Koniugat dendrymer-tesaglitazar indukuje zmianę fenotypu mikrogleju i nasila fagocytozę -amyloidu† Część 1

Przekształcenie mikrogleju ze stanu „prozapalnego” zaostrzającego chorobę w fenotyp neuroprotekcyjny i „przeciwzapalny” jest obiecującą strategią w leczeniu wielu chorób neurodegeneracyjnych.

Mikroglej to rodzaj komórek w ośrodkowym układzie nerwowym, który jest przede wszystkim odpowiedzialny za utrzymanie zdrowia i funkcji neuronów. Mogą wydzielać różne czynniki wzrostu i czynniki neurotroficzne oraz mogą utrzymywać normalną aktywność metaboliczną neuronów poprzez usuwanie odpadów wokół neuronów. Badania przeprowadzone w ostatnich latach wykazały, że mikroglej jest ściśle powiązany z pamięcią. Przyjrzyjmy się temu razem.

Po pierwsze, mikroglej może stymulować neurony i promować aktywację neuronów, poprawiając w ten sposób pamięć. Uwalniając szereg neuroprzekaźników, takich jak glutaminian i alanina, mikroglej może promować przekazywanie sygnału między neuronami i może wzmacniać rezonans sygnału neuronu glejowego między błonami presynaptycznymi, dodatkowo promując pobudliwość neuronów i tworzenie pamięci.

Po drugie, mikroglej może również usuwać odpady wokół neuronów, utrzymywać prawidłową aktywność metaboliczną neuronów i zmniejszać śmiertelność neuronów, promując w ten sposób poprawę pamięci. Kiedy wokół neuronów gromadzi się zbyt dużo śmieci, wpływa to na normalną aktywność metaboliczną neuronów, prowadząc do śmierci neuronów i osłabienia ich funkcji, zmniejszając w ten sposób wydajność pamięci. Mikroglej może utrzymać normalne środowisko metaboliczne neuronów i zmniejszyć śmiertelność neuronów poprzez pochłanianie i rozkład otaczających odpadów, poprawiając w ten sposób pamięć.

Podsumowując, mikroglej jest ściśle powiązany z pamięcią. Promując pobudzenie neuronów i oczyszczając otaczające je odpady, mikroglej może jeszcze bardziej poprawić pamięć i utrzymać zdrowie i aktywność naszych mózgów. Powinniśmy zwracać uwagę na ochronę zdrowia mikrogleju, aby osiągnąć lepszą pamięć. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche to tradycyjny chiński materiał leczniczy o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność Cistanche wynika z różnych zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasu garbnikowego, polisacharydów, glikozydów flawonoidowych itp. Składniki te mogą na różne sposoby promować zdrowie mózgu.

Kliknij Poznaj 10 sposobów na poprawę pamięci

Prozapalny mikroglej przyczynia się do postępu choroby poprzez uwalnianie substancji neurotoksycznych i przyspieszanie akumulacji białek chorobotwórczych. Wykazano, że zarówno agoniści PPAR, jak i agoniści PPAR zmieniają fenotyp mikrogleju z prozapalnego („M1-podobny”) do fenotypu alternatywnie aktywowanego („M2-podobny”). Strategie takie badano w badaniach klinicznych nad chorobami neurologicznymi, takimi jak choroba Alzheimera i Parkinsona, ale prawdopodobnie zawiodły one ze względu na słabą penetrację bariery krew-mózg (BBB).

Wykazano, że dendrymery poliamidoaminowe zakończone grupami hydroksylowymi (bez przyłączenia jakichkolwiek ligandów kierujących) przenikają przez uszkodzony BBB w miejscu zapalenia układu nerwowego i gromadzą się w aktywowanym mikrogleju.

Zatem koniugacja dendrymerowa PPAR/podwójnego agonisty może umożliwić ukierunkowaną zmianę fenotypu aktywowanego mikrogleju. Poniżej przedstawiamy syntezę i charakterystykę nowego koniugatu dendrymer-PPAR/podwójny agonista (D-tesaglitazar).

In vitro D-tesaglitazar indukuje zmianę fenotypu „M1 na M2”, zmniejsza wydzielanie reaktywnych form tlenu, zwiększa ekspresję genów odpowiedzialnych za fagocytozę i enzymatyczną degradację białek chorobotwórczych (np. -amyloidu, -synukleiny) i nasila fagocytozę -amyloidu.

Wyniki te potwierdzają dalszy rozwój D-tesaglitazaru w kierunku translacji w przypadku wielu chorób neurodegeneracyjnych, zwłaszcza choroby Alzheimera i Parkinsona.

Wstęp

W samych Stanach Zjednoczonych na chorobę Alzheimera (AD) choruje obecnie ponad 5,3 miliona osób, a na chorobę Parkinsona (PD) 1 milion osób.1 Ponieważ starszy wiek jest największym czynnikiem ryzyka wielu chorób neurodegeneracyjnych, częstość występowania i koszty leczenia tych chorób będzie nadal rosła wraz ze starzeniem się społeczeństwa.

Co więcej, brak niedawnych sukcesów w opracowywaniu nowych leków do leczenia tych chorób uwydatnił potrzebę opracowania innowacyjnych terapii.2,3 Te niepowodzenia kliniczne uwydatniają trudności w opracowaniu leku, w tym dostarczanie leku do mózgu w wysokim stężeniu zapewniającym skuteczność bez wywołując niekorzystne skutki uboczne.

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak AD i PD, mają trzy główne elementy neuropatologiczne: zapalenie nerwów, akumulację białek patogennych i śmierć neuronów.4-7 U osób zdrowych, wrodzona komórka odpornościowa mózgu (themikroglej) stale fagocytuje nieprawidłowo sfałdowane białka (np. -amyloid, -synukleina ), które powodują śmierć neuronów w miarę ich wytwarzania, co zapobiega tworzeniu się charakterystycznych agregatów.

Jednakże u osób, u których ostatecznie rozwiną się choroby neurodegeneracyjne, mikroglej nie usuwa już skutecznie tych białek i przechodzi w fenotyp prozapalny zaostrzający chorobę (zwykle określany jako M1).

Chociaż klasyfikacja aktywacji mikrogleju, w przeważającej mierze prozapalna/przeciwzapalna (M1/M2), jest nadmiernym uproszczeniem spektrum polaryzacji makrofagów, nadal jest używana jako szeroka nomenklatura do opisania dominującego fenotypu mikrogleju w zapaleniu układu nerwowego i odpowiedzi na terapię.

M1-podobnie jak mikroglej uwalniają reaktywne formy tlenu i inne mediatory stanu zapalnego, które zarówno indukują śmierć neuronów, jak i zaostrzają patologię choroby poprzez zwiększenie produkcji białek chorobotwórczych (np. -amyloidu, -synukleiny).

Co więcej, główne genetyczne czynniki ryzyka rozwoju AD (TREM2 i APOE) ulegają ekspresji na wysokim poziomie w mikrogleju i wykazano, że szlak TREM2/APOE powoduje zmianę fenotypu amkrogleju w AD, stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS) i stwardnieniu rozsianym modele zwierzęce.8

Odkrycia te dodatkowo wskazują na rolę mikrogleju w patologii wielu ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. Podejście polegające na manipulowaniu fenotypem mikrogleju umożliwiłoby naukowcom zrozumienie ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych, a ponadto okazałoby się, że są one potencjalnie skuteczne w leczeniu.

Jako strategię terapeutyczną w leczeniu wielu chorób neurodegeneracyjnych zaproponowano zmianę mikrogleju z fenotypu M1 na przeciwzapalny i neuroprotekcyjny (M2).5,6 Wykazano, że dwaj obecnie zatwierdzeni przez FDA agoniści PPAR, leki na cukrzycę typu II, rozyglitazon i pioglitazon, wywołują Zmiana fenotypu M1 na M2 w makrofagach i mikrogleju in vitro i in vivo.

9,10 Wykazano, że agoniści PPAR zmniejszają indukowane przez LPS wydzielanie reaktywnych form tlenu poprzez zmniejszenie aktywności NF-κB poprzez indukcję degradacji NF-κB i eksportu z jądra, a także zależną od ligandu transrepresję.11

Co więcej, badania epidemiologiczne wykazały, że ryzyko rozwoju AD i PD u pacjentów z cukrzycą przyjmujących rozyglitazon lub pioglitazon jest zmniejszone.12 Następnie w badaniach klinicznych III fazy dotyczących AD i pioglitazonu badano działanie rozyglitazonu i pioglitazonu, ale zakończyło się to niepowodzeniem.13

Jednym z prawdopodobnych wyjaśnień niepowodzeń wyżej wymienionych badań klinicznych jest słaby transport tych leków przez barierę krew-mózg (BBB), co ogranicza liczbę leków, które docierają do mózgów pacjentów włączonych do tych badań klinicznych.14

Rzeczywiście szacuje się, że BBB zapobiega przedostawaniu się do mózgu około 98% wszystkich leków małocząsteczkowych i tylko część leku, który dostaje się do mózgu, dociera do mikrogleju.15

Ponadto PPAR jest kolejnym receptorem jądrowym w rodzinie PPAR.16 Odgrywa rolę w homeostazie lipidów i regulacji stanu zapalnego. Wykazano także, że agoniści PPAR wykazują działanie przeciwzapalne w mikrogleju.

Badania kliniczne z wykorzystaniem neuroobrazowania, pośmiertnej analizy tkanek i biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego dostarczyły dowodów na to, że bariera BBB jest upośledzona w AD i PD, a także innych chorobach neurodegeneracyjnych.

Wykazano, że dendrymery poliamidoaminowe (G4-PAMAM-OH) 17. generacji-4 zakończone grupami hydroksylowymi wewnętrznie omijają upośledzony BBB i gromadzą się w aktywowanym mikrogleju bez konieczności ukierunkowania ligandów, po podaniu ogólnoustrojowym w wielu różnych modelach chorób neurozapalnych , w tym u gryzoni, królików, psów i naczelnych innych niż ludzie.18–28 Co istotne, G4-PAMAM-OH można podawać ogólnoustrojowo i przekraczać barierę krew-magnesu w modelach chorobowych z łagodnym zaburzeniem bariery BBB, takich jak zespół Retta.29

Ponadto stopień wychwytu G4-PAMAM-OH do mózgu jest wprost proporcjonalny do ciężkości choroby u królika w modelu porażenia mózgowego.30 Dendrymery zakończone grupą hydroksylową mają tę zaletę, że są dostarczane nieinwazyjnie w porównaniu z wysoce inwazyjnym, miejscowym dostarczaniem przez czaszki wymaganej w poprzednich badaniach z innymi nanocząsteczkami, takimi jak poli-εkaprolakton i PEG, ujemnie naładowane dendrymery PAMAM, kropki kwantowe i nanopreparaty składające się z polietylenoiminy (PEI) i siarczanu dekstranu.31–35

Ponadto te hydroksylowe dendrymery PAMAM idealnie nadają się do translacji ze względu na ich skalowalność i dobrze tolerowany profil bezpieczeństwa in vivo.36–38 Ze względu na pozytywne przedkliniczne dane dotyczące skuteczności, a (G4-PAMAM-OH)-N- Koniugat acetylocysteiny jest obecnie oceniany we wczesnych badaniach klinicznych pod kątem adrenoleukodystrofii mózgowej u dzieci (NCT03500627) i ciężkiego zapalenia związanego z chorobą koronawirusową 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

Badaliśmy koniugat dendrymer-lek tesaglitazaru (Tesa) przyłączony do generacji-4 PAMAMdendrymeru zakończonego grupą hydroksylową. Tesaglitazar jest silnym PPAR/podwójnym agonistą, który łączy w sobie korzystne działanie PPAR i agonistów PPAR. Zawiera grupę funkcyjną kwasu karboksylowego do kowalencyjnego sprzęgania z dendrymerem i późniejszego uwalniania.

Opracowano i przetestowano klinicznie dodatkowe gitary, ale wybrano Tesę ze względu na większy stosunek aktywności PPAR do PPAR, stosunkowo prostą strukturę chemiczną i profil bezpieczeństwa.39–43

Tesa brała już udział w badaniach klinicznych III fazy dotyczących cukrzycy typu 2 w Stanach Zjednoczonych, ale zakończyła się niepowodzeniem ze względu na toksyczność zależną od dawki, której można zapobiec poprzez zmniejszenie niezbędnej dawki podawania poprzez kontrolowane dostarczanie dendrymeru.39,40,44 Ponieważ Tesa jest lekiem PPAR / podwójny agonista, jego ukierunkowane dostarczanie do aktywowanego mikrogleju w miejscu zapalenia układu nerwowego może być bardzo korzystne.

Tutaj przedstawiamy syntezę i charakterystykę koniugatu dendrymer-tesaglitazar (D-Tesa) i wykazujemy zdolność tego związku do indukowania zmiany fenotypu „M1 na M2” w mikrogleju i wzmacniania fagocytozy znakowanego fluorescencyjnie amyloidu.

Materiały i metody

Przybory

1-[3-(Dimetyloamino)propylo]-3-metylojodek karbodiimidu etylu (EDC), 4(dimetyloamino)pirydyna (DMAP), CuSO4·5H2O, askorbinian sodu, kwas heksynowy i albumina surowicy bydlęcej (BSA) zakupiono od Sigma Aldrich US i używano w otrzymanym stanie (St Louis, MO).

Tesaglitazar otrzymano od AstaTech Inc. (Bristol, PA). Dendrymer PAMAM z rdzeniem etylenodiaminowy (generacja 4 z 64 końcowymi grupami hydroksylowymi) otrzymano od Dendritech Inc. (Midland, MI) w postaci roztworu w metanolu.

Dendrymer przechowywano w metanolu w temperaturze 4 stopni i metanol odparowano przed użyciem. Błonę do dializy o wartości odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącej 1 kDa zakupiono od Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Wszystkie inne rozpuszczalniki stosowano w postaci otrzymanej w postaci bezwodnej. Wszystkie reakcje, z wyjątkiem reakcji kliknięcia katalizowanej miedzią(I), cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC), przeprowadzono w warunkach bezwodnych w środowisku organicznym z suszonymi w piecu naczyniami szklanymi w obojętnym azocie atmosfera.

Do hodowli komórkowej: Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM), płodowe bydlęce (FBS), penicylina-streptomycyna (P/S), 0,05% trypsyna-EDTA i odczynnik MTT otrzymano z firmy Invitrogen (Carlsbad, Kalifornia). , Stany Zjednoczone).

Odczynnik Griessa otrzymano z firmy Promega (Madison, WI), a TNF-ELISA otrzymano z R&D Systems (Minneapolis, MN). Metanol o czystości analitycznej zakupiono od Sigma-Aldrich. Błękit trypanowy otrzymano z Corning (Manassas, VA, USA).

Procedury syntezy koniugatów D-Tesa
Monoazydek glikolu tetraetylenowego (2) zsyntetyzowano stosując wcześniej opublikowany protokół.45

Synteza i oczyszczanie azydku Tesa-TEG (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) rozpuszczono w 10 ml dimetyloformamidu (DMF). Do tego mieszanego roztworu wkroplono monoazydek glikolu tetrametylenowego (2662,1 mg, 3,02 mmol) w DMF (1 ml). Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) i EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano pod przedmuchaniem azotu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.

Reakcję monitorowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 100 ml dichlorometanu (DCM) i surową mieszaninę reakcyjną przeniesiono do rozdzielacza, a warstwę organiczną następnie przemyto trzykrotnie nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, następnie nasyconym roztworem chlorku amonu i na koniec solanką.

Warstwę organiczną następnie wysuszono bezwodnym siarczanem sodu. Następnie rozpuszczalnik z warstwy organicznej usunięto za pomocą wyparki obrotowej, a roztwór ponownie rozpuszczono w 3 ml DCM i zaabsorbowano na żelu krzemionkowym w celu oczyszczenia za pomocą systemu chromatograficznego CombiFlash®, stosując metodę gradientową z octanem etylu/heksanem jako rozpuszczalnikami, w celu wytworzenia 3 tak przejrzystego -żółty olej.

Pożądany, czysty produkt eluuje się około 30–40% octanem etylu. (Wydajność: 70%). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,15 (d, J=1,9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz,2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J. =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J.=8,7 , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 0 Hz, 3H).ESI-MS: teoretyczne C28H39N3O10S: 609,24, otrzymane (M + 1): 610,13.

Synteza i oczyszczanie D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) dodano do mieszanego roztworu G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) w 20 ml bezwodnego DMF. Do tej mieszaniny dodano DMAP (430 mg, 3,52 mmol) i EDC (1 g, 5,28 mmol).

Mieszaninę reakcyjną mieszano pod strumieniem azotu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną przeniesiono do rurki dializacyjnej o mocy 1000 MWCO. Dializę DMF prowadzono przez 24 godziny, a DMF wymieniano co około sześć godzin.

Następnie prowadzono dializę wodą dejonizowaną (DI) przez 24 godziny, przy czym wodę wymieniano co około sześć godzin. Na koniec powstałą zawartość probówki do dializy liofilizowano przez 48 godzin, uzyskując biały, puszysty proszek. (Wydajność: 61%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, wewnętrzny amid dendrymeru H), 4,72 (s, powierzchnia dendrymeru OH), 4,01 (t, ester –CH2), 3,32 (m, dendrymer –CH2), 3,06 (m, dendrymer i łącznik –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrymer –CH2), 2,56–1,89(m, dendrymer i łącznik –CH2), 1,78–1,61 (m, łącznik –CH2). Synteza i oczyszczanie D-Tesa (6).

Do mieszanej mieszaniny D-YNE (5, 35{{2{{27}) dodano azydek tesa-TEG (3177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol). }}} mg, 0,023 mmol) w 5 ml mieszaniny 1:1 tetrahydrofuranu (THF) i wody z 0,5 ml DMF w 20 ml fiolce nadającej się do użycia w kuchence mikrofalowej. W przypadku reakcji CuAAC click do mieszaniny reakcyjnej dodano pentahydrat siarczanu miedzi (11,6 mg, 0,0467 mmol) i (+)-laskorbinian sodu (9,3 mg, 0,0467 mmol).

Fiolkę szczelnie zamknięto, a następnie naczynie reakcyjne umieszczono w reaktorze mikrofalowym Biotage® Initiator i poddano reakcji pod promieniowaniem mikrofalowym o mocy 20 W, mieszając, przez 8 godzin w temperaturze 50°C. Mieszaninę reakcyjną przeniesiono do probówki do dializy o mocy 1000 MWCO i prowadzono dializę DMF przez 24 godziny, przy czym DMF zastępowano świeżym rozpuszczalnikiem w przybliżeniu co 4 godziny.

Następnie zawartość rurki dializacyjnej przeniesiono do probówki Afalcon i dodano równoważną ilość wody DI. Dodatkowo do zawartości probówki Falcona dodano 200 µl roztworu soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego.

Mieszaninę tę następnie umieszczono w nowej rurce do dializy o 1000 MWCO i dializę prowadzono przez 12 godzin w 1000 ml wody DI z dodatkiem roztworu EDTA, po czym prowadzono dializę wodną przez 12 godzin.

Następnie mieszaninę liofilizowano przez 48 godzin, uzyskując biały, puszysty proszek. (Wydajność: 64%) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrymer internalamid H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa i linker H), 3,70 (m, Tesa i linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrymer –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrymer –CH2), 2,87–2,49 (m, dendrymer i łącznik –CH2), 2,25 (m, dendrymer –CH2) , 1,82–1,67 (m, łącznik –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Techniki charakteryzacji

Jądrowy rezonans magnetyczny (NMR). Widma NMR rejestrowano na spektrometrze Bruker 500 MHz w temperaturze pokojowej. Przesunięcia chemiczne protonów (δ) podano w ppm.

Do określenia liczby cząsteczek Tesa przyłączonych do każdej cząsteczki D-Tesa metodą integracji protonów zastosowano metodę 1H NMR, porównując piki wewnętrznych protonów amidowych dendrymeru przy δ 7,6–8,2 ppm z aromatycznymi protonami Tesa przy δ 7,36–6,76 ppm i protonami metylowymi Tesa w obszarze alifatycznym. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).

Zastosowano HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) wyposażoną w pompę binarną 1525, odgazowujący In-Line AF, autosampler 717 plus, detektor z matrycą fotodiodową 2998 i detektor wielofluorescencyjny 2475 połączony z oprogramowaniem Waters Empower.

Zastosowano kolumnę z odwróconą fazą Symmetry C18 (Tosoh, Japonia) mającą wielkość cząstek 5 µm, długość 25 cm i średnicę wewnętrzną 4,6 mm. Związki monitorowano przy 210 nm i 254 nm przy użyciu detektorów PDA.

Rozpuszczalnikiem A była woda klasy HPLC z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA), a rozpuszczalnikiem B był acetonitryl (ACN) z 5% wody i 0,1% TFA. Zastosowaną metodę rozpoczęto w 1{ {7}}0 : 0 (ACN: woda), spadło do 10: 90 (woda: ACN) w ciągu 5 minut, pozostało na tej polaryzacji przez 15 minut i powróciło do 100: 0 (ACN: woda) w ciągu 5 minut minut. Szybkość przepływu utrzymywano na poziomie 1 ml min-1. Spektroskopia mas.

ESI-MS przeprowadzono na spektrometrze mas BrukermicroTOF-II, stosując układ rozpuszczalników acetonitryl/woda (9:1). Do potwierdzenia wzoru empirycznego wykorzystano jony molekularne w postaci protonowanych pików [M + nH]n+ lub adduktów [M + nX]n+ (X=Na, K lub NH4).

Dynamiczne rozpraszanie światła i potencjał ζ. Do określenia wielkości cząstek i rozkładu potencjału ζ wykorzystano Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, Wielka Brytania) wyposażony w laser He–Ne o mocy 50 mW (633 nm). D-Tesę rozpuszczono w wodzie DI do stężenia 0,2 mg ml-1 dla DLS i w 10 mM chlorku sodu do stężenia 0,1 mg ml-1 dla potencjału ζ.

Pomiarów dokonano pod kątem 25 stopni, stosując kąt rozproszenia wynoszący 173 stopnie, jak opisano wcześniej.27,46 Badanie uwalniania leku. D-Tesa rozpuszczono w stężeniu 1 mg ml-1 albo w roztworze buforu fosforanowego (pH 7,4) w warunkach tomimicznych w osoczu, albo w roztworze cytrynianu sodu (pH 5,5), aby naśladować warunki lizosomalne.

Esterazy z wątroby świńskiej (z Sigma Aldrich) dodano do roztworu cytrynianu sodu na początku badania uwalniania i uzupełniano je mniej więcej co 3 dni podczas badania.

Każda fiolka zawierała 15 ml próbki i przez cały czas trwania doświadczenia wytrząsano je w sposób ciągły w temperaturze 37 stopni. W różnych punktach czasowych zebrano podwójne próbki po 200 µl z każdego pH, a następnie aktywność esterazy wygaszono przez dodanie 200 µl metanolu. Próbki w punkcie czasowym zerowej godziny służyły jako kontrola.

Próbki przechowywano w temperaturze -80 stopni, aby dodatkowo uniknąć hydrolizy. Próbki analizowano dalej metodą HPLC i obliczano pole pod krzywą (przy 210 nm) dla piku wolnego leku. Pole pod krzywą korelowano z ilością uwolnionego leku poprzez wykorzystanie krzywej kalibracyjnej, gdzie znane stężenia wolnej Tesy oznaczono metodą HPLC przy 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com