Wyciąg z Cistanche Deserticola zwiększa tworzenie kości w osteoblastach--Część I

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^ai tak

Abstrakcyjny
Cele Zbadaliśmy wpływCistanchedeserticolaMama. (CD) wł.kośćtworzenieprzez hodowane osteoblasty. Metody Test tworzenia zmineralizowanych guzków wykorzystano do zbadania efektów CD . in vitro(CistancheDeserticola)na kośćtworzenie. Ekspresję mRNA fosfatazy alkalicznej (ALP), białek morfogenetycznych kości (BMP)-2 i osteopontyny (OPN) analizowano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Mechanizm działania CD(CistancheDeserticola)ekstrakt badano metodą Western blotting. Antyosteoporotyczne działanie CD in vivo(CistancheDeserticola)ekstrakt oceniano na myszach z wyciętymi jajnikami.
Kluczowe wnioski

płyta CD(CistancheDeserticola)ekstrakt nie miał wpływu na proliferację, migrację ani gojenie ran hodowanych osteoblastów, ale zwiększył ALP, BMP-2 i OPN mRNA oraz mineralizację kości. Inhibitory kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) lub czynnika jądrowego (NF)-kB zmniejszały CD(CistancheDeserticola)indukowany ekstraktemtworzenie kościoraz wyrażenia ALP, BMP-2 i OPN. Jednak CD(CistancheDeserticola)ekstrakt nie wpływał na osteoklastogenezę. Dodatkowo CD(CistancheDeserticola)Ekstrakt zapobiegał utracie kości indukowanej przez wycięcie jajników in vivo.
Wnioski

płyta CD(CistancheDeserticola)może być powieśćtworzenie kościśrodek do leczenia osteoporozy.

Słowa kluczowetworzenie kości; Cistanchedeserticola; chińskie zioło; osteoblasty

Cistanche deserticolajest dobre dlatworzenie kości

Wstęp

Kość jest złożoną tkanką złożoną z kilku typów komórek, które podlegają ciągłemu procesowi odnowy i naprawy zwanego „przebudową kości”. Dwa główne typy komórek odpowiedzialne za przebudowę kości to osteoklasty, które resorbują kość, oraz osteoblasty, które tworzą nową kość. Przebudowa kości jest regulowana przez kilka hormonów ogólnoustrojowych (np. parathormon, 1, 25-dihydroksywitamina D3, hormony płciowe i kalcytonina) oraz czynniki lokalne (np. tlenek azotu, prostaglandyny, czynniki wzrostu i cytokiny).[1] Osteoporoza pojawia się, gdy resorpcja i tworzenie kości są nieskoordynowane, a nadmierny rozpad kości przekracza budowę kości.[2] Obecne metody leczenia osteoporozy obejmują bisfosfoniany, kalcytoninę i estrogen, które są inhibitorami resorpcji kości, które utrzymują masę kostną poprzez hamowanie aktywności osteoklastów.[3] Jednak wpływ tych leków na zwiększenie lub odzyskanie masy kostnej jest stosunkowo niewielki, z pewnością nie więcej niż 2 procent rocznie.[3] Istnieje zatem zapotrzebowanie na środki budujące kości, takie jak teryparatyd, które stymulują nowekośćtworzeniei skorygować zmianę w mikroarchitekturze beleczkowej, która jest charakterystyczna dla ustalonej osteoporozy.[4,5] Ponieważ nowośćkośćtworzeniejest przede wszystkim funkcją osteoblastów, środki, które działają poprzez zwiększanie proliferacji komórek linii osteoblastycznej lub indukowanie różnicowania osteoblastów, mogą zwiększać tworzenie kości.[5,6]
Chociaż mechanizmy osteoporozy pozostają niejasne, prawdopodobnie są one związane ze zmniejszoną dostępnością lub wpływem czynników wzrostu kości, takich jak białka morfogenetyczne kości (BMP).[7] BMP, które są strukturalnie powiązane z nadrodziną transformującego czynnika wzrostu b, zostały pierwotnie zidentyfikowane na podstawie ich zdolności do indukowania ektopowegokość tworzenieu gryzoni.[8] BMP odgrywają ważną rolę w:kośćtworzeniei różnicowanie komórek kostnych poprzez stymulację aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP), a także syntezę proteoglikanu, kolagenu i osteopontyny (OPN).[9] Niedawne badanie wykazało związek między osteoporozą a określonymi polimorfizmami w genach BMP-2, ALP i OPN, co sugeruje, że są one związane z rozwojem osteoporozy.[10]

CistanchedeserticolaMama. (Orobanchaceae; w skrócie CD)(CistancheDeserticola)jest rodzimym ziołem w Chinach i jest szeroko stosowany w medycynie tradycyjnej jako środek terapeutyczny ze względu na jego właściwości uspokajające, przeciwbólowe i immunostymulujące.[11] Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że CD(CistancheDeserticola)ekstrakty mogą stymulować odporność,[12] wymiatać wolne rodniki[13] i zwiększać aktywność dysmutazy ponadtlenkowej.[14] Środki przeciwzapalne i przeciwutleniające mają potencjał w leczeniu osteoporozy poprzez zwiększeniekość tworzeniei/lub hamowanie resorpcji kości.[15,16] Jednak efekt CD(CistancheDeserticola)na funkcję komórek kostnych nie została jeszcze ustalona. Tutaj informujemy, że CD(CistancheDeserticola)ekstrakt nie wpływał na proliferację, migrację ani aktywność gojenia ran hodowanych osteoblastów, ale zwiększał ekspresję ALP, BMP-2 i OPN oraz mineralizację kości. Ponadto pokazujemy, że szlaki sygnałowe kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) i czynnika jądrowego (NF)-kB mogą być zaangażowane we wzrost ekspresji genów i mineralizacji kości, w którym pośredniczy CD. Natomiast CD(CistancheDeserticola)ekstrakt nie hamował osteoklastogenezy in vitro. W szczególności leczenie myszy CD(CistancheDeserticola)Ekstrakt zapobiegał utracie kości indukowanej przez wycięcie jajników in vivo. Nasze dane sugerują zatem, że CD(CistancheDeserticola)może służyć do stymulacjikośćtworzeniedo leczenia osteoporozy.

Cistanche deserticolawzmocnić odporność

Materiały i metody

Ekstrakt i materiały z Cistanche deserticola

płyta CD(CistancheDeserticola)ekstrakt zakupiono z Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajwan). Ekstrakcja i izolacja CD(CistancheDeserticola)były śledzone zgodnie z wcześniejszym opisem (na podstawie danych spektralnych zidentyfikowali skład chemiczny, w tym beta-sitosterol, daukosterol, kwas bursztynowy, triakontanol, akteozyd, betainę i polisacharyd).[17] Królicze przeciwciała poliklonalne specyficzne dla kinaz regulowanych sygnałem pozakomórkowym (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun kinazy N-końcowe (JNK), JNK, p-p65 i p65 zakupiono w Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Zestaw osteokalcyny ELISA zakupiono z Biosource Technology (Nivelles, Belgia). C-końcowe telopeptydy zestawu ELISA dla kolagenu typu I otrzymano z Cross Laps (Herlev, Dania). Dominujący negatywny mutant p38 został dostarczony przez dr J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Dominujący negatywny mutant JNK został dostarczony przez dr M. Karin (University of California, San Diego, USA). Dominujący negatywny mutant ERK2 został dostarczony przez dr M. Cobb (South-Western Medical Center). Wszystkie inne odczynniki otrzymano z Sigma-Aldrich (St Louis, USA).

Hodowlę komórkową

Linię komórkową mysich osteoblastów MC3T3-E1 zakupiono z American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Komórki hodowano w 95% powietrza, 5% CO2 z a-MEM uzupełnionym 20 mm HEPES i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą, 2 mm glutaminą, penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 mg). /ml).

Pomiar powstawania zmineralizowanych guzków

Oceniano tworzenie się zmineralizowanych guzków zgodnie z opisem.[18] W skrócie, osteoblasty hodowano w pożywce zawierającej witaminę C (50 mg/ml) i b-glicerofosforan (10 mm) przez dwa tygodnie, a pożywkę zmieniano co trzy dni. Po inkubacji z CD(CistancheDeserticola)ekstraktu przez 12 dni, komórki przemywano dwukrotnie 20 mm roztworem soli buforowanym Tris zawierającym 0,15 m NaCl (pH 7,4), utrwalano w lodowatym 75% (v/v) etanolu przez 30 min i wysuszony. Odkładanie się wapnia określono za pomocą barwienia czerwienią alizaryny-S. Pokrótce, utrwalone w etanolu komórki i matrycę barwiono przez 1 godzinę 40 mm czerwienią alizarynową-S (pH 4,2) i spłukiwano obficie wodą. Związany barwnik eluowano 10% (wag./obj.) chlorkiem cetylopirydyniowym i czerwienią alizaryny-S w próbkach oznaczano ilościowo przez pomiar absorbancji przy 550 nm i porównywano z krzywą standardową. Jeden mol czerwieni alizaryny-S selektywnie wiąże około dwa mole wapnia.

Cistanche deserticolajest dobre dlatworzenie kości

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

Całkowity RNA wyekstrahowano z osteoblastów przy użyciu zestawu TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Tajwan). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu 2 mg całkowitego RNA i startera oligo(dT).[19,20] Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) została przeprowadzona przy użyciu TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Dodano całkowite cDNA (100 ng na 25-ml reakcji) ze starterami specyficznymi dla sekwencji i sondami Taqman®. Wszystkie startery i sondy genów docelowych zakupiono komercyjnie, w tym β-aktynę jako kontrolę wewnętrzną (Applied Biosystems). Testy qPCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach na systemie detekcji sekwencji StepOnePlus (Applied Biosystems). Warunki cykli to 10-min aktywacja polimerazy w 95 stopniach, a następnie 40 cykli 95 stopni przez 15 s i 60 stopni przez 60 s. Próg został ustalony powyżej tła kontroli niematrycowej iw liniowej fazie amplifikacji genu docelowego w celu obliczenia liczby cykli, w których wykryto transkrypt (oznaczony jako CT).

Analiza Western blot

Lizaty komórkowe przygotowano jak opisano wcześniej. [21,22] Białka rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeniesiono na membrany z poli(difluorku winylu) Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Bloty blokowano 4% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie sondowano króliczymi przeciwciałami antyludzkimi przeciwko p-65 lub p-p65 (1:1000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach, bloty inkubowano ze sprzężonym z peroksydazą drugorzędowym przeciwciałem przeciwkróliczym ośle (1:1000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Bloty wizualizowano przez wzmocnioną chemiluminescencję przy użyciu filmu X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Osteoporoza wywołana wycięciem jajników

W tym badaniu użyto samic myszy ICR w wieku czterech tygodni, 22~28 g. Myszy poddano obustronnemu wycięciu jajników w znieczuleniu trichloroacetaldehydem (100 mg/kg), a myszy kontrolne poddano operacji pozorowanej (Sham) dla porównania. Gęstość mineralną kości i zawartość mineralną kości mierzono po doustnym podaniu różnych stężeń CD(CistancheDeserticola)ekstrakt co dwa dni przez cztery tygodnie. Całkowitą gęstość mineralną kości i zawartość minerałów w kościach określono za pomocą absorpcjometru rentgenowskiego o podwójnej energii (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) przy użyciu opisanego wcześniej trybu dla małych osób.[18, 23] Wszystkie protokoły były zgodne z wytycznymi instytucji i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Chińskiego Uniwersytetu Medycznego.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Podane wartości są średnimi SEM. Analizę statystyczną pomiędzy dwiema próbkami przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta. Porównania statystyczne więcej niż dwóch grup przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji z testem post-hoc Bonferroniego. We wszystkich przypadkach za istotne uznano P <>

Cistanche deserticolajest dobre dlatworzenie kości

Wyniki

Cistanche deserticolaekstrakt zwiększa mineralizację kości przez osteoblasty Dodatek CD(CistancheDeserticola)ekstrakt przez 24 lub 48 godzin nie wpływał na proliferację mysich komórek osteoblastów MC3T3-E1 w teście MTT (dane nie pokazane). Ponieważ różnicowanie osteoblastów jest złożonym procesem obejmującym proliferację i migrację komórek, przetestowaliśmy również zdolność do migracji komórek MC3T3-E1 po leczeniu CD(CistancheDeserticola)wyciąg. Używając Transwell i testów gojenia ran, odkryliśmy, że CD(CistancheDeserticola)ekstrakt nie wpływał na migrację osteoblastów (dane nie pokazane). Powstawanie zmineralizowanych guzków jest jednym z markerów dojrzewania osteoblastów. Barwienie czerwienią alizaryną S wykazało, że zmineralizowane guzki utworzyły się, gdy osteoblasty hodowano przez dwa tygodnie w pożywce zawierającej witaminę C (50 ug/ml) i -glicerofosforan (10 mm), w sposób zależny od stężenia przez dodanie CD(CistancheDeserticola)(Rysunek 1a). Dlatego CD(CistancheDeserticola)ekstrakt indukował tworzenie się guzków kostnych przez hodowane osteoblasty, ale nie ich proliferację lub migrację. Zbadaliśmy również rolę CD(CistancheDeserticola)ekstrakt w osteoklastogenezie indukowanej RANKL, ale nie wykazał żadnego efektu (dane nie pokazane).

Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa ekspresję fosfatazy alkalicznej, białka morfogenetycznego kości-2 i ekspresji osteopontyny w hodowanych osteoblastach

Zróżnicowane osteoblasty wykazują podwyższoną aktywność ALP, która koreluje z wysokim poziomem ekspresji enzymu.[18] Odkryliśmy, że leczenie za pomocą CD(CistancheDeserticola)ekstrakt przez 72 godziny znacząco zwiększył aktywność osteoblastów ALP (Figura 1b). Biorąc pod uwagę kluczową rolę BMP-2, ALP i OPN w różnicowaniu osteoblastów, zbadaliśmy, czy CD(CistancheDeserticola)Ekstrakt wpływa na różnicowanie osteoblastów poprzez regulację ekspresji BMP-2, ALP i OPN. Leczenie komórek CD(CistancheDeserticola)ekstrakty zwiększyły ekspresję mRNA ALP, BMP-2 i OPN w sposób zależny od stężenia (ryc. 1c), wykazując, że CD(CistancheDeserticola)ekstrakt indukował różnicowanie osteoblastów poprzez regulację w górę ekspresji ALP, BMP-2 i OPN.

Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa tworzenie guzków kostnych poprzez szlak kinaz białkowych aktywowanych mitogenami

Doniesiono, że MAPK odgrywa ważną rolę w:kośćtworzenie[24,25], więc następnie zbadaliśmy, czy ta ścieżka sygnałowa jest zaangażowana w CD(CistancheDeserticola)mineralizacja kości wywołana ekstraktem. Wstępne traktowanie komórek inhibitorem ERK U0126, inhibitorem p38 SB203580 lub inhibitorem JNK SP600125 zmniejszyło CD(CistancheDeserticola)ekstrakt zwiększa mineralizację kości (ryc. 2a, 3a i 4a). Ponadto inhibitory blokowały również CD(CistancheDeserticola)indukowana ekstraktem ekspresja ALP, BMP-2 i OPN (ryc. 2b-4c). Transfekcja komórek z mutacją ERK2, p38 lub JNK zmniejszyła CD(CistancheDeserticola)ekstrakt - wzrost ekspresji mRNA ALP, BMP-2 i OPN (ryc. 2c, 3c i 4c). Następnie bezpośrednio zbadaliśmy aktywację ERK, p38 i JNK po CD(CistancheDeserticola)leczenie ekstraktem. Inkubacja komórek z CD(CistancheDeserticola)ekstrakt indukował fosforylację ERK, p38 i JNK (rysunki 2d, 3d i 4d). Dlatego ERK, p38 i JNK pośredniczą w zwiększonymkośćtworzeniewywołane przez CD(CistancheDeserticola)leczenie osteoblastów.

Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa tworzenie guzków kostnych poprzez szlak czynnika jądrowego-kB

Jak wspomniano wcześniej, aktywacja NF-kB jest konieczna do:kośćtworzenie[26,27] Następnie potraktowaliśmy osteoblasty inhibitorami NF-kB ditiokarbaminianem pirolidyny (PDTC) i chlorometyloketonem N-tosylo-L-fenyloalaniny (TPCK) w celu ustalenia, czy aktywacja NF-kB jest zaangażowany w CD(CistancheDeserticola)mineralizacja kości wywołana ekstraktem. Rycina 5a pokazuje, że wstępne traktowanie osteoblastów PDTC lub TPCK hamowało CD(CistancheDeserticola)indukowane ekstraktem tworzenie się guzków kostnych, a także zmniejszało wzrost ekspresji ALP, BMP-2 i OPN (Figura 5b i 5c). Fosforylacja podjednostki NF-kB p65 jest wskaźnikiem aktywacji NF-kB; [28] zgodnie z tym stwierdziliśmy, że CD(CistancheDeserticola)ekstrakt zwiększył fosforylację p65 w osteoblastach (Figura 5d). Wyniki te wskazują, że aktywacja NF-kB jest ważna dla indukowanej ekstraktem CD ekspresji ALP, BMP-2 i OPN oraz tworzenia guzków kostnych.

Rycina 4 Zaangażowanie c-Jun N-końcowych kinaz (JNK) wCistanchedeserticola(CD) mineralizacja kości wywołana ekstraktem (CD) w osteoblastach. (a) Komórki umieszczono na płytkach 24-studzienkowych i hodowano w pożywce zawierającej witaminę C (50 mg/ml) i b-glicerofosforan (10 mM) przez dwa tygodnie. Komórki jednocześnie traktowano CD(CistancheDeserticola)ekstrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Tworzenie się zmineralizowanych guzków oceniano za pomocą barwienia czerwienią alizaryny-S (n=5). (b, c) Komórki wstępnie traktowano SP600125 przez 30 minut lub transfekowano mutantem JNK lub 24 godziny, a następnie stymulowano ekstraktem CD i aktywnością fosfatazy alkalicznej (ALP) i ALP, białkiem morfogenetycznym kości (BMP) -2 i Ekspresję mRNA osteopontyny (OPN) mierzono za pomocą zestawu ALP i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. (d) Komórki traktowano ekstraktem CD przez wskazane przedziały czasowe, a ekspresję p-JNK badano metodą Western blot. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(CistancheDeserticola)grupa traktowana ekstraktem.

Hamowanie utraty masy kostnej przez ekstrakt z Cistanche deserticola u myszy po usunięciu jajników

Aby zbadać efekt CD(CistancheDeserticola)ekstraktu na utratę kości, osteoporozę indukowano u samic myszy przez wycięcie jajników. Jak oczekiwano, myszy z wyciętymi jajnikami wykazywały zmniejszoną całkowitą gęstość mineralną kości ciała i zawartość składników mineralnych kości (Figura 6a i 6b). Leczenie CD(CistancheDeserticola)ekstrakt przez cztery tygodnie hamował utratę gęstości mineralnej kości i zawartości mineralnej kości w sposób zależny od dawki (ryc. 6a i 6b). Stężenie ALP we krwi może odzwierciedlać aktywność osteoblastów.[29] Jak pokazano na rysunku 6c, CD(CistancheDeserticola)ekstrakt hamował spadek aktywności ALP w surowicy indukowany przez wycięcie jajników. Dodatkowo CD(CistancheDeserticola)ekstrakt zwiększał również poziom osteokalcyny, markerakośćtworzeniei obniżył poziom C-końcowych telopeptydów kolagenu typu I, markera resorpcji kości (Figura 6d i 6e). Te odkrycia potwierdzają zatem siłę i skuteczność CD(CistancheDeserticola)ekstrakt w zapobieganiu utracie masy kostnej in vivo.

Rycina 6 Hamowanie wywołanego wycięciem jajników zmniejszenia gęstości mineralnej kości i zawartości mineralnej kości oCistanchedeserticola(CD) wyciąg. Samice myszy ICR poddano pozorowanej operacji lub wycięciu jajników. Myszy z wyciętymi jajnikami leczono wskazanymi stężeniami CD(CistancheDeserticola)ekstrakt przez karmienie doustne. Całkowita gęstość mineralna kości (a), zawartość minerałów w kości (b), aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP) w surowicy (c), osteokalcyna w surowicy (d) i telopeptydy C-końcowe w surowicy kolagenu typu I (e) zostały określone cztery tygodnie po zabiegu. Dane przedstawiono jako średnią SE, n=8–10 myszy/grupę. *P < 0.05,="" w="" porównaniu="" z="" fikcją;="" #p="">< 0,05,="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" po="" usunięciu="">

DYSKUSJA

Kliknij tutaj, aby uzyskać informacje o Części II (Dyskusja i wnioski) tego artykułu.

Z: 'Cistanchedeserticolaekstrakt wzrastakośćtworzeniew osteoblastach przezTe-Mao Li^ai inni

---© 2012 Autorzy. JPP © 2012 Królewskie Towarzystwo Farmaceutyczne 2012Czasopismo Farmacji i Farmakologii, 64, s. 897–907