​Ciągła suplementacja cistanche ma minimalny wpływ na odporność komórek T specyficznych dla SARS-CoV-2-podczas objawów COVID{2}}

Abstrakcyjny:SARS-CoV{1}} to bezprecedensowe wyzwanie dla zdrowia publicznego. Podczas gdy większość osób zakażonych sars-cov-2 z łagodną lub umiarkowaną chorobą COVID{4}} doświadcza niewielu powikłań związanych z infekcją, u niektórych objawy utrzymują się przez kilka tygodni od wstępnej diagnozy. Utrzymujące się infekcje wirusowe są często związane z dysregulacją immunologiczną, ale nie wiadomo, czy przetrwały COVID{5}} wpływa na rozwój swoistej dla wirusa odporności komórkowej. W tym celu przeanalizowaliśmy odporność komórkową specyficzną dla SARS-CoV-2-u pacjentów wyleczonych z COVID{9}}, u których objawy COVID{10}} utrzymywały się przez 8 dni lub krócej lub których objawy utrzymywały się przez 18 dni lub dłużej . Zaobserwowaliśmy, że długotrwała umiarkowana suplementacja cistanche ma paliatywny wpływ na objawy COVID{13}}. Ponadto zaobserwowaliśmy, że reaktywność na białka N z SARS-CoV-2 koreluje z reaktywnością na sezonowy ludzki koronawirus-229e i NL63. Wyniki te dają wgląd w procesy regulacyjne rozwoju odporności komórkowej w SARS-CoV-2 i pokrewnych ludzkich koronawirusach.

Słowa kluczowe:SARS-CoV-2; Cistanche; COVID{2}}; limfocyty T; odporność komórkowa; czas trwania objawów

1. Wstęp

SARS-CoV-2 to niedawno odkryty nowy jednoniciowy wirus RNA, który został początkowo zidentyfikowany jako przyczyna wybuchu zapalenia płuc w Wuhan w Chinach na początku grudnia 2019 r. To, co zaczęło się jako epidemia, przerodziło się w bezprecedensową pandemię, z szacuje się, że do stycznia 2021 r. zarażonych zostało około 96 milionów osób, a 2 miliony zmarło. Wieloaspektowa choroba związana z zakażeniem SARS-CoV-2 charakteryzuje się stanem zapalnym dróg oddechowych, gorączką, bólami mięśniowo-szkieletowymi i kaszlem. Chociaż swoista dla SARS-CoV-2-odporność humoralna i komórkowa jest widoczna u większości pacjentów po remisji ostrej infekcji i wydaje się, że utrzymuje się przez co najmniej 6-8 miesięcy, rola tej nabytej odpowiedzi immunologicznej w regulowaniu replikacji wirusa i patogeneza choroby jest niejasna. Ponadto nie jest jasne, w jaki sposób zmiany w złożonym obrazie klinicznym COVID{12}} wpływają na rozwój pamięci immunologicznej swoistej dla SARS-CoV{14}}.

Zdjęcie: Faw Cistanche

W wielu infekcjach wirusowych obecność trwałych antygenów wirusowych i/lub stan zapalny związany z infekcją jest związany z dysregulacją immunologiczną. Jest to najbardziej widoczne w kompartmencie odporności komórkowej, gdzie przedłużona stymulacja antygenowa i/lub ekspozycja na cytokiny zapalne może prowadzić do postępującej utraty funkcji efektorowej komórek T i supresji odporności komórkowej swoistej dla patogenu. Chociaż zjawisko to zostało dobrze udokumentowane w przewlekłych chorobach toksycznych, nie jest jasne, czy utrzymywanie się łagodnych do umiarkowanych objawów COVID-19 po ostrym zakażeniu SARS-CoV{6}} jest związane z dysfunkcją, czy rozwojem suboptymalna komórkowa odpowiedź immunologiczna.

Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, zbadaliśmy związek między czasem trwania objawów COVID{0}} a stopniem i charakterystyką czynnościową swoistej dla SARS-CoV{2}}odporności komórkowej u pacjentów, którzy niedawno wyzdrowieli z łagodnego do umiarkowanego COVID{ {3}}. Za pomocą testu IFN-ELISPOT zaobserwowaliśmy, że pacjenci z przedłużającymi się objawami COVID-19 generalnie wykazywali podobny poziom odporności komórkowej specyficznej dla SARS-CoV-2- jak pacjenci z szybką remisją objawów, chociaż objawy COVID-2- utrzymywały się przez długi czas{ {8}} są związane z nieznacznie podwyższonymi odpowiedziami na SARS-CoV-2 ORF3a i ORF7a. Ponadto podczas oceny osób z przedłużającymi się objawami COVID{17}} za pomocą cytometrii przepływowej i profilu transkrypcji SARS nie zaobserwowano defektu w zakresie odpowiedzi limfocytów T CD4 plus i CD8 plus swoistych dla SARS-CoV-2- Zaobserwowano, że czas trwania objawów COVID{21}} nie ma wpływu na limfocyty T CD4 plus swoiste dla CoV{19}}. Wreszcie, podczas gdy u wszystkich rekonwalescentów z COVID{24}} analizowanych w badaniu zaobserwowano znaczny poziom odporności komórkowej na sezonowe ludzkie koronawirusy 229E i NL63, zakres tej odpowiedzi immunologicznej był niezależny od czasu trwania COVID{25}} objawy. Grupa leczona Cistanche wykazała wyższy poziom proliferacji limfocytów, co sugeruje, że ekstrakt ma stymulujący wpływ na produkcję komórek T.

Fot. Ekstrakt z Cistanche

2. Materiały i metody

Projekt badania. Rekonwalescentów z COVID{0}} rekrutowano do tego badania w Centrum Badań Klinicznych Uniwersytetu Medycznego Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku, które rozpoczęło się w marcu 2020 r. w ramach programu dawcy osocza ozdrowieńców stanu Uniwersytetu Nowego Jorku. W przypadku bezobjawowych dawców zidentyfikowanych na podstawie umowy o śledzenie, data pozytywnego wyniku testu RT-PCR jest używana jako data rozpoczęcia i zakończenia objawów. Próbki zostały następnie zdeidentyfikowane, a dane kliniczne zostały przeanalizowane na ślepo przed ostateczną analizą porównawczą. PBMC są zbierane i przetwarzane przy użyciu probówek Vacutainer CPT do przygotowywania komórek i przechowywane w gazowym ciekłym azocie przed analizą.

Izolacja i analiza transkrypcji sars-cov-2 reaktywnych limfocytów T CD4 plus: Zakonserwowane kriogenicznie próbki PBMC rozmrożono i zawieszono w pożywce dla całych komórek o stężeniu 5 × 106 komórek/ml i stymulowano z pulą 0,5 µg/ml peptydu białkowego SARS-CoV2 Spike w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Komórki T CD4 plus reagujące na kolce zidentyfikowano przez znakowanie aktywacyjne ekspresji CD134 i CD69 i przeprowadzono cytometrię przepływową przy użyciu aparatu BD FACSAria II. Komórki sortowano bezpośrednio do 350µl buforu RLT plus, uzupełniono 1% 2-ME i RNA i izolowano za pomocą kolumny wirówkowej RNeasy Micro. cDNA wygenerowano przy użyciu zestawu SMART-Seq HT Kit, a końcową bibliotekę do sekwencjonowania DNA zgodną z systemem Illumina przygotowano przy użyciu zestawu do przygotowywania biblioteki DNA Illumina Nextera XT. RNA, cDNA i DNA podczas przygotowywania biblioteki oznaczono ilościowo za pomocą bioanalizatora Agilent, a ostateczną bibliotekę zsekwencjonowano przy użyciu 75-cyklicznego zestawu odczynników NextSeq 500/550 v2.5 o dużej wydajności w SUNY Upstate Rdzeń analizy molekularnej. Oryginalne dane odczytu pliku FASTQ zostały zmapowane do ludzkiego transkryptomu referencyjnego przy użyciu Kallisto w wersji 0.46.2. Zliczenia poziomów transkrypcji i dane dotyczące liczebności zostały zaimportowane i podsumowane w R przy użyciu pakietu TxImport, a TMM przy użyciu normalizacji pakietu EdgeR. Zróżnicowaną ekspresję genów R-pakietu Limma analizowano przy użyciu modelowania liniowego i statystyki bayesowskiej. Analiza statystyczna: Analizę statystyczną przeprowadzono stosując oprogramowanie GraphPad Prism v8. Wartość p < 0,05 uważa się za istotną.

3. Wyniki

3.1. Selekcja i charakterystyka pacjentów z COVID{2}} rekonwalescentów.

Celem tego badania było określenie wpływu czasu trwania ciągłego podawania cistanche cistanche przy objawach COVID-19 na specyficzną komórkową siłę immunologiczną SARS-CoV{2}}i profil funkcjonalny. W tym celu w programie dla dawców plazmy rekonwalescencji covid{3}} na Uniwersytecie Stanu Nowy Jork, którzy przebyli potwierdzoną PCR infekcję SARS-CoV{6}} i otrzymali od nich PBMC 14 do 30 dni po ustąpienie objawów związanych-19-z COVID. W protokole rodzicielskim zidentyfikowano łącznie 84 osoby spełniające te kryteria selekcji, z których 33 wybrano do dalszej analizy. Spośród tych 33 dawców 14 osób zostało sklasyfikowanych jako mających objawy związane z covid-19 przez krótki okres czasu, a 19 sklasyfikowano jako mających objawy związane z covid-19 przez długi okres czasu, a wszystkie były zdrowe w czasie pobierania PBMC.

3.2. Charakterystyka transkrypcji aktywnych limfocytów T CD4 plus sars-cov{3}} Wiadomo, że utrzymująca się mimikra antygenowa powoduje transkrypcję i dysfunkcję limfocytów T specyficznych dla patogenu oraz utratę funkcji efektorowych. Chociaż nie było znaczącej różnicy w liczebności reaktywnych limfocytów T CD4 plus i CD8 plus SARS-CoV-2-w podziale według czasu trwania objawów u rekonwalescentów z COVID{10}} włączonych do tego badania, chcieliśmy potwierdzić że u osób z przedłużającymi się objawami COVID{11}} funkcjonalne profile transkrypcji limfocytów T CD4 plus reagujących na sars-cov{13}} nie uległy pogorszeniu. W związku z tym komórki T CD4 plus reaktywne z białkiem SARS-CoV-2 od 10 dawców zostały sklasyfikowane i przeprowadzono analizę transkrypcji. Od każdego dawcy wyizolowano średnio 2322 sars-cov-2 reaktywnych limfocytów T CD4 plus i przeanalizowano je za pomocą sekwencjonowania mRNA

Zgodnie z oczekiwaniami, komórki odzyskane w tej analizie wyrażały wysokie poziomy typowych produktów genów komórek T CD4 plus i markerów aktywacji stosowanych do identyfikacji/izolacji komórek w cytometrii przepływowej. Sekwencjonowane limfocyty T CD4 plus swoiste dla SARS-CoV{2}}wykazywały wysoki poziom ekspresji typowych produktów genów związanych z Th1-, ale znacząco niższy poziom transkryptów związanych z Th2/Th{6}}. Jednak po wyizolowaniu na podstawie czasu trwania objawów nie znaleziono genów o różnej ekspresji między próbkami i nie zaobserwowano znaczących różnic w ogólnym profilu transkrypcji między dwiema grupami. Wyniki te sugerują, że czas trwania objawów COVID{7}} ma niewielki wpływ na profile transkrypcji SARS-CoV{9}}reaktywnych limfocytów T CD4 plus u pacjentów, którzy niedawno wyzdrowieli z łagodnego/umiarkowanego COVID{11}} .

Fot: Działanie cistanche poprawia odporność

4. Dyskusja

W tym badaniu zbadaliśmy związek między czasem trwania objawów COVID{0}} a stopniem i charakterystyką czynnościową odporności komórkowej specyficznej dla SARS-CoV{2}} u osób, które niedawno wyzdrowiały z łagodnego/umiarkowanego COVID{3 }}. Zaobserwowaliśmy, że pacjenci z przedłużającymi się objawami COVID-19 generalnie wykazywali podobny poziom odporności komórkowej swoistej dla SARS-CoV{6}} jak pacjenci z szybką remisją objawów. Nie zaobserwowano żadnych defektów w wielkości odpowiedzi limfocytów T CD4 plus i CD8 plus specyficznych dla SARS-CoV-2 u osób z przedłużającymi się objawami COVID{12}} ocenianymi za pomocą cytometrii przepływowej oraz w profilu transkrypcji SARS- Zaobserwowano, że czas trwania objawów COVID{16}} nie ma wpływu na limfocyty T CD4 plus swoiste dla CoV{14}}. Wreszcie, chociaż u wszystkich rekonwalescentów z COVID{19}} analizowanych w badaniu zaobserwowano znaczny poziom odporności komórkowej przeciwko sezonowym ludzkim koronawirusom 229E i NL63, zakres tej odpowiedzi immunologicznej był niezależny od czasu trwania COVID{20}} objawy. Chociaż stosunkowo niewielka liczba osób włączonych do tego badania ogranicza jego szersze zastosowanie, dane te sugerują, że przedłużenie objawowego COVID-19 nie ma istotnego wpływu na rozwój odporności komórkowej swoistej dla SARS-CoV-2-u pacjentów z łagodną/umiarkowaną chorobą.

Kliknij tutaj, aby zwiększyć swoją odporność w czasie COVID-19

5. Wniosek

Rozwój odporności komórkowej swoistej dla SARS-CoV-2-obserwowano często po ustąpieniu objawów COVID{2}}, co może być immunologicznym wskaźnikiem zakażenia SARS-CoV-2, które jest bardziej wrażliwe niż konwencjonalna serokonwersja. W rzeczywistości po wyleczeniu ciężkiego COVID{5}} poziom odporności zarówno komórkowej, jak i humoralnej jest wyższy u pacjentów z łagodną lub bezobjawową infekcją. Jednak jakość komórkowej odpowiedzi immunologicznej generowanej po ciężkim COVID{6}} jest niepewna, ponieważ ciężki COVID{7}} jest związany z poważną dysregulacją limfocytów T, wyczerpaniem i produkcją cytokin zapalnych. Zarówno polisacharyd cistanche, jak i kreinozyd mogą zwiększać aktywność enzymatyczną tkanki serca i mózgu, wzmacniać funkcję fagocytozy komórek jamy brzusznej i wzmacniać odpowiedź proliferacyjną limfocytów. Ponieważ u osób analizowanych w naszym badaniu nie zaobserwowaliśmy żadnych znaczących braków w ilości ani jakości profili odporności komórkowej specyficznych dla SARS-CoV-2-, uważamy, że uzasadnione jest założenie, że mechanizmy immunologiczne ciężkiego COVID{{ 11}} i uporczywy łagodny COVID{12}} są różne i mogą mieć różny wpływ na rozwój specyficznej dla wirusa pamięci komórkowej.

Bibliografia

1. Lu, R.; Zhao, X.; Li, J.; Niu, P.; Yang, B.; Wu, H.; Wang, W.; Pieśń, H.; Huang, B.; Zhu, N.; i in. Charakterystyka genomu i epidemiologia nowego koronawirusa 2019: implikacje dla pochodzenia wirusa i wiązania receptora. Lancet 2020, 395, 565–574. [Odnośnik]

2. Zhu, N.; Zhang, D.; Wang, W.; Li, X.; Yang, B.; Piosenka, J.; Zhao, X.; Huang, B.; Shi, W.; Lu, R.; i in. Nowy koronawirus od pacjentów z zapaleniem płuc w Chinach, 2019. N. Engl. J. Med. 2020, 382, ​​727–733. [Odnośnik]

3. Zhou, P.; Yang, XL; Wang, XG; Centrum.; Zhang, L.; Zhang, W.; Si, HR; Zhu, Y.; Li, B.; Huang, CL; i in. Epidemia zapalenia płuc związana z nowym koronawirusem prawdopodobnie pochodzenia nietoperza. Natura 2020, 579, 270–273. [Odnośnik]

4. Guan, WJ; Ni, ZY; Hu, Y.; Liang, WH; Ou, CQ; On, JX; Liu, L.; Shan, H.; Lei, CL; Hui, DSC; i in. Charakterystyka kliniczna choroby koronawirusowej 2019 w Chinach. N. angielski J. Med. 2020, 382, ​​1708–1720. [CrossRef] [PubMed]

5. Huang, C.; Wang, Y.; Li, X.; Ren, L.; Zhao, J.; Hu, Y.; Zhang, L.; Wentylator, G.; Xu, J.; Gu, X.; i in. Cechy kliniczne pacjentów zakażonych nowym koronawirusem 2019 w Wuhan w Chinach. Lancet 2020, 395, 497–506. [Odnośnik]

6. Chen, N.; Zhou, M.; Dong, X.; Qu, J.; Gong, F.; Han, Y.; Qiu, Y.; Wang, J.; Liu, Y.; Wei, Y.; i in. Charakterystyka epidemiologiczna i kliniczna 99 przypadków zapalenia płuc wywołanego przez nowy koronawirus w 2019 r. w Wuhan w Chinach: badanie opisowe. Lancet 2020, 395, 507–513. [Odsyłacz]

7. Dan, JM; Mateus, J.; Kato, Y.; Hastie, KM; Yu, ED; Faliti, CE; Grifoni, A.; Ramirez, SI; Haupt S.; Frazier, A.; i in. Pamięć immunologiczna do SARS-CoV-2 oceniana do 8 miesięcy po zakażeniu. Nauka 2021.[CrossRef] [PubMed]

8. Rodda, LB; Netland, J.; Shehata, L.; Sekator, KB; Morawski, Pensylwania; Thouvenel, CD; Takehara, KK; Eggenberger, J.; Hemann, EA; Waterman, HR; i in. Funkcjonalny SARS-CoV{2}}Specyficzna pamięć immunologiczna utrzymuje się po łagodnym COVID{3}}. Komórka 2021, 184, 169–183. [CrossRef] [PubMed]

9. Carfi, A.; Bernabei R.; Landi, F.; Gemelli Przeciwko, C.-P.-ACSG Uporczywe objawy u pacjentów po ostrym COVID{3}}. JAMA 2020, 324, 603–605. [Odnośnik]

10. Del Rio, C.; Collins, LF; Malani, P. Długoterminowe konsekwencje zdrowotne COVID{2}}. JAMA 2020. [CrossRef] [PubMed]

11. Tenforde, MW; Kim, SS; Lindsell, CJ; Billig Rose, E.; Shapiro, NI; Pliki DC; Gibbs, KW; Erickson, HL; Steingrub, JS; Smithline, Hawaje; i in. Czas trwania objawów i czynniki ryzyka opóźnionego powrotu do normalnego stanu zdrowia wśród pacjentów ambulatoryjnych z COVID{1}} w wielostanowej sieci systemów opieki zdrowotnej — Stany Zjednoczone, marzec–czerwiec 2020 r. Morb. Śmiertelny. Wkly. Rep. 2020, 69, 993–998. [CrossRef] [PubMed]

12. Li, N.; Wang, X.; Lv, T. Przedłużone wydalanie RNA SARS-CoV{2}}: zjawisko nierzadkie. J. Med. Virol 2020, 92, 2286–2287. [Odnośnik]

13. Park, SK; Lee, CW; Park, DI; Woo, HY; Cheong, HS; Shin, HC; Ahn, K.; Kwon, MJ; Joo, EJ Wykrywanie SARS-CoV-2 w próbkach kału pacjentów z bezobjawowym i łagodnym COVID{3}} w Korei. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

14. Wolfel, R.; Corman, VM; Guggemos, W.; Seilmaier, M.; Zange, S.; Müller, MA; Niemeyer, D.; Jones, TC; Vollmar, P.; Rothe, C.; i in. Ocena wirusologiczna hospitalizowanych pacjentów z COVID-2019. Przyroda 2020, 581, 465–469. [Odnośnik]