Wyraźne obrazowanie i określanie ilościowe nerek w 3D

edmund.chen@wecistanche.com

Przez dziesięciolecia pomiarynerkamikroanatomia z wykorzystaniem 2-przekrojów wymiarowych dostarczyła nam szczegółowej wiedzy na temat nerka morfologia w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Jednak szybki rozwój metod oczyszczania tkanek w ostatnich latach w połączeniu z rozwojem nowych 3-wymiarowych technik obrazowania dostarczył nowych informacji na tematnerkastruktura i funkcja. W tym artykule przeglądowym opisano szereg nowatorskich spostrzeżeń na temat:nerkarozwój i choroby uzyskane niedawno przy użyciu tych nowych podejść metodologicznych. Na przykład w rozwijającym sięnerkapodejścia te dostarczyły nowych informacji na temat morfogenezy rozgałęzień moczowodów, proliferacji i zaangażowania komórek progenitorowych nefronu, interakcji między komórkami końcówki moczowodu a komórkami progenitorowymi nefronu oraz ustalenia segmentacji nefronu. W całej dorosłej myszynerki, oczyszczanie tkanek w połączeniu z mikroskopią w świetle arkuszowym może zobrazować i określić ilościowo całkowitą liczbę kłębuszków, co jest ważnym przełomem w tej dziedzinie. Podobne podejścia dostarczyły nowych informacji na temat struktury unerwienia i unerwienia nerkowego, przebudowy kanalików śródmiąższowych, utraty i przerostu podocytów, tworzenia torbieli, ewolucji półksiężyców komórkowych oraz struktury kłębuszkowej bariery filtracyjnej. O wiele więcej postępów w zrozumieniunerkamożna się spodziewać biologii i patologii, ponieważ dodatkowe techniki oczyszczania i obrazowania są opracowywane i przyjmowane przez większą liczbę badaczy.

Słowa kluczowe:obrazowanie 3D; kłębuszki; rozwój nerek; nefropatologia; oczyszczanie tkanek; kanaliki; nerkowy

CISTANCHE POPRAWI CZYNNOŚĆ NEREK/NEREK

Całkowita liczba nefronów u każdego normalnego człowiekanerkawaha się od około 200,000 do ponad 2 milionów, 1 średnio około 1 miliona. Te nefrony, jak również inne składnikinerkaw tym przewody zbiorcze, naczynia krwionośne, tkanki śródmiąższowe i włókna nerwowe są ułożone z wyjątkową precyzją mikroanatomiczną. 2 Ten precyzyjny wzór stanowi podstawę normalnegofunkcja nerkii zdrowie, które może być poważnie zaburzone, gdy architektura tkanki jest zmieniona z powodu przerostu lub skurczu kłębuszków lub kanalików nerkowych, utraty nefronów, wad wrodzonych, rozrzedzenia naczyń i zwłóknienia śródmiąższowego. Szereg podejść do obrazowania przyczynił się do naszego kompleksowego zrozumienianerkamikroanatomia w okresie rozwoju oraz u zdrowej i chorej osoby dorosłejnerka. W większości przypadków zrozumienie to pochodzi z analizy 2-wymiarowych (2D) przekrojów, niezależnie od tego, czy są to przekroje fizyczne mikroskopu świetlnego lub elektronowego, czy też przekroje konfokalne optyczne. Ocena ilościowa tej mikroanatomii opierała się głównie na analizach stereologicznych przekrojów, które dostarczyły oszacowań liczby, długości, pola powierzchni i objętości kłębuszków nerkowych, kanalików, naczyń, śródmiąższowych i ich komponentów komórkowych. 3,4 Do niedawna wizualizacja 3DnerkaMikrostruktura ograniczała się w dużej mierze do mikroskopii konfokalnej, która umożliwia cięcie optyczne i rekonstrukcję 3D do głębokości od 50 do 80 m. Niestety, właściwości refrakcyjne składników białkowych i lipidowych w tkance rozpraszają światło i drastycznie obniżają jakość obrazu wraz ze wzrostem głębokości. W ostatnich latach opracowano szereg metod oczyszczania w celu usunięcia zawartości lipidów i pigmentów z tkanki oraz dopasowania właściwości refrakcyjnych tkanki i środka mocującego, aby uczynić tkankę przezroczystą. 5 Metody oczyszczania mają różną złożoność, od inkubacji tkanek w różnych roztworach w ciągu kilku godzin po rozbudowane procedury z wykorzystaniem niestandardowego sprzętu elektrochemicznego. Czytelników kierujemy do ostatnich przeglądów 5,6, gdzie znajduje się szczegółowy przegląd aktualnych metod oraz artykułów cytowanych w niniejszym dokumencie, dotyczących konkretnych metod i przypadków użycia.

Struktury subkomórkowe i całe populacje komórek można rozdzielić w oczyszczonych całych narządach lub grubych odcinkach. Dokładne obrazowanie funkcji w oczyszczonej tkance wymaga specjalistycznych mikroskopów i przetwarzania obrazu do przechwytywania i rekonstrukcji danych wolumetrycznych z próbek, które mogą mieć wielkość od setek mikronów do centymetrów. Mikroskopy konfokalne ze skanowaniem punktowym i wirującym dyskiem zostały skutecznie wykorzystane do obrazowania cech w obrębie wyczyszczonychnerkatkanka, ale cierpi na zmniejszoną rozdzielczość w osi Z i postępującą redukcję intensywności fluorescencji na głębokości ze względu na pojedynczą oś oświetlenia i obrazowania. Techniki mikroskopii świetlnej są szczególnie odpowiednie do obrazowania oczyszczonych tkanek, ponieważ umożliwiają szybkie pozyskiwanie dużych objętości 3D i mogą obejmować oświetlenie i obrazowanie pod różnymi kątami. Optyczna tomografia projekcyjna to kolejne podejście, które obejmuje obrazowanie wielokątowe i rekonstrukcję cyfrową w celu uzyskania danych, w których osie X, Y i Z każdego woksela mają tę samą rozdzielczość. Niezależnie od konkretnego podejścia, oczyszczanie tkanek i obrazowanie całego mocowania zapewniają nową możliwość zbadania niezbadanych mikrośrodowisk komórkowych i struktury tkanek wyższego rzędu. W tej recenzji przedstawiamy kilka nowych spostrzeżeń na tematnerkarozwój, dorosłynerkastruktury i patologii, które wynikają z oczyszczania tkanek, a następnie analizy ilościowej 3D.

Nowe spojrzenie na rozwój nerekDziesięciolecia profilowania ekspresji genów i badań knockout doprowadziły do ​​szczegółowego zrozumienia typów komórek, sieci regulatorowych genów i szlaków sygnałowych, które kontrolują ssakinerkarozwój. Ta wiedza przyczyniła się do diagnozy chorób wrodzonych i umożliwiła produkcjęnerkatypy komórek z pluripotencjalnych komórek macierzystych. 7 Jednak wielkość, nieprzezroczystość i złożonośćnerkaprzedstawili istotną barierę dla precyzyjnego pomiaru morfogenezy tego narządu oraz trójwymiarowego rozmieszczenia w nim komórek i białek. Zastosowanie oczyszczania tkanek i obrazowania wieloskalowego wnerkaumożliwiła wizualizację i analizę ilościową morfogenezy rozgałęzień moczowodów, populacji komórek progenitorowych i wyposażenia nefronowego w nienaruszonych narządach (ryc. 1). 8 Podejścia te stanowią podstawę nowej zdolności precyzyjnego fenotypowania i otwierają możliwości analizy komórkowych i molekularnych czynnikównerkarozwój i choroba wrodzona.

Obrazowanie i analiza morfogenezy rozgałęzień w 3D.Założenie drzewa moczowodowego jest cechą definiującąnerkarozwoju i został szeroko zbadany przy użyciu genetyki myszy i spłaszczonynerkaeksplantuj kultury. Jednak zrozumienie, w jaki sposób poszczególne geny przyczyniają się do wzrostu, formy i wzorcowania tej struktury rozgałęzionego przewodu nabłonkowego in vivo, wymagało zdolności do obrazowania i analizowania tej złożonej sieci w szerokim zakresie wielkości próbek. Krótka i in. 8 rozwiązało te problemy za pomocą immunofluorescencji całego montażu, oczyszczania na bazie rozpuszczalnika (benzoesan benzylu alkoholu benzylowego) i obrazowania całych narządów za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej. Stosując to podejście do przechwytywania migawek 3D od początku do połowynerkaZespół opracował niestandardowe oprogramowanie do analizy, aby uzyskać bezprecedensowe szczegóły dotyczące drzewa moczowodu, w tym liczbę końcówek, kąty i długość gałęzi, objętość gałęzi oraz liczbę pokoleń rozgałęzień z nienaruszonych drzew moczowodów (ryc. 1c i d). 8 Początkowo używane do scharakteryzowania i identyfikacji nowych aspektów rozgałęzień nerkowych, 9,10 trwają prace nad zdefiniowaniem zasad i kluczowych regulatorów, które rządzą rozgałęzieniem nerkowym in vivo. 1

Łączenie dynamiki progenitorów z morfogenezą narządów z obrazowaniem wieloskalowym.Interakcje molekularne między komórkami ureterict i komórkami progenitorowymi nefronów odgrywają główną rolę w ustalaniu dopełnienia nefronów, które ułatwiająfunkcja nerkiw dorosłym życiu. Nieindukowane prekursory nefronu wytwarzają czynniki, które promująnerkawzrost poprzez rozgałęzienie moczowodu, podczas gdy przestrzennie ograniczone sygnały w końcówce moczowodu zarówno utrzymują stan progenitorowy nefronu, jak i indukują podzbiór tych progenitorów do różnicowania się we wczesny nefron. Te interakcje napędzają cykl rozgałęzień i indukcji nefronu, który ustaje w momencie narodzin, kiedy pozostałe progenitory nefronu ulegają różnicowaniu. Przed zastosowaniem metod oczyszczania tkanek, nasze zrozumienie dynamikinerkamorfogeneza i względna liczebność populacji komórek progenitorowych w czasie były poważnie ograniczone. Zmieniło się to wraz z rozwojem wieloskalowych metod obrazowania wykorzystujących rozszerzone protokoły immunofluorescencyjne, oczyszczanie tkanek i metody obrazowania w celu oceny ilościowejnerkarozwój na poziomie komórkowym (konfokalnym) i całego narządu (optyczna tomografia projekcyjna, arkusz świetlny). 9,10 Okazało się, że stawkinerkawzrost jest bardzo zróżnicowany, przy czym początkowo szybkie tempo rozgałęziania i proliferacji spada w fazach, które korelują ze zmniejszeniem liczby komórek progenitorowych w niszy nefrogennej. 10 Trójwymiarowe obrazowanie konfokalne oczyszczonego całego płodu ludzkiegonerki(tydzień 11) lub próbki znerkakora (tygodnie 11–23) potwierdza, że ​​ten spadek rozmiaru niszy jest zachowany u wszystkich gatunków. 12 Dalsza analiza porównawcza ludzkiej i mysiej niszy nefrogennej w oczyszczonej tkance doprowadziła do nowego modelu rekrutacji opartego na czasie tworzenia nefronu, w którym komórki progenitorowe są stopniowo dodawane do wczesnego nefronu i przyjmują tożsamość segmentu zgodnie z kolejnością, w jakiej przybywają . 13 W innym badaniu skoncentrowanym na zaangażowaniu komórek progenitorowych nefronów, do jego oceny zastosowano metodę oczyszczania tkanek opartą na hydrożelu (pasywna Clear Lipid-exchanged Acryl-amide-Hybridized Rigid Imaging/Immunobarwienie/Hybrydyzacja in situ [CLARITY] 14 ). zdolność do zatrzymywania fluorescencji endogennego reportera tdTomato. Analiza znakowania tdTomato w oczyszczonej tkance wykazała, że ​​komórki we wczesnej fazie angażowania się nefronu mogą powrócić do stanu prekursora, gdzie wcześniejsze wyniki sugerowały, że zaangażowanie było jednokierunkowe. 15 W ten sposób oczyszczanie tkanek poprawiło naszą wiedzę na temat dynamicznych procesów rozwojowych w różnych łuskach i gatunkach.

Precyzyjne fenotypowanie. Postępy w oczyszczaniu tkanek i analizie ilościowej umożliwiły nowe możliwości precyzyjnego fenotypowania. Statystycznie silne zmiany w rozgałęzieniach i liczbie nefronów zostały zidentyfikowane w mysich modelach z subtelnymi fenotypami, takimi jak Ret þ/? i Six2 þ/? myszy (ryc. 2), które wcześniej sklasyfikowano jako „normalne”. 10,16 Obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości oczyszczonego Wnt11 ?/?nerkizidentyfikowali nowy fenotyp komórkowy, w którym prekursory nefronu wydają się być zdezorganizowane z powodu niezdolności do tworzenia stabilnych połączeń komórkowych z końcówką moczowodu i przedwczesnego różnicowania. 17 Metody te zostały również wykorzystane do ilościowego określenia, w jaki sposób nowe regulatory stanu komórek progenitorowych nefronu, takie jak metylotransferaza 1 DNA, mikroRNA Lin28 i Let7 oraz TSC1nerkarozwój i liczba nefronów. 18–20 Precyzyjne fenotypowanie prawdopodobnie stanie się ważnym narzędziem w naszych wysiłkach mających na celu zrozumienie addytywnego wpływu czynników genetycznych i środowiskowych, które przyczyniają się do niskiej liczby nefronów i predyspozycji do przewlekłychchoroba nerek.

Modelowanie matematycznenerkamorfogeneza. Dane generowane z wyczyszczonego opracowanianerkanapędzają falę matematycznego modelowania opartego na obrazach, które ma na celu ustalenie, w jaki sposób makroskopowa forma i funkcja tkanki powstają w wyniku interakcji molekularnych między populacjami komórek progenitorowych. 11,21-23 Dalsze zastosowanie obrazowania całych narządów w oczyszczonej tkance będzie miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia molekularnych i komórkowych czynników stymulujących modelowanie tkanek 3D i może stanowić klucz do poprawy struktury i dokładności modeli komórek macierzystychnerka.

Morfologia 3D i patologia nerki osoby dorosłejSkomplikowana morfologia osoby dorosłejnerkaogranicza użycie narzędzi morfologicznych 2D, ponieważ mogą one przekazywać niepełne lub mylące postrzeganie struktury 3D. W tym miejscu omawiamy niektóre z ważnych postępów metodologicznych w ostatnich latach, które umożliwiają teraz solidną analizę 3D struktur u osób dorosłychnerka, począwszy od nienaruszonychnerkiaż do elementów kłębuszkowej bariery filtracyjnej (ryc. 3). 2

CISTANCHE POPRAWI NIEWYDOLNOŚĆ NEREK/NEREK

Liczba i rozmiar nefronu.Człowieknerkawykazuje wysoki poziom zmienności wewnątrz- i międzyosobniczej w liczbie i objętości nefronów, co zostało opisane w badaniach autopsyjnych u osób bez jawnychchoroby nerek1,30,31 i wiąże się z zaburzeniami rozwojowymi. Przez dziesięciolecia złotym standardem narzędzia do ilościowego określania liczby nefronów w próbkach eksperymentalnych i ludzkich była metoda rozdzielacza/frakcjonowania, metoda stereologiczna oparta na projektowaniu. 3,4 Chociaż to podejście jest dokładne i precyzyjne, jest również praktyczne, czasochłonne i wymaga znacznego przeszkolenia. Z tego powodu zaproponowano alternatywne podejścia do opracowania wydajnych metod, które mogą zapewnić wysokiej jakości punkty końcowe: 32 na przykład kombinacje metod oczyszczania optycznego, w tym metody hydrofobowe (wcześniej znane jako oparte na rozpuszczalniku), hydrofilowe lub hydrożelowe, z zaawansowanymi mikroskopia świetlna (np. konfokalna, wielofotonowa lub arkusz świetlny).

Zgodnie z naszą wiedzą, pierwszy raport, który łączy optyczną klarowność i lekką mikroskopię arkuszową do analizy liczby i wielkości nefronów, został opublikowany przez Klingberg et al. 24 w przełomowym artykule, w którym przedstawiono wiele ważnych osiągnięć. Po pierwsze, ten raport wprowadził cynamonian etylu, nieszkodliwy rozpuszczalnik, który może zastąpić toksyczne chemikalia, takie jak alkohol benzylowy – benzoesan benzylu, który do tej pory był regularnie używany w protokołach oczyszczania hydrofobowego. Po drugie, badacze przeprowadzili zliczanie nefronów u nienaruszonej myszynerki jan agresywny i progresywny model immunozależnychoroba nerek, identyfikując utratę nefronów w przebiegu choroby. Ponadto wprowadzono znaczące kroki w kierunku skomputeryzowanej automatyzacji algorytmów segmentacji obrazu, zapewniając ścieżkę do znacznej poprawy wydajności. Ostatnio Østergaard i in. 25 przedstawił podobną metodę oczyszczania hydrofobowego połączoną z mikroskopią światłocieniową i zautomatyzowaną segmentacją obrazu, która zapewnia zarówno całkowitą liczbę nefronów, jak i pojedynczą objętość kłębuszków w mysim modelu nefropatii cukrzycowej. Co więcej, badanie to wykazało eleganckie funkcjonalne znakowanie kanalików proksymalnych poprzez wstrzyknięcie albuminy in vivo w celu uwidocznienia połączenia kłębuszkowo-kanalikowego oraz prosty protokół dla histopatologii korelacyjnej w tych samych optycznie oczyszczonych próbkach. Ten raport pokazuje elastyczność tych protokołów, które stają się wielowarstwowymi potokami do kompleksowego profilowania tkanek.

Unaczynienia i unerwienie nerek.Podążanie śladami rozgałęzionych naczyń krwionośnych lub włókien nerwowych u osoby dorosłejnerkajest prawie niemożliwe w konwencjonalnej histologii 2D, ponieważ wielkość narządu i złożoność rozmieszczenia strukturalnego wymagają obszernego i fachowego sekcjonowania seryjnego. Ostatnio Huang i in. 33 opisali kationowy barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni (MHI148-PEI) do specyficznego znakowania naczyń krwionośnych, który można łączyć ze zmodyfikowanym i przyspieszonym protokołem oczyszczania opartym na cynamonianie etylu w celu skrócenia czasu przetwarzania tkanek. Takie podejście otwiera nowe możliwości dla badań naczyniowych wnerka,zwłaszcza gdy wymagane jest obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w 3D. Podobnie Hasegawa i in. 26 wykorzystało koktajle Clear Unobstructed Brain/Body Imaging and Computational analysis (CUBIC) wraz z niestandardowym systemem mikroskopii świetlnej, aby zidentyfikować rozkład unerwienia współczulnego w nienaruszonej nerce myszy. Nerwy współczulne były rozmieszczone głównie wokół tętnic. Po 10 dniach niedokrwienia lub uszkodzenia reperfuzyjnego gęstość unerwienia współczulnego uległa znacznemu zmniejszeniu, co koreluje ze zmniejszonymi poziomami noradrenaliny wtkanka nerkowa. Zmiany te częściowo utrzymywały się 28 dni po początkowym uszkodzeniu, co sugeruje, że ciągłe zmiany współczulne można znaleźć podczas progresji przewlekłegochoroba nerek.

Przebudowa kanalikowo-śródmiąższowa.System kanalików nerkowych jest szczególnie trudny do analizy w 3D. Zawinięta i złożona morfologia stwarza wiele wyzwań dla konwencjonalnych metod opartych na seryjnych przekrojach i standardowej mikroskopii świetlnej. Jednak oczyszczanie optyczne umożliwia analizę nienaruszonych kanalików i otaczającego je mikrośrodowiska. Saritas i in. 34 przeprowadził kombinację oczyszczania optycznego na bazie hydrożelu i hydrofobowego, a następnie zaawansowanej mikroskopii świetlnej i półautomatycznej analizy 3D w celu scharakteryzowania dystalnej przebudowy kanalików wskutek niedoboru potasu w diecie. Badacze ocenili ilościowo hiperplazję kanalików i wykryli wzrost proliferujących komórek w obrębie cewki śródmiąższowej. W badaniu tym wykorzystano wszechstronność zarówno czyszczenia optycznego, jak i

Rysunek 3| Morfometria trójwymiarowa (3D) w nerce osoby dorosłej. (a) Liczenie nefronów w całych nerkach przy użyciu znakowania CD31 komórek śródbłonka. Panel przedstawia rekonstrukcję 3D (po lewej), przekrój optyczny w widoku dwuwymiarowym (2D) (w środku) oraz specjalne obszary przedstawiające pojedyncze kłębuszki w porównaniu między mikroskopią światłocieniową (LSFM) a konfokalną i 2- mikroskopia fotonowa (2P). Zaadaptowano za zgodą American Society of Nephrology, z Journal of American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., tom 28, wydanie 2, 2017; zezwolenie przekazane przez Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Ustalanie rozmiarów kłębuszków z rejestracją przestrzenną — kodowanie kolorami przedstawia rozmiar kłębuszków, gdzie czerwony jest największym obiektem, a różowy najmniejszym. Zaadaptowane za zgodą American Society of Nephrology, z: Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephroopathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., tom 6, wydanie 6 , 2020; pozwolenie przekazane przez Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Śledzenie unaczynienia i unerwienia, obejmujące rekonstrukcję 3D nienaruszonej nerki z immunoznakowaniem nerwów współczulnych (zielony), unaczynienia (magenta) i połączonych (po lewej). Na podstawie Kidney International, tom 96, wydanie 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T i wsp., Kompleksowa analiza trójwymiarowa (CUBIC-kidney) uwidacznia nieprawidłowe nerkowe nerwy współczulne po uszkodzeniu niedokrwiennym/reperfuzyjnym, strony 129–138, Copyright ª 2019, za zgodą Międzynarodowego Towarzystwa Nefrologicznego. 26 (d) Morfometria podocytów w poszczególnych kłębuszkach nerkowych przy użyciu znakowania immunologicznego dla markera p57 specyficznego dla podocytów (zielony) i markera DNA 4 0,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI). Panele pokazują (po lewej) rekonstrukcję 3D i (po prawej) wyrenderowane powierzchnie. Zaadaptowane za zgodą American Society of Nephrology, z Journal of American Society of Nephrology, Validation of a ThreeDimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., tom 27, numer 10, 2016; pozwolenie przekazane przez Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Dynamika komórkowa przy użyciu śledzenia linii, pokazująca podocyty (dalej po lewej), komórki nabłonka ciemieniowego (PEC) tworzące półksiężyce komórkowe w 3D (w środku po lewej), widok 2D inwazji PEC strona kłębuszkowa z uszkodzeniem naczyniowym (pośrodku po prawej) oraz wizualizacja 2D wylotu kanalika (dalej po prawej). Na podstawie Kidney International, tom 96, wydanie 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L i wsp., Nowatorska analiza 3D przy użyciu optycznego oczyszczania tkanek dokumentuje ewolucję szybko postępującego kłębuszkowego zapalenia nerek u myszy, strony 505–516, Copyright ª 2019, International Society of Nefrology, na licencji CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Wizualizacja przesłony szczelinowej w rosnących powiększeniach od lewej do prawej. Na podstawie Kidney International, tom 99, wydanie 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M i wsp., Szybki i prosty protokół oczyszczania i obrzęku do obrazowania 3D nerki in situ w różnych skalach, strony 1010–1020 , Copyright ª 2021, International Society of Nefrology, na licencji CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresemwww.kidney-international.org.

mikroskopia świetlna do wykonywania analizy kanalikowej w nienaruszonych nerkach przy użyciu zatapiania hydrożelu i mikroskopii świetlnej, a także oznaczania ilościowego pojedynczych komórek w skrawkach nerki przy użyciu hydrofobowego oczyszczania i mikroskopii konfokalnej, ponieważ każda kombinacja była lepiej dopasowana do konkretnego pytania badawczego. Tahaei et al. 35, który scharakteryzował dymorfizm płciowy długości dystalnego kanalika krętego, który może determinować jego zdolność do adaptacji do stresu fizjologicznego, oraz Schuh i in. 36, którzy wykazali osiowe różnice w wychwytywaniu liganda kanalików proksymalnych i funkcji endolizosomalnej, podkreślając, że segment S1 jest wysoce wyspecjalizowany w reabsorpcji białek poprzez endocytozę za pośrednictwem receptora. W niedawnym badaniu Blanc i in. 2 przeanalizowali model powstawania torbieli, wykazując, że torbiele rozwijały się tylko w określonych segmentach nefronu, które determinowały ich kształt i były zlokalizowane w sąsiedztwie prawidłowych nierozszerzonych kanalików. Ogólnie rzecz biorąc, mamy obecnie wiele przykładów bezpośredniego zastosowania oczyszczania optycznego do systematycznej analizy przedziału cewkowo-śródmiąższowego.

Utrata i przerost podocytów.Kłębuszki są unikalnym przykładem analizy nienaruszonych jednostek funkcjonalnych w narządzie. W szczególności badania nad ubytkiem podocytów bezpośrednio skorzystały z tych postępów technologicznych, ponieważ metodologie oparte na projektach według złotego standardu wymagają znacznych nakładów czasu i zasobów. 37 Pierwsze narzędzie do morfometrycznej analizy 3D podocytów nienaruszonych kłębuszków mysich połączone immunoznakowanienerkaskrawki przy użyciu zmodyfikowanego protokołu pośredniej immunofluorescencji, hydrofobowego oczyszczania optycznego i mikroskopii konfokalnej, co ułatwiło ilościowe określenie całkowitej liczby podocytów w całych pojedynczych kłębuszkach o znanej objętości. Uważamy, że to podejście jest idealne do badania procesów, które wpływają na określony podzbiór struktur (np. utrata podocytów prowadząca do ogniskowego i segmentowego stwardnienia kłębuszków nerkowych). 27 Tę samą technikę zastosowano później do scharakteryzowania roli hipertrofii podocytów jako odpowiedzi kompensacyjnej po utracie podocytów, mechanizmie, w którym pośredniczy szlak sygnałowy rapamycyny u ssaków. 38 Chociaż te 2 badania koncentrowały się na analizie kłębuszkowych podocytów, ten rurociąg oparty na konwencjonalnym znakowaniu immunologicznym można wykorzystać do scharakteryzowania zmian morfologicznych dowolnego typu komórek w wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Ewolucja półksiężyców komórkowych.Kolejne ważne narzędzie, które musiało zostać pomyślnie zintegrowane z zestawem narzędzi do 3Dnerkamorfometria to śledzenie linii genetycznych. Większość metod czyszczenia optycznego ma tendencję do wywoływania pewnego stopnia wygaszania fluorescencji (który waha się od łagodnego do silnego). 6 Niedawno przedstawiliśmy protokół łączący śledzenie linii, oczyszczanie optyczne i mikroskopię wielofotonową w celu kompleksowej analizy utraty podocytów i aktywacji komórek nabłonka ciemieniowego. 28 W tym badaniu utratę podocytów zidentyfikowano jako cechę doświadczalnego półksiężycowego zapalenia nerek przy użyciu metabolicznego znakowania podocytów wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym. Ewolucję komórkowych półksiężyców uwidoczniono i skwantyfikowano w oparciu o proliferację i migrację komórek nabłonka ciemieniowego, które również zaznaczono wzmocnioną zieloną fluorescencją białka i śledzono w trakcie eksperymentalnego modelu półksiężycowego zapalenia nerek. Analiza nienaruszonych kłębuszków pozwoliła na identyfikację ogniskowej utraty podocytów i powstawania zmian, które postępowały do ​​niedrożności kanalików przez komórki nabłonka ciemieniowego, prowadząc do powstania kłębuszków kanalikowych. To badanie toruje drogę do przyszłych badań złożonych interakcji odpornościowo-nabłonkowych w nienaruszonym stanienerki.

CISTANCHE POPRAWI DIALIZACJĘ NEREK/NEREK

Kłębuszkowa bariera filtracyjna.Ważnym narzędziem diagnostycznym do rutynowej oceny chorób kłębuszków nerkowych jest ultrastrukturalna analiza biopsji nerki za pomocą mikroskopii elektronowej. Alternatywę dla mikroskopii elektronowej można znaleźć w dziedzinie mikroskopii ekspansyjnej, która z definicji ma na celu zwiększenie rozdzielczości optycznej poprzez zwiększenie wymiarów tkanek. Z biegiem lat Unnersjo-Jess i in. 39,40 dostarczyło wiele protokołów do wizualizacji struktur w nanoskali wnerka.Niedawno badacze ci donieśli o szybkiej i prostej procedurze wizualizacji 3Dnerkamorfologia, łącząca koncepcje oczyszczania optycznego i ekspansji tkanek w celu rozwiązania struktur w nanoskali przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. 29 Protokół ten zastosowano do wizualizacji i ilościowej oceny wielu cech patologicznych u myszy i ludzinerkabiopsje obejmujące zatarcie wyrostka nerkowego, zmiany błony podstawnej kłębuszków, długość przepony szczelinowej, złogi IgG i klasyczne cechy patologiczne (np. stwardnienie kłębuszków nerkowych, zwłóknienie kanalików śródmiąższowych i atrofia kanalików). Podsumowując, metoda ta umożliwia wieloskalową wizualizację i ocenę ilościową patologii nerek przy użyciu prostej metody i dostępnych narzędzi analizy obrazu. Skalowalność i wdrożenie tego podejścia w praktyce klinicznej będzie prawdopodobnie zdeterminowane potrzebą zaawansowanego sprzętu do mikroskopii świetlnej oraz opracowania zautomatyzowanych narzędzi do analizy obrazu.

Wniosek

Obecne spektrum metod oczyszczania tkanek obejmuje proste techniki, które można wdrożyć w większości laboratoriów w celu poprawy obrazowania 3D na powszechnie dostępnych mikroskopach. Ponieważ możliwości, jakie stwarzają te nowe podejścia, stają się oczywiste, przewidujemy szersze wykorzystanie specjalistycznych systemów mikroskopowych do skutecznego obrazowania oczyszczonej tkanki w wysokiej rozdzielczości oraz opracowanie dostosowanych do potrzeb badań i procedur klinicznych, aby odpowiedzieć na konkretne pytania. Dziedzina neuronauki służyła jako poligon doświadczalny dla sprawdzonych metod i zastosowań obrazowania tkanek. W tym kontekście opracowano projekty zautomatyzowanej analizy obrazu, nowatorskie podejścia do badania łączności komórkowej oraz ogólnotkankowe atlasy ekspresji genów i białek. Jest prawdopodobne, że podobne podejścia przyniosą nowy wgląd w anatomię komórkową i współzależność populacji komórek u osób rozwijających się i dorosłych.nerka.

Praktyczne ograniczenia tych postępów obejmują koszt sprzętu do obrazowania oraz trudności w obsłudze, przechowywaniu i analizowaniu dużych zbiorów danych. Inne ograniczenia wynikają z braku powtarzalności barwienia tkanek, na które zmiennie wpływają warunki utrwalania i znakowanie przeciwciałem. W rezultacie istnieje potrzeba krytycznej oceny nowych analiz 3D i porównania ich z ustalonymi metodami. Pomimo imponujących postępów w ocenienerkarozwój i dorosłynerkastruktury i choroby podkreślone w tym przeglądzie, wierzymy, że najlepsze w usuwaniu tkanek i obrazowaniu 3D dopiero nadejdą i prawdopodobnie będzie ekscytującym obszarem wzrostu dlanerkabadań przez dziesięciolecia.