Absorpcja cytokin podczas perfuzji nerek człowieka zmniejsza opóźnioną funkcję przeszczepu związaną z sygnaturą genów zapalnych

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jan R. Ferdynand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Krzysztof J. Ward1|Tomasz Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Molecular Immunity Unit, University of Cambridge Department of Medicine, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

2 National Institute of Health Research Jednostka ds. Badań nad Krwią i Transplantacją Organów, Cambridge, Wielka Brytania

3 Wydział Chirurgii Uniwersytetu Cambridge, Cambridge, Wielka Brytania

Transplantacja jest optymalnym leczeniem większości pacjentów ze schyłkową faząnerkachorobaale niedobór narządów jest poważnym wyzwaniem. Normotermiczna perfuzja maszynowa (NMP) została wykorzystana do regeneracji narządów brzeżnych; jednak mechanizmy, dzięki którym NMP mogą przynosić korzyści narządom, nie są dobrze poznane. Używając par ludzkich nerek uzyskanych od tego samego dawcy, porównaliśmy wpływ NMP z wpływem przechowywania w chłodni na globalnynerkatranskryptom. Odkryliśmy, że przechowywanie w chłodni doprowadziło do globalnego zmniejszenia ekspresji genów, w tym genów szlaku zapalnego i genów niezbędnych do procesów wytwarzania energii, takich jak fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS). W przeciwieństwie do tego, podczas NMP nastąpiła wyraźna regulacja w górę genów OXPHOS, ale także szeregu genów szlaku immunologicznego i zapalnego. Stosując biopsje z nerek poddanych NMP, które zostały następnie przeszczepione, odkryliśmy, że wyższa ekspresja genów zapalnych występuje w narządach z przedłużonym działaniem opóźnionego przeszczepu (DGF). Dlatego zastosowaliśmy hem-adsorber (HA) do usunięcia cytokin prozapalnych. Ta osłabiona ekspresja genów zapalnych zwiększyła geny szlaku OXPHOS i miała potencjalnie klinicznie istotne skutki w zmniejszaniu ekspresji sygnatury genowej związanej z DGF. Nasze dane łącznie sugerują, że adsorpcja mediatorów prozapalnych z perfuzatu stanowi potencjalną interwencję, która może poprawić żywotność narządów.

SŁOWA KLUCZOWE:badania / praktyka kliniczna, opóźniona funkcja przeszczepu (DGF), dawcy i donacje: zmarli,nerkafunkcja/dysfunkcja (przeszczepu allogenicznego),nerkachoroba: odpornościowy/zapalny, nerkowy

Ziele Cistanche poprawiające pracę nerek

1. WSTĘP

Nerkaprzeszczep stanowi optymalne leczenie dla większości pacjentów zkońcowy etapnerkachoroba, z korzyścią zarówno dla jakości, jak i długości życia.1 Niedobór narządów jest poważnym wyzwaniem i zastosowano kilka strategii w celu zwiększenia liczby dostępnych nerek, w tym wykorzystanie dawców zmarłych z powodu śmierci krążeniowej (DCD) i dawców z rozszerzonymi kryteriami (ECD). ), z których oba są związane z wyższymi wskaźnikami opóźnionej funkcji przeszczepu (DGF) w porównaniu ze zmarłym dawcą pnia mózgu (DBD). . DGF występuje z powodu niedokrwiennego uszkodzenia lub śmierci komórek kanalików, które mogą stymulować wrodzoną aktywację odpornościową poprzez zespół inflamasomu NLRP3, prowadząc do wytwarzania interleukiny (IL)1 i IL18. 4-6 Rzeczywiście, obecność zapalnych cytokin w moczu została używany jako biomarkerostrynerkaurazi DGF.7-9

Normothermic machine perfusion (NMP) umożliwia perfuzję przeszczepionych narządów ciepłymi, natlenionymi krwinkami czerwonymi przy braku krążących składników układu odpornościowego, w tym dopełniacza i neutrofili.10-14 Proces ten został wykorzystany do oceny narządów brzeżnych15 oraz do „ „rekondycji” narządów w celu ułatwienia przeszczepu nerek, które początkowo zostały odrzucone w wyniku oferty za pośrednictwem krajowej usługi przydzielania narządów.16 Nasze wcześniejsze doświadczenia z użyciem NMP dostarczyły uzasadnienia dla randomizowanego kontrolowanego badania w celu oceny jego skuteczności w zapobieganiu DGF w nerkach DCD,17 ale mechanizmy, dzięki którym NMP może przynieść korzyści przeszczepionym nerkom, nie są w pełni poznane. Ponadto pytanie, czy dodatkowa manipulacjanerkapodczas NMP, na przykład poprzez usunięcie prozapalnych cytokin i chemokin z perfuzatu, może oferować dodatkowe korzyści w optymalizacji narządu przed przeszczepem nie zostało uwzględnione w ludzkich nerkach, ale nasze badanie świńskiego NMP wykazało obiecujące wyniki.18

Tutaj przyjęliśmy bezstronne podejście, aby odpowiedzieć na te dwa pytania za pomocą analizy transkryptomicznej człowiekanerkabiopsje wykonane na początku i na końcu NMP w celu oceny globalnych zmian w ekspresji genów. Wykorzystaliśmy pary ludzkich nerek od jednego dawcy, co umożliwiło porównanie efektów różnych interwencji w narządach o identycznym podłożu genetycznym i byliśmy w stanie ocenić wpływ tych zmian na prognozę wyniku przeszczepu.

Korzyści z ekstraktu Cistanche: zapobieganie ostrymnerkauraz

2. WYNIKI

2.1. Sparowane nerki są genetycznie podobne i stanowią użyteczny model oceny interwencji

Zbadaliśmy zmiany transkrypcyjne związane z zachowaniem narządów i NMP w dwóch niezależnych badaniach, każde z pięcioma parami nerek, co daje w sumie 10 par/20 ludzkich nerek. Spośród nich dwa pochodziły od DBD, a osiem od dawców DCD (Tabela S1, S2 i Rysunek S1). W tych badaniach wykonaliśmy biopsje korowe przed i po interwencji (przechowywanie w chłodni lub NMP) i zbadaliśmy krajobraz transkrypcyjny za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-Seq). Wykorzystanie sparowanych nerek i sparowanych biopsji z tego samegonerkapozwoliło nam kontrolować zmienność biologiczną i wycofać ten błąd z analizy (ryc. S2A). Potwierdziliśmy tonerkapary zaczynają się od wspólnego krajobrazu transkrypcyjnego (ryc. S2B) i stosując różne interwencje na każdymnerkaw parze jesteśmy w stanie zbadać wpływ interwencji niezależnej od zmienności biologicznej.

RYSUNEK 1 Nerki wystawione na przechowywanie w chłodni wykazują ograniczone zmiany w ekspresji genów w porównaniu z nerkami poddanymi NMP. Uzyskano parę nerek, które zostały odrzucone do przeszczepu. Jedennerkautrzymywano w chłodni statycznej, a drugą poddano normotermicznej perfuzji maszynowej (NMP). Biopsje pobrano z kory zewnętrznej na początku i po 2 godzinach. B, Wykres wulkanu wskazujący na zmianę ekspresji genów po 2 godzinach dla wskazanej grupy w porównaniu do początku. Czerwone kropki wskazują geny o zróżnicowanej ekspresji z skorygowaną wartością P<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

RYCINA 2 Korelacja transkryptomu po NMP z długością opóźnionej funkcji przeszczepu. Ekspresja genu była skorelowana z długością DGF w biopsjach pobranych po NMP w ramach randomizowanego badania klinicznego. Wykreślono poziomy ekspresji 1000 genów o największej korelacji z wynikiem. B, GSEA przeprowadzono dla korelacji z A ze zbiorem danych cech charakterystycznych. Tylko znaczące ścieżki (wartość q FDR<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP powoduje wzrost genów OXPHOS i szlaku zapalnego w porównaniu z przechowywaniem w chłodni

Aby zbadać potencjalne mechanizmy, za pomocą których NMP może wpływać na nerki, początkowo wzięliśmy pięćnerkapar (n {{0}} dawców DCD i n=1 dawców zmarłych z powodu śmierci pnia mózgu [DBD], Ryc. S1, Tabela S1) i wykonali biopsję korową w czasie 0 (0 godzin) . W tym momencie nerki losowo przydzielono do statycznego przechowywania w chłodni lub NMP, jak opisano wcześniej 10 (Figura 1A). Po 2 godzinach pobrano drugą biopsję obu nerek i wykonano RNA-Seq. Porównując ekspresję genów między biopsjami 0- i 2-godzinnymi, stwierdziliśmy, że nerki umieszczone w statycznym chłodni nie miały statystycznie istotnej zmiany w ekspresji żadnego pojedynczego genu po skorygowaniu o wielokrotne testy (ryc. 1B , lewy panel). W przeciwieństwie do tego, w ciągu 2 godzin NMP, 956 genów było regulowanych w górę, a 353 genów w dół (Figura 1B, prawy panel). Następnie oceniliśmy zmiany w ekspresji grup genów w ramach wspólnego szlaku, porównując dziesiątki lub setki genów zamiast jakiegokolwiek pojedynczego genu, tym samym jeszcze bardziej zmniejszając wpływ biologicznej zmienności międzyosobniczej na analizę. Ujawniło to zmiany w funkcjonalnie ważnych szlakach, w których ekspresja każdego pojedynczego genu w obrębie tego szlaku nie została zmieniona na tyle, aby osiągnąć istotność statystyczną. Ta analiza wzbogacania zestawu genów (GSEA) wykazała, że ​​przechowywanie w chłodni miało istotny wpływ na wiele szlaków metabolicznych (ryc. 1C, lewy panel). W szczególności nastąpiła wyraźna redukcja genów zaangażowanych w fosforylację oksydacyjną (OXPHOS), kluczową ścieżkę wymaganą do wytworzenia ATP.19 W przeciwieństwie do tego, OXPHOS był jednym ze szlaków znacznie podwyższonych podczas NMP (ryc. 1C, prawy panel), z potencjalnymi korzyściami dla żywotności komórek i przywrócenia homeostazy komórkowej. Ponadto podczas NMP indukowano szereg szlaków zaangażowanych w procesy immunologiczne lub zapalne, przy czym „sygnalizacja TNF przez NFkB” wykazała największy wzrost. Zgodnie z tym, TNF, jak również IL1B i chemokiny rekrutujące neutrofile CXCL8 (IL8) i CXCL2 były jednymi z najbardziej regulowanych w górę genów w 2-godzinnych biopsjach NMP (Figura 1D). Analiza ciągów 50 najbardziej podwyższonych genów ujawniła podwyższenie poziomu biochemicznie spokrewnionych genów, które zostały zgrupowane w cztery główne węzły; IL8 i chemokiny rekrutujące neutrofile, geny związane z inflamasomem, sygnalizacja NFkB i regulacja transkrypcji (Figura 1E). Warto zauważyć, że nerki DBD i DCD były transkrypcyjnie podobne na początku (ryc. S2C), a szlaki genów zmieniające się podczas NMP były podobne w nerkach DBD i DCD (ryc. S2D). Łącznie nasza analiza pokazuje, że podczas NMP dochodzi do zwiększonej ekspresji genów, które promują wytwarzanie energii, z potencjalnie korzystnym wpływem na narząd, ale z równoczesną indukcją genów prozapalnych, które mogą być szkodliwe.

Ekstrakt z Cistanche tubulosa: poprawia pracę nerek

2.3. Geny szlaku zapalnego w nerkach NMP związane z przedłużonym opóźnieniem funkcji przeszczepu

Aby powiązać zmiany transkrypcyjne zachodzące podczas przechowywania w chłodni i NMP z wynikami klinicznymi, wykonaliśmy RNA-Seq na biopsjach pobranych z 33 nerek z DCD, które poddano NMP w ramach randomizowanego badania klinicznego oceniającego obecnie jego skuteczność.17 Próbki były dostępne na podzbiór nerek przydzielonych losowo do ramienia NMP badania, które następnie przeszczepiono (Tabela S3, Rysunek S1). DGF występuje częściej w nerkach związanych z DCD i jest klasycznie definiowany jako wymóg dializy w pierwszym tygodniu po przeszczepie. Jednak w okresie bezpośrednio po przeszczepieniu niektórzy pacjenci otrzymują pojedynczy epizod dializy z powodu hiperkaliemii, co niekoniecznie odzwierciedla obecność znacznej ostrej martwicy kanalików nerkowych. Dlatego zastosowaliśmy model korelujący ekspresję genu z czasem między operacją przeszczepu a ostatnią sesją dializy (tj. czasem trwania DGF). Wykazało to bardziej wyraźne zmiany transkrypcyjne w przeszczepach wymagających dializy poza pierwszymi 24 godzinami po przeszczepie (ryc. 2A), a także istotną pozytywną korelację między ekspresją genów szlaku zapalnego, w tym szlaków „sygnalizacji TNFA przez NFkB” i „odpowiedzi zapalnej” i długość DGF, z większym wzbogaceniem tych szlaków w nerkach, które doświadczyły dłuższego DGF po przeszczepie (Figura 2B). Odwrotnie, długość DGF ujemnie korelowała z wielkością ekspresji genów szlaku „OXPHOS” (Figura 2B). Wzięte razem, te dane wskazują, że po NMP, nerki, które mają niższą ekspresję genów szlaku zapalnego i wyższą ekspresję genów szlaku „OXPHOS”, są mniej podatne na przedłużone działanie DGF po przeszczepie. Potwierdzałoby to wniosek, że zmiany molekularne zachodzące podczas NMP mogą mieć zarówno korzystny (indukcja genów szlaku OXPHOS), jak i szkodliwy (indukcja genów szlaku zapalnego).

2.4. Wydalanie moczu i przepływ krwi przez nerki podczas NMP wykazują różne powiązania z OXPHOS i genami szlaku zapalnego

Ilość moczu wytwarzanego podczas NMP jest jednym z wielu parametrów uwzględnionych w punktacji oceny jakości chirurgicznej stosowanej do podejmowania decyzji dotyczących wykorzystania narządów,15 ale czy wysoki wydalanie moczu podczas NMP rzeczywiście zapowiada dobre rokowanie dla nerek i leżących u ich podstaw szlaków molekularnych aktywowanych w nerki z wysokim wydalaniem moczu jest niejasne. W sumie 10 nerkach poddanych NMP (nerki tylko NMP, Tabela S1 i S2, Rysunek S1), zaobserwowaliśmy zakres wydalania moczu od 0 do 340 ml w ciągu 2-godzinnego okresu perfuzji (Rysunek 3A lewy panel). Warto zauważyć, że kiedy porównaliśmy szlaki zmieniające się podczas NMP w pięciu nerkach w dwóch niezależnych eksperymentach, odkryliśmy, że indukowano podobne szlaki (ryc. S3A), potwierdzając powtarzalność naszego projektu eksperymentalnego i użyteczność porównywania szlaków, a nie poszczególnych genów. W 2-godzinnych biopsjach poperfuzyjnych ekspresja 11 genów istotnie korelowała z objętością moczu wytwarzanego w tym okresie. Obejmowały one białka szoku cieplnego (HSP), HSPA1A, HSPA1B i HSPH1, które pozytywnie korelowały ze zwiększonym wydalaniem moczu (ryc. 3A prawy panel). Analiza wzbogacania zestawu genów wykazała, że ​​wydalanie moczu również pozytywnie korelowało z genami szlaku „sygnalizacji TNF przez NFkB” i ujemnie korelowało z genami OXPHOS w biopsjach poperfuzyjnych (Figura 3B, S3C). Podobnie w biopsjach przedperfuzyjnych OXPHOS ujemnie korelował z wydalaniem moczu w tych nerkach, podczas gdy szlaki związane z aktywacją immunologiczną, w tym „sygnalizacja TNF przez NFkB” i „odrzucanie przeszczepu allogenicznego”, korelowały dodatnio z wydalaniem moczu, co sugeruje, że NMP miał niewielki wpływ na te procesy , lub na innych analizowanych szlakach, w nerkach o wysokim wydalaniu moczu (ryc. 3B, S3C-D). Ponieważ indukcję genów szlaku zapalnego zaobserwowano w naszych próbkach klinicznych z przedłużonym DGF (ryc. 2B), dane te podważają dogmat, że wysokie wydalanie moczu występuje w bardziej żywotnych, „zdrowych” nerkach i sugerują, że w rzeczywistości nerki te mogą mieć więcej potencjał zapalny, są mniej zdolne do generowania energii i że nie ulega to istotnej zmianie podczas NMP.

Przepływ krwi przez nerki podczas perfuzji również został oceniony jako parametr, który może odzwierciedlać czynność przeszczepu.15 W 10 zbadanych nerkach przepływ krwi przez nerki po 2 godzinach perfuzji wahał się od 14,1 do 168,8 ml/minutę (ryc. 3C lewy panel). W 2-godzinnych biopsjach poperfuzyjnych osiem genów istotnie dodatnio korelowało ze wzrostem przepływu krwi przez nerki (ryc. 3C prawy panel), w tym HSPA1L, ale nie było bezpośredniego nakładania się między tą listą genów a tymi korelującymi z wydalaniem moczu (ryc. 3A ). Analiza wzbogacania zestawu genów wykazała, że ​​wysoki przepływ krwi w nerkach był dodatnio skorelowany z genami OXPHOS w 0-godzinnych biopsjach, ale w przeciwieństwie do tych z najwyższym wydalaniem moczu, perfuzja miała znaczący wpływ, powodując ujemną korelację z „OXPHOS” genów szlaku o 2 godziny (ryc. 3D, ryc. S4A-B). Przepływ krwi przez nerki jest ujemnie skorelowany z wieloma szlakami genów immunologicznych i zapalnych zarówno w 0-, jak i 2-biopsjach godzinnych (ryc. 3D, ryc. S4B), w przeciwieństwie do wydalania moczu (ryc. 3B, ryc. S3C). Łącznie dane te sugerują, że przepływ krwi przez nerki i wydalanie moczu mogą nie być równoważnymi wskaźnikami bardziej żywotnej nerki, ale że te pierwsze mogą dokładniej identyfikowaćnerkamniej prawdopodobne, że wydłuży się DGF.

korzyści i skutki uboczne cistanche: przeciwzapalne

2.5. Dodanie adsorbera hemu do obwodu perfuzyjnego nie wpływa na parametry perfuzji, ale znacząco zmniejsza ekspresję genów zapalnych, w tym NLRP3 i IL1B

Analizynerkaperfuzat wykazał znaczny wzrost stężenia prozapalnych cytokin i chemokin w przebiegu hipotermii i NMP.20,21 Te bioaktywne cząsteczki krążą w nerkach, z potencjałem do wywoływania dalszego stanu zapalnego. Biorąc pod uwagę, że nasza analiza przeszczepionegonerkapróbki wykazały, że indukcja genów zależnych od TNF w nerkach NMP była związana z DGF (Figura 2B), postawiliśmy hipotezę, że usunięcie cytokin i chemokin z obwodu perfuzyjnego może osłabić indukcję genów zapalnych, z potencjalnym korzystnym wpływem na nerki. Takie podejście wykazało pewną skuteczność u pacjentów z zespołem ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej,22,23 i było związane ze zwiększonym nerkowym przepływem krwi w nerkach świń poddawanych NMP.18 NMP przez 4 godziny z biopsją pobraną w 0, 2 i 4 godzinie (Rysunek S1). W każdym przypadku do obwodu perfuzyjnego jednej nerki w każdej parze (NMP plus HA) dodano cytozolowy hem-adsorber (HA), który usuwa cząsteczki o masie cząsteczkowej 10-50 kDa (Figura 4A). Zgodnie z przewidywaniami, dodanie HA skutkowało niższymi stężeniami różnych cytokin w perfuzacie (Figura 4B), ale nie miało wpływu na przepływ krwi przez nerki, wydalanie lub skład moczu, zużycie tlenu i homeostazę kwasowo-zasadową (Figura 4C, Tabela S4, S5). Tak więc, w ciągu 4 godzin NMP, HA nie miał wpływu na parametry perfuzji obecnie stosowane klinicznie do generowania wyników oceny jakości, ale miał istotny wpływ na ekspresję genów; Po NMP, 1794 i 4026 genów uległo zwiększeniu odpowiednio po 2 i 4 godzinach, w tym TNF i IL6 (Figura 4D, E). ale tylko połowa tej liczby (n=898 i n=2606) wzrosła, gdy HA był obecny (ryc. 4D, ryc. S5A i B). Liczba genów regulowanych w dół została również zmniejszona przez dodanie HA (Figura 4D). Po 4 godzinach NMP, 46 genów uległo znacznej regulacji w górę, a 181 w dół po dodaniu HA (Figura 4F). Ta osłabiona odpowiedź transkrypcyjna obejmowała geny związane z aktywacją inflamasomu NLRP3, takie jak IL1B, NLRP3 i CASP1 (ryc. 4G, ryc. S4B) oraz niektóre chemokiny rekrutujące neutrofile (ryc. S5C), wcześniej związane z uszkodzeniem nerek w modelach zwierzęcych.24,25 To pokazuje, że rozpuszczalne mediatory uwalniane znerkarecyrkulować i napędzać ekspresję de novo genów zapalnych w narządzie, ale można to złagodzić przez usunięcie ich z obwodu perfuzyjnego.

RYSUNEK 4 Dodanie adsorbera rąbka do obwodu perfuzji maszyny normotermicznej ma istotny wpływ na poziom cytokin w perfuzacie i transkryptomie, ale nie na parametry fizyczne zarejestrowane na stanowisku. Parę ludzkich nerek pobrano od tego samego dawcy, jedna z par przeszła standardowy protokół normotermicznej perfuzji maszynowej (NMP) przez 4 godziny, a druganerkaprzeszedł NMP z dodatkiem adsorbera rąbka do obwodu. Próbki pobrano na RNA-Seq przed perfuzją (0 godziny), po 2 godzinach i na koniec (4 godziny). B, Stężenie kluczowych cytokin w perfuzacie po 4 godzinach NMP. Linia wskazuje pary nerek. Pomiary cytokin znormalizowano do całkowitej zawartości białka w perfuzacie. Podana wartość P pochodzi ze sparowanego testu t na redukcję cytokin z dodatkiem HA. C, Produkcja moczu i nerkowy przepływ krwi (RBF) w czasie perfuzji. Zielona linia wskazuje sam NMP, a pomarańczowa z dodatkiem adsorbera hem. D, diagram Venna przedstawiający liczby genów znacząco różnie wyrażanych przy porównywaniu próbek 2-hr lub 4-hr z próbkami przed (0-hr). Czerwone diagramy to geny podwyższone, a niebieskie obniżone. Przecięcie to geny, które są wyrażane z szacunkiem w obu punktach czasowych w tym samym kierunku. E, log2 znormalizowane wartości ekspresji dla wskazanych genów w całej perfuzji z transkryptomu tkanki, wskazano standardowe słupki błędów. F, wykres wulkanu dla porównania parami samego NMP z NMP plus HA po 4 godzinach. Kolor czerwony oznacza geny o zróżnicowanej ekspresji ze skorygowaną wartością P<0.05. g,="" as="" for="">

leczyć choroby nerek ekstrakt z cistanche

2.6. HA związany z redukcją sygnatury genów związanych z opóźnioną funkcją przeszczepu

Analiza wzbogacania zestawu genów wykazała znaczny spadek szlaku „sygnalizacji TNF przez NFkB” w nerkach NMP plus HA w porównaniu z samym NMP (Figura 5A-B). Warto zauważyć, że obecność HA nie tylko zmniejsza ekspresję genów zapalnych w obrębienerkaale także zwiększył szlaki metabolizmu OXPHOS i kwasów tłuszczowych, z których oba przyczyniają się do wytwarzania energii (ryc. 5A-B). W związku z tym zmiany w szlakach ekspresji genów zachodzące z HA mogą wspierać wniosek, że jego działanie jest klinicznie korzystne, ponieważ zmniejsza on geny szlaku „TNFA przez NFkB” i zwiększa geny szlaku „OXPHOS”, z których oba były związane z krótszym czas trwania DGF (rysunek 2B).

Aby dokładniej zbadać związek między zmianami transkrypcyjnymi w NMP a wynikami klinicznymi, staraliśmy się wynaleźć sygnaturę genową obecną w nerkach z DGF. Zidentyfikowaliśmy 100 najlepszych genów regulowanych pozytywnie (UP) i negatywnie (DOWN) (uszeregowanych według log-krotnej zmiany), które korelowały z długością DGF w 33 próbkach klinicznych (ryc. 5C, dane S1). Odkryliśmy znaczne wzbogacenie sygnatury genowej związanej ze zwiększoną długością DGF w próbkach o wyższym wydalaniu moczu (Figura 5D), co sugeruje, że wysokie wydalanie moczu podczas NMP identyfikuje nerki zagrożone dłuższym DGF. Nie było statystycznie istotnej korelacji między sygnaturą DGF a genami związanymi z wyższym nerkowym przepływem krwi (Figura 5E). Następnie oceniliśmy, czy iw jaki sposób dodanie HA do obwodu NMP wpłynęło na ekspresję sygnatur genów „UP” i „DOWN” DGF. Co ciekawe, pokazało to, że ekspresja sygnatury genowej związanej ze zwiększoną długością DGF została znacznie zmniejszona przez dodanie HA, a sygnatura związana ze zmniejszoną długością DGF została znacznie zwiększona przez dodanie HA (Figura 5F).

Ogólnie rzecz biorąc, zidentyfikowane przez nas zmiany transkrypcyjne sugerują, że NMP ma potencjalne korzyści w porównaniu z przechowywaniem w chłodni pod względem wpływu na wytwarzanie energii w nerkach. Jednak podczas perfuzji niektóre bioaktywne cząsteczki są uwalniane z nerki do obwodu perfuzyjnego, tworząc pętlę wzmacniającą, która po ponownym wejściu do nerki wywołuje stan zapalny. Usunięcie tych cząsteczek przerywa tę pętlę i może być przydatne do zmniejszenia stanu zapalnego i zwiększenia wytwarzania energii, dodatkowo wzmacniając korzystne działanie NMP i zmniejszając podatność na DGF (Figura 6).

FIGURA 5 Dodanie adsorbera szynki zmniejsza sygnaturę genową związaną z DGF. Analiza GSEA wpływu dodania HA do transkryptomu po 4 godzinach NMP wobec szlaku cech charakterystycznych gensetów. Wykreślone są tylko znaczące ścieżki. Czerwone kropki oznaczają wzbogacenie dodatnie, a niebieskie ujemne, wielkość kropki jest odwrotnie skorelowana z wartością FDRq, a pozycja wskazuje znormalizowany wynik wzbogacenia (NES). B, Wykresy wzbogacania z GSEA dla kluczowych szlaków z bazy danych Hallmark do porównania z A. Linia wskazuje bieżący wynik wzbogacenia, a wykres skrzypcowy wskazuje rozkład genów członkowskich zestawu genów w uszeregowanej liście genów stosowanej w każdej analizie. C, Mapa cieplna czterech największych dodatnich (UP) i ujemnych (DOWN) korelacji z długością DGF i wykorzystana jako część sygnatury ekspresji genów dla DGF. Pełny podpis DGF podany w danych uzupełniających. DF, sygnatura genowa związana z DGF została użyta z GSEA do zbadania ekspresji sygnatury w korelacji wydalania moczu 2-hr z transkryptomem 2-hr (D), korelacja 2-hr RBF z transkryptomem 2-hr (E) i wpływem dodania HA na transkryptom po 4 godzinach (F). Działki jak dla A

RYSUNEK 6 Podsumowanie graficzne. O: Podczas przechowywania w chłodni dochodzi do globalnego zmniejszenia transkrypcji. Podczas NMP ekspresja genów w wielu szlakach jest podwyższona, w tym fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) i genów szlaku zapalnego, takich jak TNF, IL8 i NFkB. B lewy panel, Podczas NMP mediatory stanu zapalnego (żółte kółka) są uwalniane znerkado roztworu perfuzyjnego. Recyrkulują i stymulują transkrypcję genów prozapalnych w nerkach i są związane z redukcją genów produkcji szlaków energetycznych, redukując ATP. Prawy panel, Obecność adsorbera rąbka (HA) przerywa tę zapalną pętlę amplifikacji

Ziele Cistanche poprawiające pracę nerek

3. DYSKUSJA

Nasze dane pokazują, że przechowywanie w chłodni skutecznie ogranicza istotne zmiany w ekspresji genów. Jest to zgodne z modelami gryzoni, w których nerki przechowywane do 18 godzin w chłodni wykazywały niewielkie zmiany w ekspresji cytokin prozapalnych, w tym IL1, TNF i IL6.26. pomiar niewielkiej liczby genów kandydujących pozwolił nam przeanalizować ekspresję grup genów znajdujących się w określonych szlakach. Ujawniło to znaczne zmniejszenie ekspresji genów OXPHOS i szlaku glikolizy w nerkach przechowywanych w chłodni, potencjalnie zmniejszając zdolność tych nerek do wytwarzania ATP, zgodnie z poprzednim badaniem wykazującym obniżony poziom ATP w przechowywanych w chłodni nerkach ludzkich.27 szlaków prozapalnych również obniżono podczas przechowywania w chłodni, w tym aktywację TNF przez NFkB i szlaki reaktywnych form tlenu, które mogą być potencjalnie korzystne. Jednak może się zdarzyć, że przechowywanie w chłodni jedynie tymczasowo zatrzymuje te szlaki i że po reperfuzji u biorcy wystąpią podobne zmiany w ekspresji genów zapalnych, jak obserwowane w NMP.

NMP miał odwrotny wpływ niż przechowywanie w chłodni na OXPHOS i geny szlaku glikolizy, zwiększając ich ekspresję i potencjalnie zwiększając zdolność komórek do generowania ATP i przywracania homeostazy. Warto zauważyć, że hipotermiczna utlenowana perfuzja ludzkich nerek również okazała się zwiększać poziomy ATP w porównaniu z przechowywaniem w chłodni27, dlatego przywrócenie utlenowania może być głównym bodźcem dla tych procesów, a nie normotermia. Niemniej jednak zmiany te prawdopodobnie będą korzystne dla narządu, biorąc pod uwagę naszą obserwację negatywnej korelacji między zwiększoną ekspresją genów szlaku OXPHOS a wydłużeniem DGF.

Niedawna praca Hameeda i wsp.28 również przeprowadziła analizę transkryptomiczną NMP w trzech nerkach poddanych NMP. Niestety autorzy nie udostępnili swoich danych publicznie, dlatego dogłębne porównanie z naszym zbiorem danych nie jest możliwe. Jednak ich manuskrypt wskazywał na indukcję genów związanych z odpowiedzią immunologiczną podczas NMP, w tym IL1B, CXCL2 i TNF, co jest zgodne z naszymi odkryciami.

W naszej analizie nerek poddawanych NMP w kontekście badania klinicznego skorelowaliśmy sygnatury ekspresji genów z długością DGF, a nie występowaniem DGF (definiowanym jako konieczność dializy w pierwszym tygodniu po przeszczepie). Warto zauważyć, że nerki z czasem trwania DGF wynoszącym 1 dzień lub krócej były transkrypcyjnie wysoce podobne do tych bez DGF, co prawdopodobnie odzwierciedla konieczność dializy z powodu hiperkaliemii okołooperacyjnej, a nie DGF w dobrej wierze. Odkryliśmy, że dłuższy DGF był związany z wyższą ekspresją sygnalizacji TNFA poprzez geny szlaku NFkB i niższą ekspresją genów związanych z OXPHOS. Dane te sugerują, że nerki ze zwiększonym poziomem OXPHOS i obniżoną sygnalizacją immunologiczną mogą mieć lepszy potencjał jako nerki dawców, ale wniosek ten wymaga walidacji w większym prospektywnym badaniu.

Oceniliśmy również procesy molekularne, które korelują z wydalaniem moczu i krwią nerkową podczas NMP. Te parametry były wcześniej wykorzystywane, wraz z szeregiem innych miar, do wygenerowania wyniku oceny jakości perfundowanych nerek. Uznano, że wysokie wartości wydalania moczu i przepływu krwi przez nerki odzwierciedlają bardziej żywotny przeszczep.15 Nasze dane pokazują, że szlaki korelujące z wysokim wydalaniem moczu i wysokim przepływem krwi przez nerki różnią się i w rzeczywistości parametry te wykazują przeciwstawne powiązania ze szlakami zapalnymi . Wysokie wydalanie moczu wiązało się z wyższą ekspresją genów szlaku immunologicznego, podczas gdy wysoki przepływ krwi przez nerki był ujemnie skorelowany z tymi szlakami. Odkryliśmy również, że wygenerowana przez nas sygnatura genu DGF została wzbogacona w nerkach o wysokim wydalaniu moczu podczas NMP, co sugeruje, że ten parametr może identyfikować nerki zagrożone dłuższym DGF, w przeciwieństwie do obecnego dogmatu. Jednym z potencjalnych wyjaśnień jest to, że bardzo wysokie wydalanie moczu odzwierciedla nerki z większymi uszkodzeniami kanalików, które nie mają zdolności do koncentracji moczu. W związku z tym może wystąpić „efekt złotej loki” w odniesieniu do wydalania moczu, gdzie nerki o niskim/małym wydalaniu moczu to te ze znacznymi nieprawidłowościami w wytwarzaniu filtratu, nerki z bardzo wysokim wydalaniem moczu mają znaczne uszkodzenie kanalików, uniemożliwiające stężenie moczu. Ta hipoteza musiałaby zostać przetestowana na większej liczbie nerek, które zostały następnie przeszczepione.

W ciągu 4 godzin NMP nastąpiła indukcja genów zapalnych w nerkach. Warto jednak zauważyć, że obecna praktyka kliniczna obejmuje tylko 1 godzinę NMP, a efekt ten może nie być widoczny przy krótszym czasie perfuzji. Jednak dłuższa perfuzja może przynieść korzyści w zakresie przywrócenia natlenienia i wytwarzania energii, a w naszym eksperymencie negatywne skutki indukcji genów układu odpornościowego mogą być zasadniczo zniwelowane przez wprowadzenie HA cytozolu do obwodu perfuzyjnego. Dane te wskazują, że mediatory zapalne wytwarzane przez nerki w przebiegu NMP wchodzą do obwodu perfuzyjnego i są zdolne do zaostrzania jałowego zapalenia, a ich usunięcie poprawia indukcję genów szlaku zapalnego obserwowaną podczas NMP. Co ważne, wykazaliśmy, że dodanie HA wpływa na ekspresję genów, które są związane z gorszymi wynikami klinicznymi. Nasza sygnatura genowa DGF została uzyskana z próbek poddanych NMP w ramach badania klinicznego oceniającego jego skuteczność, co pozwala nam solidnie powiązać zmiany, które zaobserwowaliśmy w naszych sparowanych badaniach nerek z klinicznymi punktami końcowymi w nerkach poddawanych przeszczepom. Jednak jego zastosowanie w kontekście badania klinicznego będzie potrzebne, aby ostatecznie udowodnić użyteczność jego zastosowania do pretransplantacji nerek. HA jest niespecyficzny i może usuwać pomocne cząsteczki, oprócz tych, które są szkodliwe dla narządu. Odkryliśmy, że efekt netto HA na transkryptom nerki wydaje się korzystny, ale może być tak, że udoskonalenie w celu usunięcia sprawdzonych, szkodliwych mediatorów może być jeszcze bardziej skuteczne.

Pary nerek, których użyliśmy, pochodziły od tej samej osoby, a zatem były genetycznie identyczne i przez całe życie dawcy doświadczały podobnego środowiska. Potwierdziliśmy, że ich transkryptom czasu 0 był bardzo podobny (Rysunek S2 A, B). Jednak te biopsje pobierają próbki z niewielkiej części nerki, a patologia, na przykład torbiele lub choroba małych naczyń, może asymetrycznie wpływać na pary nerek. Dodatkowym zastrzeżeniem jest to, że wszystkie nerki użyte w przedstawionych tu eksperymentach interwencyjnych zostały odrzucone do przeszczepu, a niektóre reprezentują przeszczepione narządy z dolnego końca spektrum jakości. Niemniej jednak, porównując szlaki genów w grupach pięciu nerek, zaobserwowaliśmy wysoce powtarzalne wyniki. Udało nam się również wykazać, że nerki z DCD i DBD miały podobną reakcję na perfuzję. Łącząc to z naszą wyselekcjonowaną sygnaturą post-NMP DGF, byliśmy w stanie przewidzieć potencjalne korzyści kliniczne. To eksperymentalne podejście można wykorzystać jako narzędzie przedkliniczne do przesiewania przyszłych interwencji pod kątem potencjalnej skuteczności terapeutycznej, aby umożliwić racjonalny wybór interwencji kandydujących do badań klinicznych.

Podsumowując, nasze badanie dostarcza pierwszego globalnego profilu transkrypcji ludzkich nerek poddawanych NMP, rozwiązując różne szlaki molekularne aktywowane w NMP w porównaniu z przechowywaniem w chłodni i pokazując, że szkodliwe skutki bioaktywnych cząsteczek wytwarzanych lub uwalnianych z nerki podczas NMP mogą odwrócić przez dodanie HA. Co więcej, interwencja ta zmniejszyła ekspresję genów związanych z przedłużonym DGF, zapewniając silne mechanistyczne uzasadnienie zastosowania takiej interwencji w przyszłych badaniach klinicznych. Nasze dane mają również wpływ na strategie perfuzji poza nerkami, w tym w transplantacji wątroby i płuc, sugerując, że usuwanie cząsteczek bioaktywnych z perfuzatów powinno być badane w tych kontekstach, w których coraz częściej stosuje się NMP. Wreszcie, nasze badanie podkreśla użyteczność globalnego profilowania transkrypcyjnego w parachnerkido oceny nowych interwencji na perfundowanych narządach; zmiany transkrypcyjne poprzedzają zmiany w obfitości białek (tradycyjnie stosowane jako biomarkerynerkauszkodzenia) i można łatwo zmierzyć dziesiątki tysięcy transkryptów genów. Zatem pomiar RNA może zapewnić wczesny, czuły odczyt funkcji komórkowych narządów ludzkich pobranych do przeszczepu, który można zastosować w przyszłych badaniach.

PODZIĘKOWANIE

Autorzy dziękują wszystkim dawcom narządów i ich rodzinom. Laboratorium Clatworthy jest wdzięczne za podstawowe udogodnienia oferowane przez Laboratorium Biologii Molekularnej MRC. Ta praca została wykonana przy użyciu zasobów dostarczonych przez Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) obsługiwane przez University of Cambridge Research Computing Service, dostarczane przez firmy Dell EMC i Intel przy wykorzystaniu funduszy Tier-2 z działu Engineering and Physical Sciences Research Council (grant kapitałowy EP/P020259/1) i finansowanie DiRAC z Rady ds. Obiektów Naukowych i Technologicznych (www. Dirac. ac., Wielka Brytania).

UJAWNIENIE

Autorzy nie mają konfliktu interesów do ujawnienia, jak opisano w American Journal of Transplantation.

AUTORSKIE WKŁADY

JRF, SH, MLN i MRC zaprojektowały badanie i zinterpretowały dane. Eksperymenty przeprowadzili JRF, SH, TM, CJW, AF i TCD. JRF, SH i MRC stworzyły rysunki i tabele. MRC napisał główny rękopis. JRF i SH stworzyli metody i legendy figur, JRF, SH i MLN zredagowali manuskrypt.

Korzyści z Cistanche: poprawa funkcji nerek

Bibliografia:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. Brytyjski rejestr nerkowy 19. raport roczny: Rozdział 5 Przeżycie i przyczyny zgonu u dorosłych pacjentów w Wielkiej Brytanii poddanych terapii nerkozastępczej w 2015 r.: analizy krajowe i specyficzne dla ośrodka. Nefron. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J i in. Analiza czynników wpływających na wynik po przeszczepieniu nerek od dawców po śmierci sercowej w Wielkiej Brytanii: badanie kohortowe. Lancet. 2010;376(9749):1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Wpływ wieku dawcy i czasu przechowywania w chłodni na wyniki u biorców nerek oddanych po śmierci krążeniowej w Wielkiej Brytanii: badanie kohortowe. Lancet. 2013;381(9868):727-734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Komórki zapalne w niedokrwiennej ostrej niewydolności nerek.Nerkawewn. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Skała KL. Jak umierające komórki ostrzegają układ odpornościowy przed niebezpieczeństwem. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279-289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Immunoterapia na ostrynerkauraz. Immunoterapia. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Biomarkery pooperacyjne przewidują stan ostrynerkauraz i złe wyniki po operacji kardiochirurgicznej u dorosłych. J Am Soc Nefrol. 2011;22(9):1748-1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 i NGAL w moczu prognozują dializę i regenerację przeszczepu ponerkaprzeszczep. J Am Soc Nefrol. 2010;21(1):189-197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowińska I, Durlik M. Biomarkery opóźnionej funkcji przeszczepu jako forma ostrejnerkauraz wnerkaprzeszczep. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Pierwszy przeszczep nerki u człowieka po perfuzji normotermicznej ex vivo. Przeszczep. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Perfuzja normotermiczna ex-vivo w transplantacji nerki: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość. Przeszczep narządów Curr Opin. 2016;21(3):301-307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. Badanie obserwacyjne nad perfuzją płuc Donor Ex Vivo w przeszczepie płuc w Wielkiej Brytanii: DEVELOP-UK. Ocena technologii medycznych. 2016;20(85)::1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M i in. Standardowe pobieranie płuc od dawcy z normotermiczną perfuzją płuc ex vivo: prospektywne randomizowane badanie kliniczne. Przeszczep płuca J serca. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Randomizowane badanie zachowania normotermicznego w przeszczepie wątroby. Natura. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH i in. Wykorzystanie perfuzji normotermicznej Ex Vivo do oceny jakości odrzuconych trzustek od dawców ludzkich. Jestem przeszczepem J. 2015;15(9):2475-2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Udana transplantacja ludzkich nerek uznana za niemożliwa do przeszczepienia, ale resuscytowana przez normotermiczną perfuzję maszynową Ex Vivo. Jestem przeszczepem J. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protokół randomizowanego, kontrolowanego, otwartego badania dotyczącego normotermicznej perfuzji ex vivo w porównaniu do statycznego przechowywania w chłodni w przypadku donacji po przeszczepieniu nerki z powodu śmierci z powodu krążenia. Otwarte BMJ. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Hemoadsorpcja zmniejsza odpowiedź zapalną i poprawia przepływ krwi podczas perfuzji nerek ex vivo w modelu doświadczalnym. J Przeł. Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. Historia cyklu kwasów trikarboksylowych. Perspektywa Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Wartość stężenia biomarkera perfuzji maszynowej w DCDnerkatransplantacje. Przeszczep. 2013;95(4):603-610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS i in. Białka w płynie konserwującym jako predyktory opóźnionej funkcji przeszczepu w nerkach od dawców po śmierci krążeniowej. Clin J Am Soc Nefrol. 2017;12(5):817-824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorpcja przez CytoSorb u pacjentów septycznych: seria przypadków. Opieka krytyczna. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Wpływ usuwania pozaustrojowych cytokin na funkcję bariery naczyniowej u pacjenta we wstrząsie septycznym. J Intensywna terapia. 2017; 5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL i in. IL-17 wytwarzana przez neutrofile reguluje migrację neutrofili za pośrednictwem IFN-gamma u myszynerkauszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne. J Clin Invest. 2010;120(1):331-342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K i in. Korzystny wpływ inhibitora elastazy neutrofilowej na ciepłe niedokrwienno-reperfuzyjne uszkodzenie nerek u szczurów. Przeszczep Proc. 2006;38(7):2201-2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP i in. Porównanie profili ekspresji genów zapalnych, cytoprotekcyjnych i urazowych w nerkach od dawców śmierci mózgowej i sercowej. Przeszczep. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Strategie przywracania poziomu adenozynotrójfosforanu (ATP) po ponad 20 godzinach zimnego niedokrwienia w marginesie ludzkimNerkaPrzeszczepy. Przeszczep Anny. 2018;23:34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. Krótka normotermiczna perfuzja maszynowa odmładza wyrzucone nerki ludzkie. Przeszczep bezpośredni. 2019;5(11):e502.