Klonowanie, identyfikacja funkcjonalna i analiza ekspresji syntazy chalkonu z Cistanche Tubulosa

Streszczenie: Cel

Aby zbadać funkcjęSyntaza chalkonu z Cistanche tubulosaoraz wzór ekspresji genu CtCHS w kwiatach białych, czerwonych i fioletowych.

MetodyGen CtCHS sklonowano metodą RT-PCR i przeprowadzono analizę bioinformatyczną. Plazmid pET-28a-CtCHS przeniesiono do Escherichia coli w celu indukowania ekspresji białka metodą IPTG. Rekombinowane białko CtCHS inkubowano z substratami p-kumaroilo-CoA i malonylo-CoA, a produkty wykrywano za pomocą HPLC i MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS przeniesiono do protoplastu Arabidopsis thaliana w celu obserwacji subkomórkowej lokalizacji białka CtCHS. Wzorzec ekspresji genu CtCHS w kwiatach C. tubulosa w trzech kolorach wykryto metodą qRT-PCR.

WynikiSklonowano gen CtCHS. Długość otwartej ramki odczytu (ORF) wynosiła 1173 bp i kodowała 390 aminokwasów, a masa cząsteczkowa białka wynosiła 42 8000.

ORGANICZNY EKSTRAKT Z CISTANCHE Z 30% ECHINAKOZYDEM I 12% AKTEOZYDEM

CtCHS zawierał reszty katalityczne Cys164, His303, Asn336, które były konserwowane w syntazie chalkonu. Białko CtCHS poddano ekspresji w E. coli i oczyszczono w celu uzyskania rekombinowanego białka. Białko CtCHS może katalizować p-kumaroilo-CoA i malonylo-CoA z wytworzeniem chalkonu naringeniny. Białko CtCHS zlokalizowane było głównie w cytoplazmie. Gen CtCHS ulegał silnej ekspresji w kwiatach fioletowych i czerwonych, a względny poziom ekspresji był odpowiednio 8,44 i 3,21 razy wyższy niż w kwiatach białych.

Wnioski Z kwiatu C. tubulosa sklonowano gen CtCHS i poddano ekspresji białko. Białko CtCHS posiada funkcję syntazy chalkonu, a ekspresja genu CtCHS jest wyższa w kwiatach ciemniejszych, co wskazuje, że gen CtCHS może regulować barwę kwiatów C. tubulosa, co stanowi podstawę do dalszych badań nad mechanizmem regulacji barwy kwiatów C. . rurkowaty.

słowa kluczowe: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; syntaza chalkonu; analiza aktywności enzymatycznej; lokalizacja subkomórkowa; analiza wyrażeń

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT to roślina z rodzaju Pyral, która naturalnie występuje w południowym Xinjiangu [1] w obszarze Hetian w Xinjiangu [2]. Kwiaty fajki mają wysoką wartość leczniczą. Łodygi mięsa są jednym ze źródeł wersji „2020”Farmakopea chińska„. [3] Wzrosły badania nad łodygami mięsa kordonusowego kwiatów fajkowych, ale stosunkowo niewiele badań biologicznych dotyczy ich kwiatów. Okres kwitnienia kwiatów fajkowych przypada od kwietnia do maja [4], głównie. Istnieją trzy kolory bieli , czerwone i fioletowe Kwiaty fajkowe są bogate w kolory, ale nie opisano mechanizmu regulacji ich koloru. Zajęcia są związane z rodzajem, zawartością, zawartością i rozmieszczeniem struktury tkanki płatków, pigmentu i regulacją czynników środowiskowych i czynniki genetyczne [5]. Pigmenty w kwiatach roślin obejmują głównie trzy kategorie: flawonoidy, karoten i beetynę. Barwa, najszerszy zakres barw [7]. Rodzaje i zawartość flawonoidów wpływają na barwę wielu roślin jako trzy odmiany Paeonia Lactiflora Pall.

Występuje jako biały, a główny kolor koloru zawiera kolor czerwony, a piękna kompetencja sprawia, że ​​kwiaty występują w postaci fioletowo-czerwonej [8]. Kolor kwiatów jest ważną cechą wielu roślin ozdobnych, a także kluczowym czynnikiem przyciągającym różowe owady [9]. Badania wykazały, że jest ona przekazywana w dół. Największą częstotliwością wizyt owadów jest ciemnofioletowa roślina cistanche [10]. W przypadku badań biologicznych nad syntetycznymi badaniami genetycznymi cistanoidów w kwiatach cistanozaura rurkowego sprzyja wyjaśnienie mechanizmu kontroli barwienia kordonu kwiatowego rurkowego, zapewniając teoretyczne podstawy do poprawy koloru technologii inżynierii genetycznej, promując jego bogatsze kolory, zwiększając oglądalność, poszerzanie zakresu zastosowań.

Szlak biosyntezyflawonoidyzaczyna się odszlak fenylopropanoidowy. Fenyloalanina jest najpierw przekształcana w kwas cynamonowy pod działaniem amonialazy fenyloalaniny (PAL), a kwas cynamonowy jest 4-hydroksylowany przez kwas cynamonowy. Enzym (-4-hydroksylaza kwasu cynamonowego, C4H) i 4-ligaza kumarynianowo-koenzymu A (4-ligaza koenzymu A kumarynianu, 4CL) katalizują reakcję, w wyniku której powstaje 4-kumaroilo-CoA [11]. Jedna cząsteczka 4-kumaroilo-CoA i trzy cząsteczki malonylo-CoA są katalizowane przez syntazę chalkonu (CHS) w celu wytworzenia chalkonu naringeniny, który mazwiązki flawonoidowePodstawowy szkielet izomerazy chalkonu,-3-hydroksylazy flawanonu, 4-reduktazy dihydroflawonolu itp. wytwarza różnorodne flawonoidy, takie jak izoflawony, flawonole, antocyjany itp. [12]. Jako kluczowy enzym szlaku biosyntezy flawonoidów, CHS reguluje zawartość flawonoidów w roślinach, a także odgrywa ważną rolę w regulacji barwy kwiatów roślin [13]. Na przykład potranskrypcyjne wyciszanie genów Gentiana scabra Bunge CHS może hamować biosyntezę antocyjanów i powodować specyficzne wybielanie płatków korony [14]. Wyciszanie genu CHS u Actinidia eriantha Benth. CHS zmniejsza zawartość antocyjanów w płatkach i powoduje, że kolor czerwonych płatków staje się jaśniejszy [15]. Dlatego w tym badaniu sklonowano gen CtCHS z kwiatów Cistanche Deserticola i przeprowadzono na nim analizę bioinformatyczną, ekspresję i oczyszczanie prokariotów, analizę aktywności enzymatycznej, analizę lokalizacji subkomórkowej i analizę ekspresji w trzech kolorach kwiatów w celu zbadania funkcji CtCHS Do wstępnego zbadania związku między CtCHS a kolorem kwiatów Cistanche Deserticola wykorzystano białko i wzór ekspresji genu CtCHS, co położyło podwaliny pod badania mechanizmu regulacyjnego koloru kwiatów Cistanche Deserticola.

1 Materiały i instrumenty

1.1 Materiały

Kwiaty Cistanche tuberosa zebrano w hrabstwie Yutian w prefekturze Hotan w Xinjiang w maju 2018 r. Podczas pobierania próbek przestrzegano zasady losowości i wybrano kwiaty Cistanche tuberosa o dobrym stanie fizjologicznym i stałej wysokości rośliny. Pobrano trzy szczepy Cistanche desericola o trzech kolorach kwiatów: białym, czerwonym i fioletowym i zidentyfikowano je jako Cistanche tubulosa (Schenk) Wight przez profesora Tu Pengfei z Szkoły Farmacji Uniwersytetu Pekińskiego. Szybko zamrożono je w ciekłym azocie, przechowywano w suchym lodzie i przewieziono do Pekinu. Chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5 zakupiono od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., a chemicznie kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3) zakupiono od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Wektor zakupiono od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonylo-CoA zakupiono od Sigma Company, 4-kumaroilo-CoA, naringenina -chalkon zakupiono od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., a naringeninę zakupiono od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumenty

Spektrofotometr Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, USA); gradientowy instrument PCR (Eppendorf Company, Niemcy); Instrument do ilościowej fluorescencyjnej PCR CFX 96, urządzenie do obrazowania żelu UVP, urządzenie do elektroforezy żelowej, urządzenie do elektroforezy białek (BioRad Company, USA) ;EnSpire

Czytnik mikropłytek (PerkinElmer Company, USA); inkubator o stałej temperaturze (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oscylator pełnotemperaturowy o dużej pojemności DHZ-D (Fabryka Sprzętu Eksperymentalnego Taicang); THZ-82Oscylator stałej temperatury w kąpieli wodnej (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Ultra czysty stół warsztatowy AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); wysokociśnieniowy sterylizator parowy (TOMY Company, Japonia); przyrząd do czystej wody Milli Q (Millipore, Stany Zjednoczone); LC-20Wysokowydajny chromatograf w fazie ciekłej (Shimadzu Company, Japonia); Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, USA); Laserowy mikroskop konfokalny FV1200 (Olympus Company, Japonia).

2 Metody eksperymentalne

2.1 Ekstrakcja RNA i synteza cDNA. Kwiaty Cistanche Deserticola zmielono w ciekłym azocie, a następnie poddano testowi ekstrakcji RNA.

Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu (Norgen, Cat 17200), stężenie i jakość RNA oznaczono za pomocą NanoDrop 2000C, a próbki RNA o stosunku A260/A280 pomiędzy 1,8 a 2,1 wybrano do syntezy cDNA poprzez odwrotną transkrypcję. Do odwrotnej transkrypcji kwalifikowanego całkowitego RNA na cDNA użyto odwrotnej transkryptazy M-MLV (Promega, M170B). Operacje doświadczalne przeprowadzono zgodnie z instrukcją.

2.2 Klonowanie genu CtCHS

Na podstawie danych dotyczących transkryptomu kwiatu Cistanche Deserticola z naszej grupy badawczej [16] przeszukano CtCHS z pełną otwartą ramką odczytu i wykorzystano oprogramowanie SnapGene do zaprojektowania specyficznych starterów w oparciu o sekwencję genu (Tabela 1). Amplifikację PCR przeprowadzono stosując cDNA z kwiatu Cistanche Deserticola jako matrycę. System amplifikacji składał się z 2×Phanta Max Buffer 25 µl, dNTP Mix (10 mmol/l) 1 µl, starterów poprzedzających i dalszych (10 µmol/l) po 2 µl, cDNA 2 µl, Phanta Max Super-Fidelity

Polimeraza DNA 1 μL, ddH2O 17 μL. Warunki reakcji były następujące: wstępna denaturacja w temperaturze 95 stopni przez 3 minuty; 25 cykli denaturacji w 95 stopniach przez 15 s, wygrzewanie w 55 stopniach przez 15 s i wydłużanie w 72 stopniach przez 1 min; i przedłużenie reakcji w 72 stopniach przez 5 min. Produkt PCR wykrywano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym, a do odzyskiwania żelu użyto zestawu do oczyszczania DNA (Novizan, Cat DC301-01), a następnie odzyskany DNA oczyszczono za pomocą zestawu do szybkiego klonowania (Novizan, Cat DC301-01) C601-01). Fragment DNA zligowano z wektorem pCE2 TA/Blunt-Zero, transformowano do kompetentnych komórek Escherichia coli DH5 i po całonocnej hodowli w temperaturze 37°C wybrano pojedyncze szczepy klonów i wysłano je do firmy w celu sekwencjonowania.

Tabela 1 Sekwencje starterów

2.3 Analiza bioinformatyczna

Użyj oprogramowania internetowego ProtParam do analizy właściwości fizycznych i chemicznych białek; użyj narzędzia internetowego Prot Scale do analizy hydrofilowości/hydrofobowości białek; wykorzystać narzędzie internetowe SOPMA do przewidywania drugorzędowej struktury białek; używać oprogramowania analitycznego online SWISS-MODEL do przewidywania struktury trzeciorzędowej białek; skorzystaj z oprogramowania online TMHMM Przewiduj transbłonową strukturę białka; użyć oprogramowania DNAMAN do porównania homologii CtCHS z sekwencjami aminokwasowymi CHS innych gatunków; użyj programu MEGA-X do skonstruowania drzewa filogenetycznego, stosując łączenie sąsiadów (NJ) i korektę Poissona. Odległość ewolucyjna jest obliczana metodą Bootstrap, a liczba powtórzeń Bootstrap wynosi 1000 razy.

Do dalszej detekcji zastosowano UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Warunki fazy ciekłej były następujące: kolumna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), temperatura kolumny 40 stopnia, naringenina , chalkonu i naringeniny. Objętość substancji kontrolnej wynosi 4 µl, a objętość produktu reakcji enzymatycznej wynosi 7 µl. Jako fazę ruchomą stosuje się wodę (A)-acetonitryl (B). Gradient elucji wynosi: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 minut , 30% ~ 60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Objętościowe natężenie przepływu wynosi 0,3 mL/min. Warunki spektrometrii mas to: źródło jonów poprzez elektrorozpylanie, azot jako gaz nośny, ciśnienie gazu osłonowego 3,5 MPa, ciśnienie gazu pomocniczego 1,0 MPa, ciśnienie rozpylania 3500 V, temperatura kapilary 350 stopni, temperatura ogrzewania gazu pomocniczego 200 stopni, tryby jonów dodatnich i ujemnych, skanowanie zakres jonów m/z wynosi 100-1500, pełna rozdzielczość MS wynosi 35 000, rozdzielczość dd-MS2 wynosi 17 500, (N)

CE/stopniowe nce ustawione na 35, 60.

2.6 Subkomórkowa lokalizacja białka CtCHS

W oparciu o sekwencję CtCHS i zasadę płynnego klonowania zaprojektowano startery z miejscami cięcia enzymatycznego Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a odpowiednie fragmenty docelowe amplifikowano metodą PCR. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a docelowy fragment i wektor połączono za pomocą zestawu do klonowania bez szwu (Novizan, Cat C115-01), a następnie przeniesiono do kompetentnych komórek E. coli DH5. , wybierz pojedyncze szczepy klonów do sekwencjonowania i ekstrahuj plazmidy z właściwych szczepów. Plazmidy pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS i pCAMBIA 1300-35S-GFP transformowano do protoplastów Arabidopsis thaliana przy użyciu PEG4000 i hodowano w słabym świetle przez 8 do 10 godzin. Subkomórkową lokalizację białka CtCHS obserwowano pod laserowym mikroskopem konfokalnym.

2.7 Analiza wzoru ekspresji CtCHS

W oparciu o sekwencję CtCHS, DNAMAN wykorzystano do zaprojektowania ilościowych starterów fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym, z F-box jako wewnętrznym genem referencyjnym. Sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1. Względną ekspresję CtCHS w kwiatach Cistanche desericola o różnych kolorach wykrywano metodą ilościowej PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym. Użyj TransStart Green qPCR SuperMix (pełne złoto, AQ101-02) do pomiaru metodą barwnika fluorescencyjnego SYBR Green, układ reakcyjny: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, startery przed i za końcem (10

μmol/L) {{0}},2 μL każdy, matryca cDNA 0,5 μL, woda wolna od nukleotydów 4,1 μL, do reakcji zastosowano metodę dwuetapową, a procedurę reakcji oparto na metodzie Dong Xianjuana i in. [18]. Każda próbka zawierała 3 repliki biologiczne, a doświadczenie powtórzono trzykrotnie. Dane eksperymentalne analizowano przy użyciu programu Excel do wersji 2

Względną ekspresję CtCHS obliczono metodą −ΔΔCt, a do przeprowadzenia analizy istotności i narysowania histogramów wykorzystano GraphPad Prism 8.