Połączenie infuzji adopcyjnych komórek NK z peptydem uwalniającym dopaminę redukuje starzejące się komórki u starszych myszy

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

WPROWADZANIE

Starzenie się jest jednym z głównych czynników ryzyka wielu chorób [1], a opracowanie metod interwencji w starzenie się znacznie zmniejszy ryzyko szeregu chorób związanych z wiekiem, takich jak choroby sercowo-naczyniowe i mózgowo-naczyniowe [2, 3], nowotwory [4] oraz choroba Alzheimera [5]. Starzejące się komórki (SNC) stopniowo gromadzą się w tkankach podczas procesu starzenia i są uważane za główną przyczynę chorób związanych z wiekiem [6-8]. Wykazano, że usunięcie SNC w modelach mysich zapobiega lub opóźnia dysfunkcję tkanek i wydłuża zdrowe życie [9, 10]. Natomiast przeszczepienie niewielkich ilości SNC powoduje dysfunkcję fizjologiczną u młodych myszy [1]. Badania te otworzyły drzwi do opracowania metod ukierunkowanych na usuwanie SNC w celu złagodzenia chorób przewlekłych związanych z wiekiem.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Celowanie w klirens SNC, określane jako „senolityki”, było pierwszą chemioterapią pomyślnie przetestowaną w przedklinicznym modelu in vivo, a obecnie istnieje kilka środków senolitycznych [12]. Wiele z tych leków jest ukierunkowanych na regulowane w górę szlaki antyapoptotyczne w SNC, aby selektywnie usunąć niektóre typy SNC i wykazały potencjał do przedłużenia życia i poprawy funkcji organizmu [13, 14].Ekstrakt z Cistanche przeciw promieniowaniuPomimo skutecznego odwrócenia patologii związanej z wiekiem w modelach zwierzęcych, mogą istnieć pewne przeszkody w stosowaniu leków senolitycznych u ludzi ze względu na heterogeniczność SNC i wysokie ryzyko toksyczności [15]. Dlatego należy zbadać alternatywną metodę, która może bezpiecznie wyeliminować szeroki zakres SNC u ludzi.

SNPs mogą być rozpoznawane i usuwane przez układ odpornościowy [16]. Wcześniejsze badania wykazały, że SNC aktywują komórki naturalnych zabójców (NK) poprzez regulację w górę głównego liganda aktywującego białka A i B, związanego z łańcuchem klasy I, związanego z łańcuchem tkankowym [17]. Jednak wraz z wiekiem wydajność układu odpornościowego spada, co może prowadzić do ucieczki immunologicznej SNC [18]. W terapii nowotworowej badano metody przezwyciężenia ucieczki immunologicznej spowodowanej obniżoną funkcją immunologiczną [19]. Ostatnio poczyniono postępy w adopcyjnym transferze komórek NK w celu eliminacji guzów, co wykazało pewną skuteczność [20]; w związku z tym uzasadnione było założenie, że wlew adopcyjny komórek NK może wywołać cytotoksyczność w SNC.

Układ nerwowy i odpornościowy to dwa najważniejsze systemy adaptacyjne organizmu. Kilka badań wykazało, że dopamina (DA) jako regulator odporności jest kluczem do komunikacji neuroimmunologicznej [21]. DA spełnia swoje funkcje biologiczne poprzez interakcję i aktywację receptorów dopaminy (DR), które są podzielone na 2 podgrupy, D1-podobne (D1 i D5) oraz D2-podobne (D2, D3, i D4). Pod względem ich różnych funkcji, zaangażowanie D1-jak DR stymuluje produkcję cAMP, podczas gdy zaangażowanie D2-jak DR hamuje produkcję cAMP [22]. Wcześniejsze badania wykazały, że stymulacja DR podobna do D1- zwiększa cytotoksyczność komórek NK zarówno in vitro [23], jak i in vivo [24]. Jednak poziomy DA spadają wraz ze wzrostem wieku człowieka [25]. Postawiliśmy zatem hipotezę, że leki dopaminergiczne mogą nasilać cytotoksyczność adopcyjnej infuzji komórek NK.

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

W tym miejscu proponujemy zastosowanie nonapeptydu Aceiny, który oddziaływał z enzymem konwertującym angiotensynę (ACE I) w celu indukowania sekrecji DA [26], w połączeniu z ogólnoustrojową terapią komórkami NK w celu eliminacji SNC. Wyniki in vitro wykazały, że komórki NK usuwały SNC, niezależnie od induktorów starzenia i typów komórek.cistanche herbaW modelu starzejącej się myszy terapia komórkami NK w połączeniu z aceiną znacząco zmniejszyła liczbę komórek dodatnich pod względem galaktozydazy (SA- -gal) związanych ze starzeniem się w wielu tkankach, zmniejszyła ekspresję genów związanych ze starzeniem się w głównych narządach i złagodzone fenotypy wydzielnicze związane ze starzeniem się (SSP). Wyniki tego badania dostarczają wglądu w możliwe przywrócenie nadzoru immunologicznego przewlekłych SNC przy użyciu terapii komórkami NK w połączeniu z Ace.

WYNIKI

Adopcyjna infuzja komórek NK redukuje starzejące się limfocyty T CD3 plus we krwi obwodowej

Do badania zrekrutowano 26 ochotników, którzy otrzymali infuzję komórek NK. Charakterystykę i właściwości komórek NK ochotników przedstawiono w Tabeli 1. Przedział czasowy do ponownego pobrania krwi po transfuzji komórek NK wynosił około 37 (25-57) dni. Proporcja (ryc. 1A) i bezwzględna liczba (ryc. 1B) komórek NK we krwi obwodowej były odwrotnie proporcjonalne do wieku ochotników. Co zaskakujące, czystość produktu komórek NK ponownie infuzyjnego do każdego osobnika była również odwrotnie skorelowana z wiekiem ochotników (ryc. 1C).wzrost penisa cistancheMoże to być spowodowane stopniowym zmniejszaniem się liczby komórek NK wraz z wiekiem. Aby odzwierciedlić efekt przeciwstarzeniowy podania komórek NK, przed i po infuzji komórek NK wykryto wiele markerów starzenia we krwi obwodowej CD3 plus limfocyty T, które w dużej mierze odzwierciedlają związany z wiekiem fenotyp organizmu [27]. W porównaniu z markerami starzenia i czynnikiem SASP limfocytów T CD3 plus we krwi obwodowej przed i po infuzji autologicznych komórek NK, odsetek limfocytów T SA- -gal-dodatnich był znacznie zmniejszony po infuzji (Fig. 1D). Poziomy mRNA P16, P21 i inhibitora aktywatora plazminogenu 1 (Pai1) uległy znacznemu obniżeniu, podczas gdy zmiany w poziomach mRNA białka chemoatraktantu monocytów -1 (MCP-1) i IL-6 nie były istotne (ryc. 1E). Nie było istotnej różnicy we wskaźnikach biochemicznych (tabela uzupełniająca 1) we krwi obwodowej.

Ludzkie komórki NK redukują markery starzenia tkanki tłuszczowej i wydzielanie cytokin prozapalnych

Tkanka tłuszczowa została pobrana od trzech otyłych osób, ponieważ otyłość powoduje akumulację SNC [28]. Ponadto tkankę tłuszczową hodowano w kondycjonowanej pożywce z SNC w celu dalszego indukowania starzenia tkanki tłuszczowej. Tkankę tłuszczową hodowaną w kondycjonowanej pożywce z komórek innych niż SNC uznawano za kontrolę. Ekspresja perforyny (ryc. 2A) i CD69 (ryc. 2B) w komórkach NK była znacznie podwyższona po koinkubacji ze starzejącą się tkanką tłuszczową w porównaniu do koinkubacji z kontrolną tkanką tłuszczową. Ekspresja starzejących się markerów p16 i p21 in

starzejąca się tkanka tłuszczowa uległa znacznemu zmniejszeniu po leczeniu komórkami NK (ryc. 2C, uzupełniający ryc. 1A, B). Odkryliśmy również, że kluczowy składnik SASP w kondycjonowanej pożywce po koinkubacji z komórkami NK w grupie starzejącej się był znacznie zmniejszony (ryc. 2D). Wyniki te sugerują, że komórki NK mogą eliminować SNC z tkanki tłuszczowej i zmniejszać fenotyp SASP.

Mysie komórki NK mogą być aktywowane przeciwko SNC i wywierać cytotoksyczność

Najpierw indukowaliśmy starzenie się mysich komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej przez napromienianie lub adriamycynę, jak opisano wcześniej [29]. Aby określić, czy komórki NK były specyficznie aktywowane przez SNC, nienapromieniowane komórki kontrolne lub napromieniowane SNC inkubowano wspólnie z komórkami NK przez 24 godziny. Cytometria przepływowa wykazała, że ​​poziomy ekspresji CD69 (Fig. 3A) i IFN-y (Fig. 3B) w komórkach NK były znacząco podwyższone w docelowych komórkach SNC w porównaniu z kontrolnymi komórkami docelowymi. Tymczasem po koinkubacji z komórkami NK poziom apoptozy SNC był znacznie wyższy niż w komórkach kontrolnych (Fig. 3C). Następnie wykryliśmy ekspresję ligandów aktywujących i hamujących komórki NK w SNC. Wyniki qPCR wykazały, że poziom ekspresji ligandów aktywujących w komórkach NK był znacząco podwyższony w porównaniu z komórkami kontrolnymi, a poziom ekspresji niektórych ligandów hamujących, takich jak beta 2 mikroglobuliny (2m), był obniżony w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Ryc. .3D). Zbadaliśmy również zdolność komórek NK do eliminacji SNC in vivo.Korzyści z salsy cistancheKomórki kontrolne znakowane DiR i SNC znakowane DiR przeszczepiano do jamy brzusznej myszy, a komórki NK podawano przez żyłę ogonową. Wyniki obrazowania in vivo wykazały, że intensywność fluorescencji u myszy z przeszczepionymi SNC po traktowaniu komórkami NK była znacznie słabsza niż u myszy z przeszczepionymi komórkami kontrolnymi (ryc. 3E). Wskazuje to, że zdolność komórek NK do zabijania SNC była znacznie wyższa niż zdolność SNC in vivo. Następnie ustaliliśmy, czy cytotoksyczność komórek NK wobec SNC była zależna od dawki i swoista komórkowa. W tym samym czasie wykorzystaliśmy również starzenie się wywołane doksorubicyną, aby określić, czy cytotoksyczność komórek NK wobec SNC była ograniczona do indukcji promieniowania. Wyniki wykazały, że komórki NK miały znaczną aktywność cytotoksyczną wobec SNC w sposób zależny od dawki, ale niewielką cytotoksyczność wobec komórek kontrolnych. Różne metody stymulacji starzenia nie miały wpływu na zdolność komórek NK do zabijania SNC (ryc. 3F). Wyniki te sugerują, że komórki NK mogą być specyficznie aktywowane przez SNC i wywoływać znaczną cytotoksyczność wobec SNC in vitro i in vivo.

DA zwiększa cytotoksyczność mysich komórek NK wobec SNC poprzez receptory D1-podobne

Ze względu na ważną funkcję komunikacji neuroimmunologicznej DA [30], oceniliśmy, czy DA może nasilać cytotoksyczność mysich komórek NK wobec SNC. Komórki NK inkubowano wspólnie z SNC wywołanymi promieniowaniem i do pożywki dodano różne stężenia DA. Wyniki wykazały, że DA może wzmacniać cytotoksyczność komórek NK wobec SNC (ryc. 4A, B). Aby scharakteryzować szlak sygnałowy, za pomocą którego DA wzmacnia efekt zabijania komórek NK na SNC, oceniono zmiany w ekspresji DR, zawartości cAMP i fosforylacji białka wiążącego element odpowiedzi cAMP (CREB) w komórkach NK. W komórkach NK inkubowanych wspólnie z SNC wraz z DA zawartość cAMP (ryc. 4C) i poziom fosforylacji CREB (ryc. bez DA. W celu wyjaśnienia, dlaczego DA wzmaga aktywność zabijania komórek NK wobec SNC, porównaliśmy zmiany DR na komórkach NK po koinkubacji komórek NK z SNC lub komórkami kontrolnymi. Wyniki wykazały, że poziom ekspresji D1 i D5 DR był znacząco podwyższony po wspólnej inkubacji komórek NK z SNC w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Fig. 4E). Następnie DA i D1-podobają się antagoniści receptora lub D2-podobają się

antagoniści receptora dodawano razem w układzie koinkubacji komórek NK i SNC. W porównaniu z dodaniem samej DA, poziom apoptozy SNC zmniejszył się po dodaniu DA plus SCH-23300(antagonista receptora podobnego do D1-)(Fig. 4F, G). Tymczasem zawartość cAMP (ryc. 4H) i poziom fosforylacji CREB (ryc. 4l, uzupełniający ryc. 2B) w komórkach NK uległy obniżeniu. W przeciwieństwie do tego, dodanie DA plus haloperidolu (antagonisty receptora D2) nie zmieniło znacząco poziomu apoptozy SNC, zawartości cAMP i fosforylacji CREB w komórkach NK, w porównaniu z dodaniem samej DA. Wyniki te wykazały, że DA zwiększa aktywność zabijania mysich komórek NK wobec SNC poprzez D1-jak Dr.

Ace w połączeniu z mysimi komórkami NK znacząco zwiększa klirens SNC in vivo

Poprzednie badanie wykazało, że dopamina spada wraz z wiekiem u ludzi [22]. Najpierw zmierzyliśmy obwodowy poziom dopaminy u młodych i starych myszy. Wyniki wskazywały, że poziomy dopaminy w osoczu starych myszy były niższe niż u młodych myszy (ryc. 5A). Następnie zbadano obwodowe uwalnianie dopaminy po dootrzewnowym wstrzyknięciu Aceiny u starych myszy. Odkryliśmy, że poziomy dopaminy w osoczu znacznie wzrosły po wstrzyknięciu 10 mg/kg Aceiny (ryc. 5B, uzupełniający ryc. 3). W związku z tym przeprowadziliśmy mysie komórki NK w połączeniu z aceiną, aby leczyć starsze myszy. Wykryliśmy stan komórek NK we krwi obwodowej myszy po leczeniu i stwierdziliśmy, że liczba komórek NK we krwi obwodowej z infuzji samych komórek NK lub komórek NK w połączeniu z Aceiną była znacznie wyższa niż w grupie leczonej Ace i Grupa PBS, podczas gdy liczba komórek NK nie różniła się znacząco między grupą leczoną komórkami NK a komórkami NK w połączeniu z grupą leczoną aceiną (Fig. 5C, D).cistanche tubulosa dawkowanie redditDalsze wykrywanie poziomu aktywacji komórek NK wykazało, że poziom ekspresji CD69 w komórkach NK krwi obwodowej w grupie leczonej kombinacją był znacząco podwyższony w porównaniu z grupą leczoną komórkami NK (Fig. 5E). Następnie oceniliśmy SNC w tkance. Odkryliśmy, że infuzja samych komórek NK zmniejszyła ekspresję niektórych markerów starzenia się w porównaniu z grupą PBS i grupą leczoną Aceiną, podczas gdy infuzja komórek NK w połączeniu z Aceiną znacząco zmniejszyła liczbę komórek SA- -gal-dodatnich (ryc. 5F ) jak również poziomy ekspresji P16 i P21 (ryc. 5G, uzupełniający ryc. 4A, B) w tkance tłuszczowej, w porównaniu z leczeniem samymi komórkami NK. Liczba komórek Ki67BrdU w tkance tłuszczowej również uległa znacznemu zwiększeniu (ryc. 5H), co dodatkowo dowodzi, że zawartość SNC w tkance tłuszczowej była niższa w grupie leczonej łącznie. Barwienie SA- -gal skrawków wątroby, płuc, nerek i tłuszczu również wykazało najniższy poziom SNC w grupie leczonej kombinacją (rysunek uzupełniający 5A-D). Wyniki te pokazały, że komórki NK w połączeniu z terapią aceiną zwiększyły poziom aktywacji komórek NK u myszy i spowodowały znaczną eliminację SNC in vivo.

Ace w połączeniu z komórkami NK zmniejsza związane z wiekiem fenotypy u starszych myszy

Aby dodatkowo potwierdzić fenotypy związane z wiekiem u myszy, pobrano tkanki wątroby, płuc, nerek, tłuszczu i oka w celu wykrycia różnych markerów starzenia, w tym czynników P16, P21 i SASP. Próbki te zostały wybrane, ponieważ tkanki te z wiekiem ulegają starzeniu z większym prawdopodobieństwem [31]. W każdej tkance, po infuzji samych komórek NK, poziomy mRNA czynników P16, P21 i SASP były znacznie niższe niż w grupie kontrolnej, podczas gdy poziomy markerów starzenia w tkankach wątroby, tłuszczu i wigilii w połączonych leczonych tkankach grupa była dalej zmniejszona w porównaniu z grupą leczoną samą infuzją komórek NK (Fig. 6A). Podobnie wykryliśmy również główny czynnik SASP w surowicy myszy, a wyniki były zgodne z wynikami w tkankach (ryc. 6B). Ponadto zbadaliśmy również poziomy NAD w wątrobie i tkance tłuszczowej, które są związane ze starzeniem się [32]. Stwierdziliśmy, że infuzja komórek NK sama lub w terapii skojarzonej znacząco zwiększyła zawartość NAD w wątrobie i tkance tłuszczowej, przy czym poziom poprawy był znacznie wyższy w grupie terapii skojarzonej (ryc. 6C). Niektóre wskaźniki biochemiczne surowicy, w tym ALT, AST, CREA, UA, CHOL i BUN, są związane z poziomem starzenia [33]. Odkryliśmy, że tylko UA był znacząco obniżony w surowicy myszy w grupie leczonej kombinacją, podczas gdy inne kluczowe wskaźniki biochemiczne nie

MATERIAŁ I METODY Infuzja ludzkich komórek NK

Infuzję autologicznych komórek NK przeprowadził Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Szanghaj, Chiny), a wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez ich komisję etyczną (nr 05,2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). Wszyscy ochotnicy dostarczyli podpisaną świadomą zgodę na pobranie krwi obwodowej. Pokrótce, od każdej osoby pobrano 50 ml krwi obwodowej, po czym wyizolowano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i przeniesiono do kolby T75 z podłożem ExCellerate "Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) zawierającym 1 x Cloudz CD2/NKp46 , rekombinowana ludzka IL-2(27ng/ml), rekombinowana ludzka IL-12 (10 ng/ml), rekombinowana ludzka IL-18 (10 ng/ml i rekombinowana ludzka L{{ 13}}(10 ng/mL)(R&D Systems, USA) przez 48h, a następnie zastąpiony pożywką aktywowaną (270 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2, 20 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-12 , 20 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-18 i 20 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-21) do dalszej hodowli.Gęstość komórek utrzymywano na poziomie 1 x 10° komórek/ml. W 28 dniu hodowli , niewielką liczbę autologicznych komórek NK pobrano do kontroli jakości i ponownie wstrzyknięto dożylnie wraz z autologicznymi komórkami NK o gęstości 4,15×10 stopni (3.76-5.87×10) z czasem wlewu 30 min Proces eksperymentalny przeprowadzono zgodnie z ce z Dobrą Praktyką Kliniczną. Przedział czasu dla drugiego pobrania krwi wynosił około 37 (25-57) dni.

Izolacja ludzkich limfocytów T i komórek NK krwi obwodowej Świeżą krew uzyskano od zdrowych ochotników po uzyskaniu świadomej zgody, a protokół został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Chińskiego Uniwersytetu Farmaceutycznego (numer zezwolenia: SYXK2016-0011). Do izolacji ludzkich PBMC zastosowano Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Kanada). Ludzkie komórki T CD3 plus otrzymano z PBMC przy użyciu magnetycznych kulek sortujących ludzkie komórki T CD3 (Miltenyi Biotec, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Komórki NK izolowano z krwi obwodowej przy użyciu koktajlu RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) zgodnie z protokołem producenta

Separacja i ekspansja mysich komórek NK in vitro

Komórki NK śledziony myszy izolowano przy użyciu zestawu NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) zgodnie z instrukcjami producenta. Pokrótce, uzyskano mysie śledziony, komórki śledziony przefiltrowano stosując filtr komórkowy 70 μm, a limfocyty śledziony otrzymano przez wirowanie w gradiencie gęstości przy użyciu zestawu do rozdzielania limfocytów śledziony myszy (Solarbio, Chiny). Limfocyty śledziony zebrano w celu uzyskania komórek NK o wysokiej czystości przy użyciu kulek magnetycznych do oddzielenia mysich komórek NK. Wyizolowane komórki NK śledziony hodowano w pożywce podtrzymującej RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% L-glutaminą, 1% penicyliną/streptomycyną, 1% minimalną pożywką podstawową (MEM) nie- niezbędny aminokwas, 1% kwas pirogronianowy sodu i 50 uM merkaptoetanol (wszystkie z Life Technologies, USA). Ponadto do średni. Następnie zebrano komórki NK 10 stopni i napromieniowane limfocyty śledziony 10 stopni i 5 ml pożywki do amplifikacji (pożywka podtrzymująca uzupełniona 1000 IU/ml rlL{-2, 10 ng/ml ml-15 i 30 ng/ml anty -przeciwciało NKp46 (PA5-46986,Invitrogen,USA)) było

Fig. 3 SNC aktywują komórki NK i zostały zabite przez komórki NK. Cytometrię przepływową w celu wykrycia ekspresji (A) CD69 i (B) IFN-y przeprowadzono po 24-godzinnej wspólnej inkubacji z mysimi komórkami NK i preadipocytami lub preadipocytami indukowanymi napromienianiem. n =3. Dane przedstawiono jako średnie ±SD. Różnice oceniono za pomocą dwustronnego niesparowanego nieparametrycznego testu t. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Ekstrakcja preadipocytów i komórek satelitarnych mięśni

Preadipocyty wyekstrahowano jak opisano wcześniej [11]. W skrócie, ludzki lub mysi tłuszcz usunięto w sterylnych warunkach i pocięto na kawałki 1-2 mm, przemyto dwukrotnie PBS i trawiono kolagenazą 11 Solarbio） w 37 stopniach przez 1 godzinę. Następnie komórki przefiltrowano przez 100 µm filtr komórkowy, odwirowano przy 300 g przez 5 min i zebrano. Przywierające komórki hodowano w a-MEM uzupełnionym 20% FBS przez 12 godzin i trawiono trypsyną w celu zebrania przylegających komórek. Mięśniowe komórki satelitarne izolowano jak opisano wcześniej [34]. Mięsień czworogłowy pocięto na kawałki 1-2 mm i dodano 5 ml kolagenazy II w celu trawienia w 37°C przez 12 min. Mieszaninę zmieszano pipetą i po dodatkowym trawieniu przez 12 min dodano 5 ml kompletnej pożywki. Komórki przefiltrowano stosując 70 μm filtr komórkowy i odwirowano przy 300 g przez 5 min. Następnie komórki były

hodowane z 5 ml pożywki dodawanej codziennie przez 4 dni. Przywierające komórki oddmuchano pipetą i odwirowano przy 2000 xg przez 5 min. Po trawieniu trypsyną w 37°C przez 5 min, komórki odwirowano przy 2000 xg przez 5 min i zebrano. Następnie dodano 5 ml pożywki F-10 Ham's uzupełnionej 20% FBS i 4 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (PeproTech).

Cytotoksyczność mysich komórek NK śledziony na SNC została wykryta za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej

SNC indukowano 0.2 µM Adriamycyną （MedChemExpress, USA） przez 24 godziny lub przez ciągłą hodowlę przez 20 dni po napromieniowaniu promieniami rentgenowskimi 10 Gy. Następnie 5000 SNC umieszczono na płytce i dodano śledzionowe komórki NK (żywotność komórek: 93,5-97,1 procent) w stosunku efektorowym do docelowego wynoszącym 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3,125:1 i 1,563:1. Supernatanty zebrano po wspólnej hodowli w 37°C przez 24 godziny, a do wykrywania użyto zestawu do wykrywania cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (Cayman Chemical, USA). Cytotoksyczność obliczono według następującego wzoru: cytotoksyczność (procent)=(eksperyment z komórkami w mieszaninie - spontaniczna komórka docelowa - spontaniczna komórka efektorowa)/(maksimum komórki docelowej - spontaniczna komórka docelowa) x 100.

Obrazowanie na żywo

Dwanaście 10-tygodniowych myszy C57BL/6 zakupiono z Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Chiny). Następnie kontrola znakowana jodkiem 1,1'-oktadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiR) (Invitrogen) 1×10 stopni

preadipocyty lub indukowane promieniowaniem starzejące się preadypocyty ponownie zawieszono w 200 µl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i wstrzyknięto do jamy brzusznej myszy za pomocą igły 22G. Po trzech dniach przez żyłę ogonową wstrzyknięto 5x10 stopni allogenicznych komórek NK (żywotność komórek: 93,6-96,2%) w 100 ul PBS. 10 dnia myszy znieczulono izofluranem. Fluorescencję wykryto przy użyciu systemu obrazowania In Vivo serii MS 100 (PerkinElmer, MA, USA).

Cytometrii przepływowej

W celu wykrycia apoptozy SNC koinkubowanych z komórkami NK śledziony znakowanymi DiR (żywotność komórek: 91,8-93,2 procent), SNC 1×10 stopni trawiono z dokładnością w temperaturze 37 stopni przez 10 minut, a następnie barwiono za pomocą zestawu do barwienia aneksyny V i jodku propidyny (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., Chiny) zgodnie z protokołem producenta. SNC były bramkowane w pozycji ujemnej DiR. Aby przetestować aktywację komórek NK, mysie komórki NK zebrano i wybarwiono mNK1.1-alofikocyjaniną (APC)(S17016D) oraz mysim klastrem różnicowania 69-R-fikoerytryna-cyjanina7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) w 4 stopniach przez 30min. Następnie komórki poddano obróbce za pomocą zestawu CytodexCytoperm Plus (BD Biosciences, USA) i barwiono mysim interferonem gamma-brilliant violet 421 (mlFNy-BV421)(XMG1.2) w 4 stopniach przez 30 minut. Barwienie ludzkich komórek NK Perforyną-APC(S16009A) przeprowadzono przy użyciu tego samego protokołu, który zastosowano do barwienia zewnątrzkomórkowego (CD56-izotiocyjanian fluoresceiny [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) i barwienie wewnątrzkomórkowe (perforyna-APC)(Biolegend).

W celu wykrycia komórek NK krwi obwodowej pobrano 100 ul krwi z antykoagulantem. W przypadku krwi obwodowej myszy dodano CD3-FITC, NK1.1-APC i CD69-PE-Cy7. W przypadku ludzkiej krwi obwodowej dodano CD3-BV421 (OKT3) i CD56-FITC i inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej.

Następnie dodano 400 µl 1x lizatu erytrocytów (BD Biosciences) i inkubowano przez 3 min, po czym przeprowadzono trzykrotne płukanie PBS. Aby wykryć proliferację komórek w tkance tłuszczowej, myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 200 µl 10 mg/ml bromodeoksyurydyny „BrdU” 24 i 72 godziny przed eutanazją. Po eutanazji, zapasy tłuszczu pachwinowego usunięto i pocięto na fragmenty, trawiono w 37°C przez 30 min kolagenazą II i DNazą i przefiltrowano stosując filtr komórkowy 100 µm. Komórki poddano obróbce za pomocą zestawu Cytofix/Cytoperm Plus i barwiono BrdU-FITC (3D4) i Ki67-PE (16A8). Cytometrię przepływową przeprowadzono na cytometrze przepływowym CytoFLEX. Zestaw LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) został użyty do wykluczenia martwych komórek we wszystkich doświadczeniach. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Odwrotna transkrypcja ilościowa PCR

RNA wyekstrahowano przy użyciu odczynnika Trizol i odwrócono i transkrybowano do cDNA przy użyciu zestawu Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, Chiny). Ilościową reakcję PCR (qPCR) przeprowadzono przy użyciu mieszaniny reakcyjnej SYBR Green (Yepsen Biotechnology) w systemie ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), z GAPDH służącym jako kontrola wewnętrzna. Dane analizowano metodą 2-△ACt. Lista sekwencji starterów jest przedstawiona w Materiałach Uzupełniających (Tabela 2-3).

Barwienie galaktozydazą związane ze starzeniem

Do barwienia komórek, komórki płukano raz PBS, utrwalano w roztworze galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA- -gal) (Cell Signaling Technology, USA) w temperaturze pokojowej przez 15 min, płukano trzykrotnie PBS i inkubowano przez noc w roztworze barwiącym SA- -gal w 37°C. Płytkę uszczelniono parafilmem, aby zapobiec parowaniu podłoża barwiącego. Komórki

przepłukano PBS i obserwowano pod mikroskopem. Do barwienia zamrożonych skrawków skrawki suszono w temperaturze 37 stopni przez 30min i utrwalano w temperaturze pokojowej w roztworze utrwalającym SA- -gal przez 15 minut. Skrawki płukano trzykrotnie PBS i inkubowano przez noc w roztworze barwiącym SA- -gal w 37°C. Następnie barwiono je eozyną przez 1 min i płukano wodą przez 2 min. Dane barwienia SA- -gal analizowano przy użyciu oprogramowania Image-Pro Plus 6.0.

Eksplanty ludzkiej tkanki tłuszczowej

Tkankę tłuszczową od trzech osób pobrano metodą liposukcji. Jednym z badanych był mężczyzna, a dwie kobiety. Średni wiek badanych wynosił 57.0±7,6 lat (średnia±SD: zakres, 50-65). Średni BMI wynosił 40,5±5,1 kg/m²（średnia± SD; zakres, 36.7-46.2）. Komitet etyki Szpitala Onkologicznego w Szanghaju Mengchao (nr 05, 2020, Komitet Etyki Medycznej Szpitala Onkologicznego w Szanghaju Mengchao) zatwierdził schemat eksperymentalny. Od wszystkich wolontariuszy uzyskano świadomą zgodę. Tkankę tłuszczową pocięto na małe kawałki o średnicy około 2 mm. Pięć kawałków tkanki umieszczono w każdym dołku płytki 96-dołkowej i 200 μl preadipocytów lub pożywki kondycjonowanej ze starzejących się preadipocytów wywołanych promieniowaniem, uzupełnionych 10% ludzką surowicą AB, 1% L-glutaminą, 1 procent penicyliny/streptomycyny, 1% aminokwasów endogennych MEM i 1% kwasu pirogronianu sodu dodano do wspólnej hodowli na 24 godziny. Następnie pożywkę zastąpiono świeżą pożywką zawierającą 5 x 10 stopni autologicznych komórek NK (żywotność komórek: 92,3-957 procent 6) i hodowano przez kolejne 48 godzin, po czym komórki NK zebrano do cytometrii przepływowej. Tkankę tłuszczową płukano pięć razy PBS i tę samą pożywkę dodawano do dalszej hodowli przez 48 godzin; supernatant (100 ul) zastosowano do wykrywania wieloczynnikowego. Preadipocyty lub indukowane promieniowaniem starzejące się preadipocyty pochodziły z tkanki tłuszczowej tego samego osobnika.

Ten artykuł pochodzi z Cell Death and Disease (2022) 13:305