nefropatia cukrzycowa; bariera jelitowa; Flora jelitowa; Receptor tablicy 4; Czynnik jądrowy κB

 

Ekstrakt Cistanche Deserticola z wysokiej jakości surowcami

Kliknij, aby uzyskać więcej szczegółów

 

 

 

Nefropatia cukrzycy (DN)jest główną przyczyną końcowej choroby nerek i poważnie zagraża życiu i zdrowiu pacjentów [1]. Badania potwierdziły, że nierównowaga flory jelit odgrywa ważną patogenną rolę w procesie cukrzycy rozwijającej się w DN [{2}}]. Teoria „osi jelit-kidney” uważa, że ​​zmiany w mikrośrodowisku jelit mogą wpływać na postęp przewlekłej choroby nerek poprzez bezpośrednio regulację metabolitów flory jelitowej [{4}}]. Flora jelit odgrywa ważną rolę w regulacji funkcji nerek w modelach myszy DN [4-5]. Dogłębne badania nad „osą jelit-kidney” pomogą wyjaśnić patogenezę DN i odkryć nowe cele zapobiegania i leczenia.
Cistanche Deserticola to tradycyjna roślina lecznicza i jadalna, znana również jako Cistanche Deserticola, Dijing, Jinsun itp., Powszechnie znana jako Dayun, i ma reputację „żeńcy pustynnej” [6]. Według farmakopei Chińskiej Republiki Ludowej Cistanche Deserticola jest wysuszonym mięsistym łodygą ze łuszczącymi liśćmi Cistanche Deserticola Yc Ma lub C. tubulosa (Schenk) Wight, roślina z rodzaju Cistanche w rodzinie Orobanchaceae.
Wśród nich Cistanche Deserticola ma długą historię stosowania zarówno jako medycyny, jak i jedzenia. Cistanche Deserticola jest słodka, słona i ciepła z natury i wchodzi do południków nerek i jelita grubego. Ma skutki tonizynującego nerki Yang, korzystającego z esencji i krwi oraz zwilżania jelita i łagodzenia zaparć [7-8]. Polisacharydy są jednym z głównych aktywnych składników Cistanche Deserticola. Zawartość polisacharydów w ekstrakcie z wodą w Cistanche Deserticola jest stosunkowo wysoka. Składa się głównie z monosacharydów, takich jak glukoza, galaktoza, ramnoza, arabinoza i fruktoza. Ma wiele efektów farmakologicznych, takich jak regulacja aktywności immunologicznej, przeciwstarzenianie, poprawa uczenia się i pamięci, ochrona nerwów, opór uszkodzenia wątroby, antywirusa i przeciwnowotworowe [{4}}]. Poprzednie badania przeprowadzone przez grupę badawcze wykazały, że ekstrakt z wody w pustyni Cistanche ma potencjalny wpływ terapeutyczny na DN [13]. Na tej podstawie eksperyment ten przejął florę jelitową i odpowiedź zapalną jako punkt wyjścia do zbadania wpływu polisacharydów Cistanche Deserticola (CDPS) na poprawę DN u myszy i przywrócenie funkcji nerek, aby zapewnić naukowe podstawy do roli CDP w leczeniu DN.

1 Materiały i metody

1.1 Zwierzęta, materiały i odczynniki

36 6- Tygodniowe myszy C57BL/6J Myszy zakupiono w Centrum Eksperymentów Zwierząt Xinjiang Medical University, Nr licencji produkcji zwierząt: SCXK (xin) 2023-0006; Rozdzielczość etyki nr.: Iacuc -20210331-04.
Desert CDP (frakcja masy polisacharydowej ＞ 80%, numer partii: 2306019) Shaanxi Xintianyu Company; Dapagliflozyna (DAPA; numer partii: 2108119) AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; Całkowite białko moczu (całkowitego białka moczu, UTP; numer partii: c 035-2-1), azot mocznika (azot mocznika krwi, bug; numer partii: c 013-2-1), kreatynina (kreatyna, cre; liczba partii: c 011-2-1), uric kwas (uriCacid, ua; batch: c {{6})) Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; lipopolysacharyd (lps; numer partii: yx -121619 m), interleukin -6 (IL -6; numer partii: yx-e20012), IL -1 (numer partii: yx-e20533), transformujący czynnik wzrostu YX-E20217), czynnik martwicy nowotworów (TNF-; numer partii: YX-E20220) Kit Shanghai Youxuan Biological Co., Ltd.; ZESTAW ZESTAWU ZEWNĘTRZNEGO CHEMILUMINSECENE (ECL) PEIJING PULILAI GENE Technology Co., Ltd.; Streptozotocyna (STZ; Numer partii: 20230503), dieta wysokotłuszczowa (60% stosunek tłuszczu o oczyszczonym typie diety o wysokiej zawartości tłuszczu, numer materiału: Boaigang12492m) Beijing Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
Podstawowa pasza (zawierająca 22% mąki kukurydzianej, 12% otręby, 18% pozostałości oleju, 8% posiłku rybnego, 12% posiłku sojowego, 0. 17% soli, 0. 25% witamin, 0. Uniwersytet medyczny.

 

1.2 Instrumenty i sprzęt

AE240 Analytical Balance, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Szwajcaria; DHG -9053 Elektryczny piekarnik do suszenia wybuchu, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 stała temperatura wodna, Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co., Ltd.; 3-18 KS szybka wirówka o niskiej temperaturze, Sigmaaldrich, USA; BS -380 w pełni automatyczny analizator biochemiczny, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 Slicer, HI1220 Slicer, Leitz Optilux Digital Microscope, Leica, Niemcy; System obrazowania chemiluminescencji Fluorchem E, Proteinsimple, USA.

1.3 Metody

1.3.1 Eksperyment zwierząt

36 Myszy samce C57BL/6J karmiono w laboratorium SPF na Uniwersytecie Medycznym Xinjiang i karmione swobodnie. Eksperyment przeprowadzono po 7 dniach karmienia adaptacyjnego. Sześć myszy losowo wybrano jako normalną (kontrolną) grupę i otrzymała podstawową dietę. Reszta grup eksperymentalnych karmiono dietą wysokotłuszczową i trzymano w osobnych klatkach. Masę ciała testowano raz w tygodniu. Myszy mogły jeść i pić wodę. Po 6 tygodniach karmienia diety o wysokiej zawartości tłuszczu myszy grupy eksperymentalnej wstrzyknięto dootrzewnowo STZ 4 0 mg/kg przez 5 kolejnych dni oprócz bezpłatnej diety o wysokiej zawartości tłuszczu każdego dnia. Glukoza krwi po modelowaniu wyniosła 11,1 mmol/L, co uznano za udany model cukrzycy. Trzydzieści myszy z udanym modelowaniem losowo podzielono na pięć grup, z sześcioma myszami w każdej grupie, a mianowicie grupy modelu (woda destylowana + wysokotłuszczowa dieta, model), grupa DAPA (DAPA 4 mg/kg + dieta o wysokiej zawartości tłuszczu, DAPA), CDPS niskiej dawki (50 mg/kg + dieta o wysokiej zawartości tłuszczu, CDPS-L). i CDPS w wysokiej dawce (200 mg/kg + dieta o wysokiej zawartości tłuszczu, CDPS-H). Grupa kontrolna (woda destylowana + normalna dieta) podano równą ilość wody destylowanej. Każdą mysz prześladowano 0,1 ml/10 g, raz dziennie w tym samym czasie, w sumie 4 tygodnie. Masę ciała i zmiany glukozy we krwi u myszy rejestrowano co tydzień.

1.3.2 Określenie indeksu

Po 4 tygodniach podawania mgły próbki moczu (24 godziny) i świeżego kału zebrano za pomocą klatek metabolicznych na koniec 4 tygodnia i przechowywano odpowiednio w stopniu -20 i stopnia -80. Myszy pościły, ale nie podlewano przez 12 godzin. Następnego dnia zmierzono masę ciała myszy. Myszy znieczulono przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 3 ml/kg 10% roztworu hydratowego. Krew zebrano z orbit i wirowano w wirówce (4 stopnie, 3 500 r/min) przez 15 minut. Supernatant był aspirowany, zapakowany i przechowywany w lodówce -80 do późniejszego użycia. Serum mierzono dla BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, tgf-, tnf- i lps zgodnie z zestawem. Mocz mierzono przez 24 -godzinne UTP zgodnie z zestawem.

 

1.3.3 Morfologiczna i patologiczna obserwacja nerek i jelit

1.3.3.1 Oznaczanie współczynnika nerki

Po zbieraniu krwi myszy znieczulono na śmierć przez przedawkowanie, a nerki i okrężnicy zostały całkowicie usunięte i natychmiast przepłukane wstępnie chłodzoną solą fizjologiczną, osuszono na bibule filtracyjnym i zważono. Współczynnik nerki obliczono zgodnie z następującym wzorem: współczynnik nerki/%= × 100 m1m, gdzie M1 jest mokrą masą nerki/g; M jest masą ciała myszy/g.

 

1.3.3.2 Patologiczna obserwacja nerek

Mysie nerki utrwalono w 4% paraformaldehydu utrwalającym, odwodniono gradientem roztworu etanolu, przezroczystym ksylenem, osadzono parafiną, pokrojoną (grubość 2 μm), dewalikowano ksylenem i hydrowano za pomocą gradientu roztworu etanolowego, a następnie ściętych hematoksylinem i eozyną (H&E), a periodaninem i hydracją (PAS), PAS), Pas), PAS), PAS), PAS) Zapieczętowano, a obrazy zebrano i obserwowano pod mikroskopem.

 

1.3.3.3 Patologiczna obserwacja jelit

Jelito myszy utrwalono 4% utrwalającą paraformaldehydem, odwodniono gradientem roztworu etanolu, przezroczystym ksylenem, osadzono parafiną, pokrojoną (grubość 2 μm), dewaksowano ksyleną i hydrowano z gradiencją etanolu, a następnie śliniono H&E i błękit niebieski (AB)-i obrazowano pod ksylenem.

 

 

1.3.4 Analiza składu flory jelitowej

Zawartość okrężnicy myszy w grupie kontrolnej, grupie modelowej i grupie CDPS-H wykryto za pomocą wysokiej przepustowej sekwencjonowania genu 16S RRNA. Ekstrakcja DNA i konstrukcja biblioteki oraz sekwencjonowanie mikroorganizmów w zawartości okrężnicy zostały zakończone przez Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., a uzyskane dane analizowano na platformie chmur Lianchuan.

 

1.3.5 Wykrywanie ekspresji białka nerki i okrężnicy

Mysie białka nerek i tkanki okrężnicy ekstrahowano, a białko oznaczono ilościowo metodą kwantyfikacji białka kwasu bicynchoninowego. Po denaturacji białka białko przechowywano w lodówce -20. 10% elektroforezy żelowe dodecyloboliulfinianu-siarczanu siarczanu sodu, przenoszenie membrany dyfluorku poliwinylidenu, membranę umieszczono w soli fizjologicznej buforowanej TRIS z tweenem -20 (TBST) zbiornika inkubacyjnego i zablokowano w temperaturze pokoju. Wykrywanie
Pierwotne przeciwciała do receptorów podobnych do Toll (TLR) 4, czynnik transkrypcji jądrowej (NF) -κB P65, P-NF-κBP65 i -ctin w tkance nerkowej ({{2 000 (v/v) z roztworem TBST) i okludyna i strefy o mocy okludens {10}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}} (Zo -1) w tkance okrężnicy (przeciwciała rozcieńczona 1: 1 000 (v/v) z rozwiązaniem TBST) inkubowano na 4 stopnie przez noc. Rozcieńczenie TBST, wtórne przeciwciało (przeciwciało
Rozcieńczony rozwiązaniem TBST 1∶ 2 000 (v/v)), inkubowanym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przemyty 3 razy, a następnie wykryto przez dodanie odczynnika Luminescencyjnego ECL, a obrazowanie żelu zastosowano do wykrycia ekspresji białka. -aktyna zastosowano jako wewnętrzne odniesienie, a wartość szarości białka analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ. Ekspresja białka każdej grupy wyrażono jako względną wartość szarości grupy kontrolnej.

 

1.4 Statystyka danych

Wszystkie wyniki danych wyrażono jako ± S, a SPSS 21. 0 zastosowano do analizy statystycznej. W przypadku danych ciągłych, jeśli przestrzegają rozkładu normalnego, do porównania międzygrupowego zastosowano jednokierunkową analizę wariancji. Jeśli różnica między grupami była statystycznie istotna, metoda indyka została dalej zastosowana do porównania par; Jeśli dane były zgodne z rozkładem normalnym, do porównania międzygrupowego zastosowano test Kruskal-Wallis H. Gdy istniała statystyczna różnica między grupami, najmniej znaczącą metodę różnicową Durbina zastosowano dalej do wielu porównań. P <0. 05 wskazał, że różnica była statystycznie istotna.

 

 

2 Wyniki i analiza

2.1 Wpływ CDP na glukozę we krwi, masę ciała i współczynnik nerki C57BL/6J

Jak widać z tabel 1 do 3, w porównaniu z grupą kontrolną, glukoza krwi myszy na czczo w grupie modelowej była znacznie zwiększona (p<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Tabela 1 Wpływ CDP na glukozę we krwi myszy (n=6)

Grupa	Czas/tydzień
	0	1	2	3	4
Kontrola	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Model	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Dapa powiedział:	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Jednostka: mmol/l

 

Tabela 2 Wpływ CDP na indeks nerki myszy (n=6)

 

Grupa	Kontrola	Model	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Dapa powiedział:
Nerka/waga ciała %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Tabela 3 Wpływ CDP na masę ciała myszy (n=6)

 

Grupa	Czas/tydzień
	0	1	2	3	4
Kontrola	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Model	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Dapa powiedział:	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Wpływ CDP na funkcję nerek myszy C57BL/6J

Jak pokazano w tabeli 4, w porównaniu z grupą kontrolną, stężenia BUN, CRE i UA w surowicy i 24 -godzinne stężenie masy UTP w moczu myszy w grupie modelowej były znacznie zwiększone (p<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Tabela 4 Wpływ CDP na BUN, CRE, UA i 24 H UTP u myszy DN (n=6)

Grupa	Stężenie BUN (MMOL/L)	Stężenie CRE (μmol/L)	24 -godzinny stężenie zawartości UTP (mg/ml)	Stężenie UA (μmmol/L)
Kontrola	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Model	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Dapa powiedział:	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Wpływ CDP na czynniki zapalne i stężenie masy LPS w surowicy myszy C57BL/6J

 

Jak pokazano w tabeli 5, w porównaniu z grupą kontrolną, poziomy TNF-, IL -1, IL -6, TGF i LPS u myszy w grupie modelowej były znacznie zwiększone (p<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
Wpływ grupy CDPS-H był znaczący (p ＜ 0. 0 5 lub p ＜ 0. 01), a efekt grupy CDPS-H był znaczący (p ＜ 0,01).

Tabela 5 Wpływ CDP na czynniki zapalne i LPS u myszy (n=6)

 

Grupa	Stężenie masy (PG/ML)
	Tnf-	IL -1	IL -6	Tgf-	LPS
Kontrola	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Model	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Dapa powiedział:	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Wpływ CDP na patologię nerek myszy C57BL/6J

Jak pokazano na rycinie 1, po barwieniu H&E, stwierdzono, że struktura kłębuszkowa i morfologia myszy w grupie kontrolnej była normalna i czysta, błona piwniczna była gładka, morfologia kłębuszkowa była regularna, śródmiąższ nerkowy był normalny, kanaliki nerkowe były starannie ułożone, a nie było infiltracji komórek zapalnych. W porównaniu z grupą kontrolną objętość kłębuszkową myszy w grupie modelowej została powiększona, błonę podstawną zagęszczono, komórki zapalne na infiltrowano wokół niej, a kanaliki nerkowe były zaburzone i rozszerzone; W porównaniu z grupą modelową grupy administracyjne CDPS miały różne stopnie poprawy nerków myszy. Objętość kłębuszkową myszy w grupach CDPS-M i CDPS-H była znacznie zmniejszona, grubość błony podstawnej została zmniejszona, tylko niewielka ilość komórek zapalnych na infiltrowano, a kanaliki nerkowe powróciły znacznie i zostały ciasno ułożone. Po 4 tygodniach interwencji CDPS wszystkie warunki patologiczne zostały przywrócone do różnych stopni.

Barwienie Massona wykazało, że kanaliki nerkowe myszy w grupie kontrolnej ułożono normalnie, a kłębuszki były w normalnym kształcie, nie zaobserwowano proliferacji włókien kolagenowych i widziano rurowe błony podstawne; Dużą ilość zabarwionego kolagenu zaobserwowano w nerkowej tkance śródmiąższowej myszy w grupie modelowej, a śródmiąższową tkankę włóknistą otaczano i rozszerzono; Objętość kłębuszkową myszy w grupie CDPS-M została zmniejszona i złagodzono objawy proliferacji tkanki włóknistej; Rurki nerkowe myszy w grupie CDPS-H ułożono regularniej i zaobserwowano niewielką ilość proliferacji włókien kolagenowych.

Wyniki barwienia PA wykazały, że kłębuszki myszy w grupie kontrolnej były normalne i nienaruszone w strukturze; Myszy w grupie modelowej miały uszkodzenie nerek, objętość kłębuszkowa była większa niż normalnie, a kształt był nieregularny, a matryca mezangialna została osadzona; W porównaniu z grupą modelową, uszkodzenie myszy w każdej grupie leczonej lekiem zostało złagodzone, a wraz ze wzrostem dawki kształt i wielkość kłębuszkowego były zwykle normalne, a stopień odkładania matrycy mezangialnej został zmniejszony. Wyniki sugerują, że CDP mogą złagodzić uszkodzenie tkanki nerek u myszy DN.

 

Ryc. 1 Wpływ CDP na zmiany histopatologiczne nerki u myszy DN badanych przez barwienie H&E, Masson i PAS (× 400)