Olejki eteryczne zawierające cytral jako potencjalne inhibitory tyrozynazy: biologicznie sterowane podejście do frakcjonowania

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakcyjny:

Nadmierna produkcja melaniny powoduje poważne schorzenia dermatologiczne, a także drobne problemy estetyczne (np. piegi i plamy soczewicowate słoneczne). Zmniejszenie poziomu tyrozynazy jest szeroko rozpowszechnionym podejściem do leczenia takich zaburzeń, a ekstrakty roślinne często okazują się cennymi źródłamityrozynazainhibitory. Citral (mieszanka neralu i geranialu) jest ważnym składnikiem zapachowym, który wykazuje potencjał antytyrozynazowy. Jest wysoce skoncentrowany w olejkach eterycznych (EO) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. i Verbenaofficinalis L. Jednak tylko L. cubeba EO był badany pod kątem stosować jako potencjalny środek wybielający skórę. Ta praca ocenia in vitrotyrozynazahamujące działanie tych EO i badania, z zastosowaniem frakcjonowania ukierunkowanego na testy biologiczne, czy ich różne składy chemiczne wpływają na ogólne działanie hamujące EO poprzez możliwe synergistyczne, addytywne i/lub konkurencyjne interakcje między składnikami EO. Aktywność hamująca C. schoenanthus EO i M. officinalis EO, przy znikomych ilościach (plus)-cytronellalu, była zgodna z zawartością cytralu. Z drugiej strony zahamowanie EO L. cubeba i V. officinalistyrozynazaw znacznie większym stopniu, ponieważ zawierały -mircen, który przyczynił się do ogólnej aktywności EO. Podobne obserwacje poczyniono dla M. officinalis EO, który charakteryzuje się wysoką zawartością (plus)-cytronellalu, który zwiększa aktywność cytralu.

Słowa kluczowe:tyrozynazazahamowanie; olejki eteryczne; cytralu

cistanche pełni funkcję wybielającą

Wstęp

Tyrozynazajest kluczowym enzymem w biosyntezie pigmentów melaninowych u wielu bakterii, grzybów, roślin, zwierząt i ludzi. U ludzi tyrozynaza katalizuje ograniczające szybkość etapy szlaku biosyntezy melaniny. Biosynteza ta charakteryzuje się kilkoma reakcjami enzymatycznymi i chemicznymi, które prowadzą do tworzenia melaniny z aminokwasu L-tyrozyny, przy czym tyrozynaza katalizuje jej hydroksylację do o-dopachinonu poprzez aktywność mykofenolanu i difenoli. Chociaż istnieją inne enzymy zaangażowane w melanogenezę, jedynie reakcje katalizowane przez tyrozynazę nie mogą zachodzić spontanicznie, podczas gdy pozostałe etapy mogą przebiegać bez aktywności enzymu w fizjologicznym pH [1]. produkcji, a zastosowanie inhibitorów tyrozynazy jako środków wybielających skórę wykazało znaczące znaczenie kliniczne i kosmetyczne [2].

Na rynku UEtyrozynazaInhibitory stosowane jako środki wybielające skórę można podzielić na dwie główne kategorie: te zakazane na mocy rozporządzenia UE 1223/2009 dotyczącego kosmetyków (tj. hydrochinon i hydrochinon monobenzyloeterowy) ze względu na ich poważne skutki uboczne, ale które są nadal stosowane w leczeniu przebarwień w medycynie. nadzór; oraz inhibitory tyrozynazy, które są dopuszczone do stosowania w produktach kosmetycznych (tj. arbutyna, aloezyna, kwas kojowy) [2,3]. Ta druga grupa jednak nadal charakteryzuje się potencjalnie istotnymi skutkami ubocznymi; badania kliniczne nad kwasem kojowym rzeczywiście ujawniły przypadki rumienia, odczuć pieczenia i wyprysku kontaktowego po zastosowaniu. Podobnie Europejski Komitet Naukowy ds. Bezpieczeństwa Konsumentów wyraził obawy dotyczące stosowania arbutyn jako składnika kosmetycznego [2], ze względu na potencjalną hydrolizę wiązania glikozydowego, które uwalnia hydrochinon. Istnieje zatem zapotrzebowanie na nowe szablony cząsteczek i/lub mieszaniny związków bioaktywnych do leczenia przebarwień.

Rośliny są cennym źródłem środków wybielających skórę, a trzy z pięciu najczęściej stosowanych środków, zarówno w medycynie, jak i kosmetyce, są wyspecjalizowanymi metabolitami roślin (tj. hydrochinon, -arbutyna, aloezyna). Do tej pory związki fenolowe były głównie badane jako potencjalnetyrozynazainhibitory, a należą do nich flawonoidy (np. kwercetyna [4]), stylbeny (np. resweratrol [1]), fenylopropanoidy (np. aldehyd cynamonowy [5] i eugenol [6]) oraz kwasy fenolowe (np. kwas anyżowy i kwas benzoesowy [7]). Zainteresowanie forterpenoidami było znacznie mniejsze i stosunkowo mało zbadano je jako środki przeciw tyrozynazie.

Citral należy do ograniczonej liczby badanych pochodnych terpenoidów o właściwościach antytyrozynazowych. Jest to mieszanina dwóch izomerów, cis- i trans-3,7-dimetylo-2,6-oktadienalu (tj. neralu i geranialu), które okazały się blokować enzymatyczna aktywność grzyba in vitrotyrozynaza[8]. Oprócz swojego znaczenia jako składnik zapachowy w napojach, żywności i kosmetykach, cytral wykazał obiecującą aktywność biologiczną in vitro, w tym działanie przeciwgrzybicze, przeciwbakteryjne, przeciwutleniające i przeciwzapalne [9–11]. Podkreślono, że cytral ma potencjalne znaczenie terapeutyczne jako środek rozluźniający mięśnie gładkie i miejscowo znieczulający, ponieważ sprzyja relaksacji mięśni gładkich tchawicy, macicy i aorty oraz hamuje pobudliwość nerwów w modelach zwierzęcych [12–15].

Cytral otrzymuje się z olejków eterycznych (EO) kilku gatunków roślin, w tym Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. i Verbena officinalis L. Według najlepszych autorów wiedzy, tylko L. cubeba EO została zbadana pod kątem jejtyrozynazaaktywność hamująca [16]. Dlatego niniejsze badanie ma na celu ocenę aktywności hamujących tyrozynazę EO C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis i V. officinalis przy użyciu testu kolorymetrycznego in vitro, aby ocenić, czy różne składy chemiczne wpływają na ogólne działanie hamujące EO poprzez możliwe synergiczne, addytywne i/lub konkurencyjne interakcje między ich składnikami. Badanie to wykorzystuje podejście frakcjonowania opartego na testach biologicznych do kompleksowej oceny składników EO i ich enancjomerów, gdy chiralne, które przyczyniają się do aktywności hamującej EO wobec źródła tyrozynazy w grzybach, co jest dobrym modelowym systemem do wstępnego badania przesiewowegotyrozynazainhibitory [17].

2. Wyniki i dyskusja

2.1. Skład chemiczny i zawartość cytralu w badanym olejku eterycznym

W naszej próbie kompleksowego scharakteryzowania wszystkich potencjalnych składników EO, które przyczyniają się do rozważanej aktywności biologicznej, badane EO zostały przeanalizowane metodą GC, z wykrywaniem zarówno FID, jak i MS. Znormalizowane względne zawartości procentowe (obliczone z bezwzględnych powierzchni znormalizowanych do wzorca wewnętrznego C13 przy użyciu współczynników odpowiedzi [18,19]) wszystkich wykrytych związków zostały określone i wykorzystane do porównania składu EO. Rysunek 1 przedstawia profil GC-MS badanych EO analizowanych za pomocą konwencjonalnej kolumny. W tabeli 1 wymieniono, dla każdego badanego EO, związki, które wykazywały znormalizowaną zawartość procentową powyżej 0.1, podczas gdy pełne składy chemiczne EO przedstawiono w materiałach uzupełniających (tabele S1–S5).

Wszystkie badane EO są bogate w neral (cis{0}},7-dimetylo-2,6-oktadienal) igeranial (trans-3,{ {5}}dimetylo-2,6-oktadienal), które są najpowszechniejszymi związkami. Stosunek theneral/geranial był bardzo podobny we wszystkich badanych EO i odpowiadał 0.74 ± 0,05. EO C. schoenanthus i L. cubeba wykazują najwyższą zawartość neralną i geraniową, która stanowi średnio 60 procent ich całego składu EO, i która jest 1. 5- raza większa niż u V. officinalis EO i in. trzy M. officinalis EO (tj. Próbka 1, 2 i 3). Dodatkowe związki utlenione, które są wspólne dla wszystkich EO, to 6-metylo-5-hepten-1-on, linalol i cytronellal. Ten ostatni jest znacznie liczniejszy w M. officinalis EO 1 niż w innych badanych EO, w tym w M. officinalis EO2 i 3.

Zawartość frakcji węglowodorów różni się znacznie w różnych EO.M. officinalis EO 1 zawiera tylko trans- -kariofilen i -humulen jako węglowodory seskwiterpenowe, które stanowią odpowiednio 2,7 procent i 00,13 procent całkowitego EO. C.schoenanthus EO zawiera nieco bogatszą frakcję węglowodorów niż M. officinalis EO 1 (tj. 7,0 procent), zawierający oba monoterpeny (tj. kamfen, cis{{1{{20 }}}}ocimen, limonen, -pinen,trans- -ocimen, -thujene) i seskwiterpeny (tj. trans- -kariofilen, -kadinene,δ-kadinene, germacrene D, -elemen) w umiarkowanych kwoty. W EO L. cubeba i V. officinalis frakcja węglowodorów stanowi 20 procent całkowitego EO, a limonen jest związkiem najczęściej występującym (tj. odpowiednio 15,0 i 10,9%), a następnie -pinen, pinen , sabinen, trans- -kariofilen, -mircen, kamfen i -kopaen. Wreszcie, M.officinalis EO 2 i 3 charakteryzują się najwyższą zawartością frakcji węglowodorowej (odpowiednio 38,8% i 31,8% całkowitego EO). W obu próbkach frakcja węglowodorowa zawiera głównie seskwiterpeny, a mianowicie trans- -kariofilen (odpowiednio 27,8% i 20,0%) i -humulen (3,0% i 2,6 procent) oraz zredukowaną frakcję monoterpenową, którą charakteryzuje głównie limonen ( odpowiednio 4,2 proc. i 3,2 proc.).

Zbadano trzy próbki L. cubeba, V. officinalis i C. schoenanthus Eos wyprodukowane w różnych latach, a także trzy próbki M. officinalis Eos z różnych producentów. Analizy GC-MS C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis i V. officinalis nie wykazały istotnych różnic jakościowych i ilościowych w składzie chemicznym trzech próbek z różnych lat produkcji. Można to przypisać optymalnym warunkom przechowywania, tj. w pojemniku z bursztynowego szkła w temperaturze 4 ◦C w ciemności przy znikomej przestrzeni nad głową. Z drugiej strony analizy GC-MS wykazały istotne różnice w obfitości cytronellalu i trans{{4 }} kariofilen w trzech badanych EO M. officinalis. Citronella wyniosło 19,6 procent, 00,26 procent i 00,31 procent odpowiednio w przypadku M. officinalis EO 1, 2 i 3. Przeciwnie, jak opisano wcześniej, trans- -kariofilen występuje znacznie częściej w M. officinalis EO 2 i 3 niż w M. officinalis EO 1. Wyniki te są zgodne z odkryciami przedstawionymi przez Seidler-Lozykawska i wsp., którzy podkreślili istotne różnice w obfitości cytralu, cytronellalu i trans- -kariofilenu w EO uzyskanych z 22 wybranych genotypów M. officinalis pochodzących z europejskich ogrodów botanicznych [20].

Prawdziwe oznaczenie ilościowe przeprowadzono przez kalibrację wzorca zewnętrznego w celu dokładnej oceny obfitości potencjalnych bioaktywnych związków specjalistycznych (tj. neralu, geranialu, limonenu, -mircenu i cytronellalu. Tabele 2 i 3 podają jony diagnostyczne (m/z) stosowane dla SIM- Oznaczenie ilościowe MS badanych związków markerowych wraz z zakresem kalibracji, równaniem krzywej kalibracji, wartościami korelacji i błędem standardowym regresji dla każdego analitu i wynikami oznaczenia ilościowego, odpowiednio.

2.2. Działanie hamujące in vitro badanych olejków eterycznych na tyrozynazę grzybową

Jak opisano wcześniej, EO C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba i V. officinalis wykazują wysoki poziom cytralu, który charakteryzuje się niekonkurencyjną aktywnością hamującą wobec grzybowego źródła tyrozynazy [8,16,21]. . Niniejsze badanie miało na celu zbadanie in vitrotyrozynazahamujące aktywności tych EO w celu zbadania, czy ich aktywność hamującą można przypisać tylko zawartości cytralu, czy też istnieją inne bioaktywne związki, które wpływają na hamujące działanie EO.

Grzybtyrozynazazostał tu przyjęty ze względu na jego wysoką homologię do humantyrozynazy, stosunkowo niski koszt i łatwą dostępność, co czyni go dobrym systemem modelowym do wstępnego badania przesiewowego inhibitorów tyrozynazy [17]. Precyzja in vitrotyrozynazaTest hamowania oceniano pod względem powtarzalności (przez wykonanie testu hamowania enzymatycznego pięć razy tego samego dnia) i precyzji pośredniej (przez powtarzanie testu hamowania enzymatycznego pięć razy co cztery tygodnie przez okres sześciu miesięcy). Tabela 4 podaje współczynnik zmienności (CV) dla testów hamowania przeprowadzonych z kwasem kojowym, który zastosowano jako kontrolę dodatnią, oraz z L. cubeba EO. Wyniki były zadowalające, ponieważ CV nigdy nie przekraczało 7% dla powtarzalności i 10% dla pośredniej precyzji. Tabela 4 podaje współczynnik zmienności dla testów hamowania przeprowadzonych z kwasem kojowym, stosowanym jako kontrola pozytywna, iz L. cubeba EO. Podobne wartości precyzji uzyskano dla wszystkich testowanych EO.

Krzywą stężenie cytralu – odpowiedź badano wykreślając obserwowaną aktywność hamującą w funkcji jego stężenia w mieszaninie reakcyjnej. Wszystkie EO były testowane przy stężeniu 166,7 µg/ml, co dało, niezależnie od EO, wynikowe stężenie cytralu w zakresie liniowości jego krzywej odpowiedzi na stężenie (y=0.3956x plus 1.8094,R{{7} }.9951, błąd regresji: 2,08448, zakres liniowości: 6,7–166,7 µg/mL) i nie generował problemów z rozpuszczalnością w mieszaninie reakcyjnej.

Wykres skrzynkowy przedstawiony na rysunku 2 przedstawia procenttyrozynazahamowanie dla każdego EO. W przypadku EO L. cubeba, V. officinalis i C. schoenanthus wyniki przedstawione na Ryc. 2 odpowiadają aktywności hamującej tyrozynazę grzybów EO 2020, ponieważ analiza wariancji nie wykazała żadnych statystycznie istotnych różnic między EO różnych lata produkcji (p > 0,05). W odniesieniu do EO L. cubeba i C. schoenanthus wyniki te są zgodne z wynikami uzyskanymi z ilościowych analiz GCMS, które wykazały niemal identyczną ilość cytralu w EO z różnych lat produkcji. Partia 2020 V. officinalis EO zawiera nieco wyższą ilość cytralu niż partie 2019 i 2018. Jednakże, zgodnie z krzywą odpowiedzi na stężenie cytralu, nadmiar cytralu w partii 2020 nie jest wystarczający do określenia statystycznie istotnie wyższego procentu hamowania enzymatycznego, biorąc pod uwagę losową błąd związany z pomiarami. Aby uzyskać dodatkowe szczegóły, patrz Rysunek S1 w Materiałach Uzupełniających. Z drugiej strony, analiza wariancji (ANOVA), a następnie post-hoctest Tukeya-Kramera ujawniła, że ​​trzy testowane EO M. officinalis, dostarczone przez różnych producentów, hamowały grzyby.tyrozynazaw różnym stopniu, co zostanie szerzej opisane w kolejnych punktach. Największą aktywność hamującą zaobserwowano dla EO L.cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis, które hamowały 59 ± 6 procent, 55 ± 7 procent i 52 ± 6 procenttyrozynazaaktywność, odpowiednio, przy badaniu w stężeniu 166,7 µg/ml. Statystycznie istotne (p < 0="" 0,05)="" niższe="" aktywności="" zaobserwowano="" dla="" eo="" c.="" schoenanthus="" i="" m.="" officinalis="" 2="" i="" 3,="" których="" aktywność="" hamująca="" enzym="" wynosiła="" 42="" ±="" 5="" procent="" ,="" 40="" ±="" 5="" procent="" i="" 38="" ±="" 6="" procent="" odpowiednio.="" tabela="" 5="" przedstawia="" stężenie="" inhibitora,="" które="" zmniejsza="" o="" połowę="" aktywność="" enzymu="" w="" danych="" warunkach="" doświadczalnych="" (ic50)="" dla="" każdego="" badanego="" inhibitora="" (tj.="" eo,="" pojedynczych="" związków="" i="" kwasu="" kojowego).="" wszystkie="" eo="" skutecznie="" hamowały="" tyrozynazę="" grzybową="" i="" wykazywały="" aktywność="" hamującą="" średnio="" 100-razy="" niższą="" niż="" kojicacid,="" który="" zastosowano="" jako="" kontrolę="">

2.3. Identyfikacja dodatkowych składników bioaktywnych, oprócz cytralu, metodą frakcjonowania sterowanego testami biologicznymiHistogram przedstawiony na rysunku 3 porównuje odsetek eksperymentalnie zmierzonych hamowań enzymatycznych z wartościami, których można by się spodziewać, gdyby neral i geranial (traktowane jako suma, tj. cytral) były tylko związki aktywne w badanych EO. Wartości te zmierzono poprzez interpolację z krzywej stężenie cytralu-odpowiedź. Jak można zauważyć, C. schoenanthus, M. officinalis 2 i M. officinalis 3 wykazywały aktywność hamującą, która była zgodna z zawartością cytralu, podczas gdy L. cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis hamowały grzyby EO tyrozynaza w większym stopniu niż oczekiwano. Przyjęto podejście oparte na bioprzewodnictwie, aby zidentyfikować dodatkowe związki, które przyczyniają się do aktywności cytralu. Utlenione i węglowodorowe frakcje EO L. cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis zostały wyizolowane przez chromatografię flash i indywidualnie przetestowane pod kątem ich grzybówtyrozynazadziałania hamujące. Frakcje fitochemiczne przetestowane pod kątem aktywności hamującej tyrozynazę grzybową. Frakcje frakcje fitochemiczne badano w tym samym stężeniu, co ich stężenie wynikowe podczas badania 166,7 µg/ml odpowiedniego EO (patrz rozdział Materiały i metody w części 3.2). W tabeli 6 podano stężenie neralu, geranialu, cytronellalu, limonenu, oraz -mircen we frakcjach utlenionych i węglowodorowych frakcjonowanych EO.

Jeśli chodzi o EO L. cubeba i V. officinalis, zarówno frakcja tlenowa, jak i węglowodorowa hamowały tyrozynazę grzybową, chociaż w różnym stopniu. Aktywności frakcji utlenionych (odpowiednio 53 ± 3 procent i 44 ± 5) stanowią większość EOsanti-tyrozynazapotencjał i były zgodne z odpowiednią zawartością cytralu, co sugeruje, że związki, które przyczyniają się do aktywności cytralu, należą do frakcji węglowodorowych. Frakcje węglowodorów EO L. cubeba i V. officinalis mają dość podobny skład chemiczny. Limonen (odpowiednio 68,4 i 50,3 proc.), trans- -kariofilen (odpowiednio 12,0 i 7,8 proc.), -pinen (odpowiednio 1,7 i 7,5 proc.), -pinen (odpowiednio 2,5 i 12,9 proc.), sabinen (odpowiednio 2,7 i 3,8) i -mircen (odpowiednio 2,0 i 2,4 proc.) są związkami najobficiej występującymi w obu frakcjach i występują w dość zbliżonych ilościach, z wyjątkiem -pinen i -pinen, które dominują we frakcji węglowodorów V. officinalis EO.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 procent w obu EO), limonen (odpowiednio 97 i 94 procent w L. cubeba i V. officinalis EO) i sabinen (87 procent w obu EO), podczas gdy różne nadmiary enancjomeryczne zaobserwowano dla -pinenu ((-)- enancjomer: 38 procent w L. cubebaEO i 73 procent w V. officinalis EO) i -pinen ((-)-enancjomer: 67 procent w L. cubeba EO i 88 procent w V. officinalis EO). W obu EO (-)-limonen stanowi ponad 50 procent całej frakcji. Jednakże, chociaż poprzednie badania donosiły o działaniu hamującym tyrozynazę grzybową z powodu jej dużej obfitości [22,23], (-)-limonen tutaj nie wykazywał aktywności hamującej tyrozynazę. Podobne wyniki uzyskano dla (plus )-limonenu, mieszaniny racemicznej i związków (-)-trans- -kariofilen, (±)- -pinen i (±)- -pinen . Sabinene nie została przetestowana, ponieważ udowodniono już, że ma znikome grzybytyrozynazadziałanie hamujące [8]. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami [8], mircen zmniejszył aktywność tyrozynazy grzybowej. Podczas badania w stężeniu obserwowanym w 166,7 µg/ml EO L. cubeba i V. officinalis, aktywność -mircenu wypełniała lukę pomiędzy oczekiwanymi efektami hamującymi EO, jeśli cytral był jedynym aktywnym związkiem, a wynikami doświadczalnymi. Wbrew obserwacjom Matsuury i in. [8], -myrcen okazał się silniejszym inhibitorem tyrozynazy grzybowej niż cytral, ponieważ jego IC50 było prawie dziesięciokrotnie niższe (13,3 µg/ml vs. 121,8 µg/ml). Różnicę tę można przypisać różnym zastosowanym substratom; Matsuura i in. badali jedynie aktywność difenolazy tyrozynazy grzybowej, ponieważ jako substrat użyli L-DOPA, podczas gdy w tym badaniu użyto L-tyrozyny. Obecne odkrycia sugerują, że -myrcen może być skuteczniejszy w hamowaniu aktywności monofenolazy tyrozynazy grzybowej niż difenolazy.

M. officinalis EO 1 wykazuje niewielką frakcję węglowodorów, która stanowi mniej niż 3 procent całości i nie wykazuje aktywności hamującej tyrozynazę. Jednak utleniona frakcja M. officinalisEO 1 hamowała tyrozynazę grzybową w większym stopniu niż można by oczekiwać na podstawie zawartości cytralu (Rysunek 3). Frakcja ta zawiera znaczne ilości cytronellalu oprócz neralu i geranialu, a analiza chiralna wykazała wysoką czystość enancjomeryczną cytronellalu na korzyść (plus) enancjomeru (98,3%). W niezależnym teście, w stężeniu 166,7 µg/ml (plus)-cytronellal hamował w znikomym stopniu grzybtyrozynazę, chociaż jego aktywność była znacznie zwiększona w przypadku testowania w połączeniu z cytralem. Wyniki te mogą wyjaśniać różnice obserwowane w procentach grzybówtyrozynazahamowanie w różnych EO M. officinalis. M. officinalis EO 2 i 3 charakteryzują się bardzo niską zawartością cytronelli, co może być powodem, dla którego ich aktywność hamująca jest znacznie niższa niż M. officinalis EO 1.

3. Materiały i metody

3.1. Odczynniki

Dimetylosulfotlenek (DMSO), tyrozynaza grzybowa z Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrozyna, kwas kojowy, cytral, cytronellal, -mircen, (plus)-limonen, (-)-limonen,(±)-limonen, ( ±)-, a pinen zakupiono od Merck Life Science Srl (Mediolan, Włochy). Litsea cubeba, Verbena officinalis i Cymbopogon schoenanthus EO zostały dostarczone przez Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Włochy). Dla każdej z nich przetestowano trzy partie z różnych lat (tj. 2020, 2019, 2018). Zbadano trzy próbki EO Melissa officinalis; jedna została dostarczona przez Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), jedna przez ErboristeriaMagentina Srl, a ostatnia została zakupiona w lokalnym sklepie i pochodziła ze Specchiasol S.rl (Bussolengo, Włochy). W tekście autorzy odnoszą się do różnych EO Melissaofficinalis jako odpowiednio M. officinalis EO 1, 2 i 3. Dostarczone EO uzyskano zgodnie z procedurami opisanymi w Farmakopei Europejskiej [24]. EO Melissa officinalis i Verbena officinalis zostały wyprodukowane przez hydrodestylację, odpowiednio, z liści i części nadziemnych roślin; podobnie, EO Litsea cubeba i Cymbopogon schoenanthus otrzymano przez destylację z parą wodną odpowiednio świeżych owoców i świeżych części nadziemnych. Każdy EO był indywidualnie analizowany za pomocą GC-MS, gdy tylko został zakupiony/dostarczony przez odpowiedniego producenta, w każdym roku przechowywania i tuż przed badaniem jego aktywności hamującej grzybyrozynazę.

3.2. Test hamowania tyrozynazy in vitro

ThetyrozynazaAktywności hamujące EO i wyizolowanych związków badano in vitro stosując kolorymetryczny test enzymatyczny oparty na odczycie, zoptymalizowany przez Zengh et al. [25], z niewielkimi modyfikacjami. Aktywności EO hamujące tyrozynazę, a także ich odpowiednie frakcje węglowodorowe i utlenione oraz czyste związki badano in vitro przy użyciu testu enzymatycznego opartego na odczycie kolorymetrycznym, który został zoptymalizowany przez Zengh et al. [25], z niewielkimi modyfikacjami: test przeprowadzono w temperaturze pokojowej ityrozynazahamowanie mierzono biorąc pod uwagę absorbancję kontroli i próbki po 6 minutach inkubacji, a nie po 20 minutach, tak aby działać w liniowej części reakcji enzymatycznej, co zapewnia dokładniejsze wyniki hamowania [26, 27]. Do tego badania wybrano tyrozynazę grzybową z Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach. Jako substrat zastosowano L-tyrozynę, co oznacza, że ​​zbadano całkowitą aktywność hamującą tyrozynazę bez rozróżniania między aktywnością monofenolazy tyrozynazy i difenolazy. Pomiary fotometryczne przy 475 nm przeprowadzono na termospektronie Genesys6, a kwas kojowy zastosowano jako inhibitor kontroli pozytywnej. Roztwory badanych potencjalnych inhibitorów (EO, izolowane frakcje EO, pojedyncze związki EO oraz kojicacid) przygotowano w DMSO. W tabeli 7 podano przebadane stężenia dla każdego badanego potencjalnego inhibitora. Grzybtyrozynazaroztwór 200 U/mL (27,9 µg/mL) przygotowano w buforze fosforanu sodu (pH 6,8), a porcje 9 ml przechowywano w temperaturze -18 ◦C i rozmrażano tuż przed eksperymentami. Roztwór tyrozyny 0,1 mg/ml przygotowano w buforze fosforanu sodu (pH 6,8) i codziennie wymieniano. Składniki mieszaniny reakcyjnej umieszczono w fiolce w następującej kolejności: 1 ml grzybowego roztworu tyrozynazy 200 U/ml; 1 ml roztworu buforowego fosforanu sodu; 10 µl EO/pojedynczy związek/roztwór kwasu kojowego; i na koniec 1 ml roztworu tyrozyny 0,1 mg/ml. Ostateczna zawartość procentowa DMSO w mieszaninie reakcyjnej wynosiła 0,3 procent. Test przeprowadzono w szczelnie zamkniętej fiolce o pojemności 4 ml, aby uniknąć utraty jakichkolwiek składników EO do otaczającego środowiska i zminimalizowania ich uwalniania do przestrzeni nad mieszaniną reakcyjną. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w termostatowanej łaźni wodnej w 25°C przez 6 min. Następnie zarejestrowano absorbancję przy 475 nm, ponieważ ta długość fali pozwala na identyfikację dopachromu. Absorbancję odpowiadającą 100% aktywności tyrozynazy mierzono przez zastąpienie roztworu EO/osobnika związku/kwasu kojowego 10 µl czystego DMSO. /kwas kojowy/DMSO i 1 ml roztworu tyrozyny 0,1 mg/ml. Procent hamowania tyrozynazy mierzono zgodnie z poniższym równaniem: procent hamowania=∆A (kontrola) − ∆A (próbka) / ∆A (kontrola) × 100,∆A (kontrola) lub (próbka) {{ 33}} A475 (kontrola) lub (próbka) − A475 (kontrola ślepa) lub (próbka ślepa).

3.3. Chromatografia kolumnowa błyskowa

Frakcjonowanie EO przeprowadzono w systemie szybkiej chromatografii kolumnowej PuriFlash450 firmy Sepachrom (Rho, Mediolan, Włochy), wyposażonym zarówno w detektory UV, jak i ELSD. Ilość frakcjonowanego EO: 900,0 mg. Faza stacjonarna: sferyczne cząstki żelu krzemionkowego, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) pochodziły z Sepachrom; faza ruchoma: eter naftowy (A) i octan etylu (B); szybkość przepływu 25 ml/min. Elucję gradientem liniowym przyjęto od 100 procent A do 80 procent A i 20 procent B przez 20 min.

3.4. Warunki analizy

Roztwory EO i ich odpowiednie frakcje przygotowano w cykloheksanie o stężeniu 5,0 mg/ml i analizowano metodą GC-MS. Cytral, cytronellal, -myrcen i limonen oznaczono ilościowo w każdym EO i odpowiednich izolowanych frakcjach przy użyciu metody kalibracji zewnętrznego standardu. Odpowiednie poziomy kalibracyjne przygotowano w cykloheksanie i analizowano metodą GC-MS. Tridekan (C13) 1.0 mg/ml zastosowano jako wewnętrzny standard do normalizacji sygnałów analitu. Tabela 2 podsumowuje rozważany zakres stężeń dla każdego oznaczanego ilościowo związku.

Analizy GC-MS przeprowadzono przy użyciu wielofunkcyjnego próbnika Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Niemcy) zainstalowanego na Agilent 6890 N GC sprzężonym z 5975 MSD i wyposażonym w ChemStation Version E. 02.02.1431 system przetwarzania danych (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA). Warunki GC: temperatura wtryskiwacza: 250 C; tryb wtrysku: dzielony; stosunek: 1/20; gaz nośny: hel; stałe natężenie przepływu: 1 ml/min; kolumny: Mega5 (95% polidimetylosiloksan, 5% fenyl) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, długość 25 m, z MEGA (Legnano, Włochy). Program temperatury: 50◦C//3◦C/min//180◦C//10◦C/min//250◦C (5 min). Warunki MSD: MS w trybie EI (70 eV); zakres skanowania: 35 do 350 amu; czas przebywania 40 ms; temperatura źródła jonów: 230 ◦C; temperatura kwadrupolu: 150 ◦C; temperatura linii przesyłowej: 280 ◦C. Markery EO zidentyfikowano porównując zarówno ich liniowe wskaźniki retencji (IT), obliczone względem mieszaniny węglowodorów C9-C25, jak i ich widma masowe z wartościami autentycznych próbek lub z dostępnych w handlu bibliotek widm masowych (Adams, 2007). Analizy chiralne EO przeprowadzono, przyjmując te same warunki analizy na 2,3-di-O-metylo-6-Ot-butylodimetylosililie- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, długość 25 m od MEGA. Programy temperaturowe: 40◦C (1 min)//2◦C/min//220◦C (5 min).

Analizy GC-FID przeprowadzono na tym samym instrumencie. Warunki GC: temperatura wtryskiwacza: 250 ◦C; tryb wtrysku: dzielony; stosunek: 1/20; gaz nośny: wodór; szybkość przepływu: 1 ml/min. Programy temperaturowe: 40◦C (1 min)//2◦C/min//220◦C (5 min).

4. Wnioski

Celem tego badania było (1) kompleksowe zbadanie grzyba in vitrotyrozynazahamujące działanie EO Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis i Verbena officinalis oraz (2) ustalenie, czy ich aktywność biologiczna jest przypisana wyłącznie zawartości cytralu, czy też istnieją dodatkowe bioaktywne monoterpeny, które przyczyniają się do badanej aktywności biologicznej przy użyciu podejście oparte na bioanalizie opartej na frakcjonowaniu. Badanie to wykazało, że w EO L. cubeba i V. officinalis β-mircen przyczynia się do aktywności hamującej EO pomimo jego niewielkiej ilości i wykazano, że ma większą siłę hamowania cytralu. Drugim ważnym odkryciem było to, że (plus)-cytronellal wzmocniony cytralemtyrozynazasiła hamująca, potencjalnie interakcja viasynergistyczna, ponieważ sama nie wykazywała żadnej aktywności. To ostatnie odkrycie wyjaśnia, dlaczego w EO M. officinalis, które zawierają znikome ilości (plus)-cytronellalu, aktywność hamująca była zgodna z zawartością cytralu, podczas gdy przeciwnie było w przypadku EO M. officinalis o stosunkowo wysokiej (plus) obfitości cytronelli. chociaż nadal potrzebne są dalsze badania, aby dokładnie określić rodzaj interakcji zachodzących pomiędzy -myrcenem a cytralem oraz pomiędzy cytronellalem a cytralem oraz aby ocenić hamujące działanie tych EO i poszczególnych związków na człowiekatyrozynaza, wyniki tego badania mogą pomóc w racjonalnym projektowaniu mieszanin EO lub wzbogaconych EO, które poprawiają ich skuteczność biologiczną i zwiększają ich potencjał jako adiuwantów w leczeniu przebarwień.

Bibliografia

1. Pilaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Środki wybielające skórę: perspektywa chemii medycznej inhibitorów tyrozynazy.J. Enzym. Hamowanie Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [Odn.]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Przegląd środków wybielających skórę z wglądem w nielegalny rynek kosmetyczny w Europie. J. Eur. Acad. Dermatol. Wenerol. 2016, 30, 943-950. [Odsyłacz] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Charakterystyka podejrzeń o nielegalne kosmetyki wybielające skórę. J. Pharm. Biomed. Analny. 2014, 90, 85–91. [Odsyłacz] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flawonole z kwiatu szafranu: Aktywność i mechanizm hamowania tyrozynazy. J. Rolnictwo. Food Chem.1999, 47, 4121-4125. [Odn.]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Skład chemiczny i działanie hamujące tyrozynazę olejku eterycznego Cinnamomum cassia. Nerw. Stadnina. 2013, 54, 2–8. [Odn.]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Działanie tyrozynazy onorto-podstawionych fenoli: Możliwy wpływ na brązowienie i melanogenezę. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 2012, 60, 6447–6453. [Odn.]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Inhibitory tyrozynazy z kminku. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 1998, 46, 5338-5341. [Odn.]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tyrozynaza hamująca aktywność olejków eterycznych cytrusów. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 2006,54, 2309-2313. [Odn.]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. Bioaktywności in vitro olejków eterycznych stosowanych do zwalczania trądziku. wewn. J. Aromat. 2006, 16, 43-49. [Odn.]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biologiczne właściwości cytralu i jego potencjalne działanie ochronne przed cytotoksycznością wywoływaną przez aspirynę w komórkach IEC-6. Biomed. Farmakotera. 2017, 87, 653-660. [Odn.]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Nie, JH; Fuj, DY; Hong, JT Hamujący wpływ cytralu na wytwarzanie NO przez supresję ekspresji iNOS i aktywację NF-κB w komórkach RAW264.7. Łuk. Farmacja Res. 2008, 31, 342-349. [Odn.]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopfa, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Wpływ olejku eterycznego Lippia alba (Mill.) NE Brown i jego głównych składników, cytralu i limonenu, na mięsień tchawiczo-gładki szczurów. Biotechnologia. Rep. 2018, 17, 31-34. [Odsyłacz] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, ÁB; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopfa, MR; Barbosa, R. Tokolityczna aktywność olejku eterycznego Lippia alba i jego głównych składników, cytralu i limonenu, na wyizolowaną macicę szczurów. Chem. Biol. Oddziaływać. 2019, 297, 155-159. [Odn.]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopfa, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Vasorelastyczny efekt olejku eterycznego Lippia alba i jego głównego składnika, cytralu, na kurczliwość izolowanej aorty szczura. Biomed. Farmakotera. 2018, 108, 792–798. [Odsyłacz] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopfa, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Olejek eteryczny z Lippia alba i jego główny składnik cytral blokują pobudliwość nerwów kulszowych szczura. Braz. J. Med.Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [Odsyłacz] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Potencjalne zastosowanie kosmetyczne olejku eterycznego pozyskiwanego z owoców Litsea cubeba z Chin. J. Niezbędne. Olej Res. 2013, 25, 112-119. [Odn.]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khana, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Obszerny przegląd dotyczący inhibitorów tyrozynazy. J. Enzym. Hamowanie Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [Odn.]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Analiza ilościowa olejków eterycznych: zadanie złożone. Aromat Fragr. J. 2008, 23, 382-391. [Odn.]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Olejki eteryczne i substancje lotne: Przygotowanie i analiza próbek. Recenzja. Smak Fragr. J. 2010, 25, 282-290. [Odn.]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Ocena zmienności cech morfologicznych i chemicznych wybranych genotypów melisy lekarskiej (Melissa officinalis L.). Ind. Uprawy Prod. 2013, 49, 515–520. [Odn.]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Aktywność hamująca tyrozynazę związków smakowych oliwy z oliwek. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 1999, 47, 4574–4578. [Odsyłacz] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Skład chemiczny i przeciwmelanogenny potencjał różnych olejków eterycznych. Aromat Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [Odn.]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Hamujący wpływ olejku cytrynowego na aktywność tyrozynazy grzybowej in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97-105. [Odn.]

24. Rada Europy. Farmakopea Europejska, wyd. 10; Rada Europy: Strasburg, Francja, 2020; Numer ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; opalenizna, HY; Chen, J.; Wang, M. Charakterystyka inhibitorów tyrozynazy w gałązkach Cudrania tricuspidata i badanie ich zależności struktura-aktywność. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [Odsyłacz] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, Projekt testu enzymatycznego JE do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. W przesiewaniu o wysokiej przepustowości. Metody w Biologii Molekularnej (Metody i Protokoły); Janzen, WP, Paul, B., wyd.; Humana Press: Clifton, NJ, USA, 2009; Tom 565, s. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Podstawy testów enzymatycznych dla HTS. W Podręczniku Prowadzenia Testu; Markossian S., Sittampalam S., Grossman A., wyd.; Eli Lilly & Company oraz NationalCenter for Advanced Translational Sciences: Bethesda, MD, USA, 2004