Kombinatoryczne metody genetyki do odkrywania kombinacji regulacyjnych wysokiego rzędu i inżynieria genetycznych sterowników różnicowania neuronów

Nurkowanie w poszukiwaniu skutecznych czynników różnicowania komórek

Naukowcy wciąż starają się znaleźć lepsze terapie, aby cofnąć lub spowolnić postęp zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i choroba Huntingtona. Zaburzenia te są wynikiem śmierci komórek nerwowych w różnych częściach mózgu. Leki lub terapie stosowane w celu złagodzenia objawów u pacjentów nie zostały dobrze ugruntowane.

Kliknij, aby cistanche tubulosa proszek do neuroprotekcji

Nie regenerują uszkodzonych tkanek nerwowych i mogą powodować niepożądane skutki uboczne. Dlatego coraz więcej badań traktuje komórki macierzyste jako obiecujący środek terapeutyczny ze względu na ich zdolność do samoodnawiania i elastyczność różnicowania w pożądane linie komórkowe do wszczepienia pacjentowi w celu odzyskania utraconych tkanek nerwowych.

Jednak zanim komórki macierzyste będą mogły być stosowane klinicznie w leczeniu zaburzeń neurologicznych, nadal istnieją obszary, które wymagają lepszego zrozumienia, aby uwolnić ich pełny potencjał. Komórki macierzyste są regeneracyjne i plastyczne, ze skłonnością do przekształcania się w dowolny typ komórek, jeśli zapewni się odpowiednią mieszankę czynników napędzających różnicowanie. Istnieje jednak duża złożoność w dużej sieci czynników.

Ważne jest, aby określić kombinacje czynników transkrypcyjnych (TF), małych cząsteczek i/lub czynników wzrostu, aby osiągnąć optymalny synergizm różnicowania komórek macierzystych, w tym embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w najszybszym tempie, co skutkuje w najczystszej populacji linii neuronalnej. Może jednak istnieć strategiczny sposób badania tych czynników w sposób bardziej opłacalny i oszczędny czasowo.

Pomogłoby to w optymalizacji już ustalonych protokołów, które wciąż są pracochłonne, lub w dalszej charakteryzacji podtypów neuronów, takich jak neurony średnio kolczaste, neurony czuciowe i neurony serotonergiczne. Wyzwaniem pozostaje kompleksowe sprofilowanie czynników napędzających los neuronów i zdefiniowanie, w jaki sposób te elementy wchodzą ze sobą w interakcję w sieci regulacyjnej.

Kilka grup wykorzystało nowe metody wysokowydajnych badań przesiewowych, aby wyjaśnić sieć regulacyjną losów komórek i dostarczyło informacji na temat czynników, które napędzają konwersję i przeżycie neuronów. Liu i in. (2018) wykorzystali aktywację CRISPR (CRISPRa) do poszukiwania TF lub czynników wiążących DNA, które promują neuronalny los ESC. Jednak praca ograniczała się do badania pojedynczych czynników lub kombinacji parami.

Kolejne systematyczne badanie przesiewowe zostało przeprowadzone przez Tsunemoto i in. (2018), który badał związek między TF. Większość wybranych przez nich pojedynczych TF nie wykazała żadnych efektów w badaniu, jednak zidentyfikowali 76 parowanych kombinacji TF, aby promować różnicowanie mysich fibroblastów w indukowane neurony.

Warto zauważyć, że ich wynikom brakowało pewnej spójności z poprzednimi badaniami, takimi jak brak wykrycia aktywnego transportera dopaminy Slc6a3 w indukowanych neuronach, prawdopodobnie z powodu pominięcia dodatkowych czynników. W innym badaniu określono geny niezbędne do utrzymania lub poprawy przeżycia neuronów poprzez przeprowadzenie badań przesiewowych opartych na interferencji CRISPR (CRISPRi) (Tian i in., 2019). I znowu ograniczono się do badań przesiewowych pojedynczych sgRNA.

Konieczne są dalsze badania w celu przeprowadzenia obiektywnych badań przesiewowych pod kątem innych czynników genetycznych oraz w celu zwiększenia liczby kombinacji czynników, ponieważ wykazano, że w różnych kontekstach może być wymagany koktajl więcej niż dwóch czynników, aby skutecznie napędzać różnicowanie i przeprogramowywanie.

Dobrym przykładem jest połączenie Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc, które jest niezbędne do regulacji rozwojowej sieci sygnalizacyjnej dla pluripotencji ESC (Takahashi i Yamanaka, 2006). W tak złożonych systemach istnieje potrzeba wszechstronnego scharakteryzowania funkcji kombinacji genetycznych wysokiego rzędu w sposób wysokowydajny, a metoda Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) może być w stanie to zrobić.

Metoda CombiGEM dla wysokowydajnego, uporządkowanego i systematycznego przeszukiwania kombinacji czynników

CombiGEM oferuje nie tylko systematyczny sposób przeprowadzania połączonych ekranów na dużą skalę, ale także ma możliwość skalowalnego składania kombinatorycznych bibliotek genetycznych wysokiego rzędu (Wong i in., 2015, 2016; Zhou i in., 2020). Proces jednogarnkowy umożliwia użytkownikowi badanie przesiewowe pod kątem wielu kombinacji genetycznych; 1-sposób, 2-sposób, 3-sposób iw teorii biblioteki n-kierunkowe.

Zapewnia to szybką alternatywę dla konwencjonalnego procesu budowania i testowania indywidualnych kombinacji potencjalnych kandydatów. Chociaż opracowano również kilka innych kombinatorycznych strategii przesiewowych CRISPR do badania par kombinacji genetycznych (Han i in., 2017; Shen i in., 2017; Najm i in., 2018; Truong i in., 2019; DeWeirdt i in., 2020 ), CombiGEM oferuje wyjątkową możliwość oceny interakcji między trzema lub więcej kombinacjami genetycznymi.

Na przykład, jeśli użytkownik zamierza użyć CRISPRa lub CRISPRi do odpowiednio nadekspresji lub represji listy kandydujących kombinacji TF, można przeszukać kod kreskowy biblioteki kombinacji sgRNA ukierunkowanych na TF przy użyciu CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong i in., 2016; Zhou i in., 2020), jak pokazano na rycinie 1.

Wykorzystując etapy ligacji w jednym naczyniu, biblioteka sgRNA i ich odpowiednie kody kreskowe są włączane do wektora docelowego lentiwirusa, który informuje o ekspresji białka fluorescencyjnego po aktywacji promotora specyficznego dla typu komórki neuronowej, takiego jak tubulina 1. Biblioteka sgRNA i oddzielny wektor lentiwirusowy niosący pozbawiony enzymatycznie Cas9 w fuzji z aktywatorem transkrypcji lub represorem może być dostarczony do pożądanych komórek wyjściowych.

Z biegiem czasu, gdy komórki zaczną się różnicować, tylko indukowane komórki podobne do neuronów będą wyrażać fluorescencję, a komórki te można izolować za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją w celu odzyskania ich kombinacji TF za pomocą sekwencjonowania kodu kreskowego.

Aby lepiej zrozumieć kombinacje, które kierują określonymi liniami komórkowymi, komórki te można również sondować pod kątem znanych reporterów lub markerów linii komórkowych w oparciu o preferencje etapów różnicowania, które użytkownik wybiera do badania. Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie można wykorzystać do oddzielenia interesujących komórek w zależności od ekspresji markerów na powierzchni komórki.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek można połączyć z kombinatorycznym badaniem przesiewowym CRISPR jako odczyt w celu profilowania typu i poziomów regulacji w górę lub w dół genu, a kombinację docelowych TF można określić za pomocą odczytów kodów kreskowych (Replogle i in., 2020). Obrazowanie o dużej zawartości można wykorzystać do monitorowania zmian morfologii komórek od wczesnych do późniejszych etapów rozwoju neuronów.

Fizjologiczne znaczenie lub funkcjonalność indukowanych komórek podobnych do neuronów można określić przez znakowanie immunocytochemiczne specyficzne dla dojrzewania neuronów, takie jak NeuN, TUJ1 i MAP2, oraz pomiary elektrofizjologiczne. Jak wspomniano wcześniej, badania połączyły TF i małe cząsteczki w celu manipulowania losem komórek.

CombiGEM można również wykorzystać do identyfikacji kombinacji małych cząsteczek, które mogą utrzymać samoodnawianie się komórek macierzystych, indukować różnicowanie linii komórkowych lub ułatwiać przeprogramowanie poprzez zwiększenie wydajności i potencjalne zastąpienie czynników genetycznych. CombiGEM można również zastosować, najpierw określając cele małocząsteczkowe szlaków sygnałowych, epigenetycznych lub komórkowych czynników procesowych.

Następnie, poprzez zaprojektowanie biblioteki sgRNA do aktywacji lub dezaktywacji celów dających się wprowadzić do leków, można następnie zidentyfikować skuteczne kombinacje małych cząsteczek w celu wzmocnienia różnicowania lub przeprogramowania. Ta koncepcja jest dobrze odzwierciedlona w badaniach, które przeprowadziliśmy wcześniej w celu odkrycia docelowych kombinacji leków przeciwko rakowi i chorobie Parkinsona (Zhou i in., 2020).

Zastosowanie CombiGEM nie ogranicza się tylko do zaburzeń opartych na CRISPR, ale może być również stosowane do innych czynników regulacyjnych DNA lub RNA w celu zbadania ekranów utraty funkcji z interferencją RNA, jak również tych, które zyskują funkcję z ekspresją mikroRNA (Wong i in., 2015) oraz ludzkie otwarte ramki odczytu o zweryfikowanej sekwencji, takie jak te opisane w ludzkiej bibliotece TFome (Ng i in., 2020).

Metoda CombiSEAL do wysokowydajnej inżynierii czynników transkrypcyjnych

Znalezienie idealnej kombinacji naturalnie występujących czynników genetycznych może nadal stanowić wyzwanie, takie jak ograniczenie się do scharakteryzowanych TF genomu z wcześniejszą wiedzą na temat ich ekspresji i roli w różnicowaniu. Badania wykazały, że inżynieria TF lub generowanie sztucznych czynników transkrypcyjnych otwiera nową drogę opcji przyspieszenia tempa różnicowania poprzez alternatywne szlaki, wykraczając poza zależność od warunku wstępnej ekspresji innych endogennych kofaktorów w sieci regulacyjnej genów lub całkowicie zastępując naturalne TF z bardziej wydajnymi (Jauch, 2018).

Umożliwia to naukowcom dostosowanie wymaganych czynników do ich potrzeb eksperymentalnych. Proponujemy, aby jeśli ktoś zamierza przeprowadzić mutagenezę o wysokiej przepustowości w wielu miejscach do TF, który obejmuje różne domeny, CombiSEAL może okazać się użyteczną platformą (Choi i in., 2019). Metoda CombiSEAL łączy fragmenty DNA kodujące aminokwasy, które są kombinatorycznie znakowane kodami kreskowymi (ryc. 1).

Rycina 1 ｜ Metody CombiGEM i CombiSEAL do badania przesiewowego pod kątem skutecznych genetycznych czynników różnicowania. Przykładem metody CombiGEM jest składanie wielu sgRNA eksprymowanych z tego samego konstruktu, a kombinacje sgRNA są reprezentowane przez ich połączone kody kreskowe. Metoda CombiSEAL obejmuje mutacje wprowadzone do różnych części białka, takich jak czynniki transkrypcyjne, oznaczone jako P1, P2, P(n) i P(n plus 1). A kombinacje mutacji są odzwierciedlane przez odpowiadające im połączone kody kreskowe. Użytkownik może zastosować ustawienia do innych systemów dostarczania DNA, aw tej reprezentacji używane są wektory lentiwirusowe. Strategie przeszukiwania można przeprowadzić w formacie puli, aw tym przykładzie identyfikacja populacji komórek, które różnicują się do określonej linii neuronów, jest wykrywana przez aktywację promotora do ekspresji białka fluorescencyjnego, oznaczonego na schemacie jako fluorescencja X. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) kodów kreskowych z puli komórek pozwoli rozszyfrować docelowe DNA lub warianty transkrypcji. Rygorystyczna analiza czynników, które napędzają różnicowanie różnych typów neuronów, mogłaby wykorzystywać metody oparte na macierzach, takie jak sondowanie komórek za pomocą markerów linii komórkowej, a następnie sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) na płytkach wielodołkowych, po czym można zastosować obrazowanie o dużej zawartości. Alternatywnie, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (RNA-Seq) pozwala użytkownikowi profilować ekspresję genów komórek o pożądanych fenotypach i byłoby w stanie odzyskać kody kreskowe w celu zidentyfikowania kombinacji sgRNA lub kombinacji mutacji kluczowego wariantu (ów). FACS: sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.

CombiSEAL rozpoczyna się od pierwszego pocięcia części białka, gdzie wymagana jest mutageneza. Użytkownik może wygenerować dowolną liczbę wariantów dla każdej sekcji, a następnie oznaczyć je kodami kreskowymi, aby zidentyfikować pozycję i kombinację mutacji. Każda pula skrawków jest następnie składana sekwencyjnie przez wstawienie ich do docelowego wektora zawierającego sekwencję białka typu dzikiego zmodyfikowaną enzymami IIS typu flankującego w regionie zamierzonej mutagenezy.

Ten schemat fuzji bez blizn, polegający na łączeniu wielu części białka, jest ważny, aby uniknąć dodawania niepożądanych aminokwasów do białka. Metoda CombiSEAL pozwala na bardziej efektywne i ekonomiczne określenie sekwencji aminokwasowych wybranej puli interesujących nas wariantów, unikając konieczności długiego odczytu sekwencjonowania całego białka w celu zidentyfikowania rodzajów mutacji i umiejscowienia ich w całym białku. białko.

Ta metodyczna konfiguracja umożliwia łatwiejszą analizę poprzez przeprowadzenie wysokowydajnego sekwencjonowania puli krótkich połączonych kodów kreskowych, które wnioskują kombinację typów i pozycji mutacji aminokwasów lub innych pożądanych modyfikacji, takich jak zamiana domen, insercja i delecja, które zostały pierwotnie zaprojektowany i zainstalowany w TF

Wniosek

W porównaniu z metodami prób i błędów poczyniono postępy w stosowaniu bardziej systematycznych podejść do określania podstawowych czynników lub kombinacji wymaganych do kierowania konwersją jednego typu komórek do linii neuronalnej. Brakowało jednak możliwości identyfikacji kombinacji wyższego rzędu i tutaj proponujemy, aby metoda CombiGEM była w stanie rozwiązać takie ograniczenia.

CombiGEM wykorzystuje jednonaczyniowy system ligacji z kodem kreskowym do łączenia kombinacji wyższego rzędu czynników wiążących DNA z docelowym DNA za jednym zamachem, z pominięciem procesu wielu rund badań przesiewowych w celu zawężenia liczby trafień do możliwego do opanowania rozmiaru w celu dalszej walidacji . Co więcej, mniej wydajne naturalne TF można zastąpić sztucznymi lub zmodyfikowanymi TF, aby lepiej regulować ekspresję genów. Opisujemy metodę mutagenezy białek, CombiSEAL, która umożliwi użytkownikom tworzenie dużych pul wariantów czynników transkrypcyjnych poprzez bezpośrednie składanie wielu mutacji miejsc oznaczonych kodami kreskowymi w białku i ich różnych domenach.

Przyspieszy to i obniży koszty procedur przesiewowych w celu uzyskania informacji o typach mutacji interesujących nas wariantów. Mamy nadzieję, że proponowane metody mogą pomóc w dalszym zrozumieniu i poszerzeniu możliwości promowania regeneracji neuronów oraz mogą znaleźć szerokie zastosowanie w innych obszarach badawczych.

Mechanizm działania neuroprotekcyjnego Cistanche

Wykazano, że Cistanche ma działanie neuroprotekcyjne poprzez kilka mechanizmów:

1. Działanie przeciwzapalne: Cistanche zawiera związki, które, jak wykazano, hamują stany zapalne w różnych częściach mózgu, co może pomóc w ochronie neuronów przed uszkodzeniem.

2. Działanie antyoksydacyjne: Cistanche zawiera związki o silnych właściwościach przeciwutleniających. Przeciwutleniacze pomagają chronić neurony przed uszkodzeniami powodowanymi przez wolne rodniki i stres oksydacyjny.

3. Regulacja neuroprzekaźników: Wykazano, że Cistanche reguluje niektóre neuroprzekaźniki, takie jak serotonina i dopamina, które mogą pomóc chronić neurony i poprawić funkcje poznawcze.

4. Stymulacja czynnika neurotroficznego: Wykazano, że Cistanche stymuluje produkcję czynników neurotroficznych, takich jak czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF), który może promować wzrost i przeżycie neuronów.

Ogólnie rzecz biorąc, mechanizmy te współpracują ze sobą, aby chronić neurony przed uszkodzeniem, promować ich wzrost i przeżycie oraz poprawiać funkcje poznawcze.

Bibliografia

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Masowa mutageneza kombinatoryczna optymalizuje działania SpCas9 związane z edycją genomu. Metody Nata 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optymalizacja AsCas12a do kombinatorycznych badań genetycznych w komórkach ludzkich. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Synergistyczne kombinacje leków na raka zidentyfikowane na ekranie CRISPR dla par interakcji genetycznych. Nat Biotechnologia 35:463- 474.

Jauch R (2018) Przeprogramowanie losu komórki poprzez inżynierię natywnych czynników transkrypcyjnych. Bieżąca opinia Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Ortologiczny CRISPR- Enzymy Cas9 do kombinatorycznych badań genetycznych. Nat Biotechnologia 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Świersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM i in. (2020) Obszerna biblioteka ludzkich czynników transkrypcyjnych do inżynierii losu komórek. Nat Biotechnol doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Kombinatoryczne ekrany CRISPR jednokomórkowe za pomocą bezpośredniego wychwytu RNA i ukierunkowanego sekwencjonowania. Nat Biotechnologia 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Lubeka J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L i in. (2017) Kombinatoryczne ekrany CRISPRCas9 do mapowania de novo interakcji genetycznych. Metody Nata 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Indukcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z hodowli embrionalnych i dorosłych fibroblastów myszy przez określone czynniki. Komórka 126: 663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) Platforma oparta na interferencji CRISPR dla multimodalnych badań genetycznych w ludzkim iPSC -pochodne neuronów. Neuron 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai do jednoczesnej aktywacji i hamowania genów w celu promowania chondrogenezy komórek macierzystych i regeneracji kości czaszki. Kwasy nukleinowe Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Masowo równoległa genetyka kombinatoryczna wysokiego rzędu w ludzkich komórkach. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) Multipleksowane skanowanie CRISPR-Cas9 z kodem kreskowym włączone przez CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113: 2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Trójdrożny kombinatoryczny ekran CRISPR do analizy interakcji między celami, które można wykorzystać. Przedstawiciel komórki 32:108020.

Świt GL Thean, Alan SL Wong*