Koniugat dendrymer-tesaglitazar indukuje zmianę fenotypu mikrogleju i nasila fagocytozę -amyloidu† Część 3

D-Tesa zwiększa ekspresję enzymów odpowiedzialnych za usuwanie białek chorobotwórczych

Enzym rozkładający insulinę (Ide) i metaloproteaza macierzy 9 (MMP9) to enzymy wydzielane przez mikroglej, które degradują zewnątrzkomórkowy -amyloid i -synukleinę.71,72 Leczenie D-Tesa znacznie zwiększyło ekspresję Ide 3.1-krotnie (p < 0.001) z tendencją do zwiększania ekspresji MMP9 (1.8-krotny wzrost, p=0.057) w porównaniu z grupą kontrolną leczoną wyłącznie LPS (ryc. 6A i B).

W ostatnich latach coraz więcej badań wykazało, że istnieje ścisły związek pomiędzy enzymami rozkładającymi insulinę a pamięcią. Odkrycie to dostarcza nam cennych wskazówek do dalszego badania mechanizmu powstawania i utrzymywania pamięci.

Enzym rozkładający insulinę jest ważnym enzymem, którego główną funkcją jest rozkład insuliny w celu utrzymania równowagi poziomu cukru we krwi. Jednak ostatnie badania wykazały, że enzym rozkładający insulinę nie tylko odgrywa rolę metaboliczną, ale także bezpośrednio wpływa na wzrost i naprawę neuronów w mózgu oraz odgrywa ważną rolę w utrzymaniu pamięci.

Wiele badań wykazało, że im wyższy poziom enzymu rozkładającego insulinę, tym lepsza pamięć. Dzieje się tak, ponieważ enzymy rozkładające insulinę mogą promować wzrost i naprawę neuronów, poprawiając w ten sposób zdolność mózgu do uczenia się i zapamiętywania. Ponadto enzymy rozkładające insulinę mogą również promować połączenia między neuronami, poprawiając w ten sposób skojarzenia i zatrzymywanie pamięci.

Ważna rola enzymów rozkładających insulinę w pamięci jest szeroko wykorzystywana w medycynie klinicznej. Naukowcy odkryli, że wdychanie enzymów rozkładających insulinę może nie tylko poprawić pamięć, ale także zdolności poznawcze i złagodzić objawy depresyjne.

Krótko mówiąc, związek między enzymami rozkładającymi insulinę a pamięcią jest bardzo ważną dziedziną, która dostarcza nam cennych wskazówek do badania biologicznego mechanizmu pamięci. Przyszłe badania pozwolą na dalsze zbadanie funkcji i roli enzymów rozkładających insulinę, pomogą nam lepiej zrozumieć mechanizm powstawania i przechowywania pamięci oraz zapewnią lepszą podstawę do poprawy zdolności ludzkiego mózgu do uczenia się i zapamiętywania. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche może również regulować równowagę neuroprzekaźników, takich jak zwiększanie poziomu acetylocholiny i czynników wzrostu, które są bardzo ważne dla pamięci i uczenia się. Ponadto Cistanche może również poprawić przepływ krwi i promować dostarczanie tlenu, co może zapewnić mózgowi wystarczające odżywienie i energię, poprawiając w ten sposób witalność i wytrzymałość mózgu.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę swojej pamięci

Free Tesa znacząco zwiększyła ekspresję Ide 2-krotnie (p=0.011) i nieistotnie zwiększyła MMP92-krotnie (p=0.35) (ryc. 6A i B). Mikroglej M2 w chorobach neurodegeneracyjnych może usuwać -amyloid, -synukleinę i inne białka patogenne poprzez degradację enzymatyczną lub fagocytozę, a D-Tesa zwiększa ekspresję białek biorących udział w tych procesach (tj. Ide i MMP9).71-73

Ideekspresja jest obniżona w patologii AD i PD i wiadomo, że jest zwiększona przez agonistów PPAR, co jest zgodne z naszymi wynikami.

71,72 Funkcjonalnie wykazano, że jedynie 2-krotny wzrost poziomu Ide zmniejsza akumulację amyloidu i śmierć neuronów in vivo.74,75 Dlatego też 3-krotny wzrost poziomu Ide obserwowany przez D-Tesa i 2-krotny wzrost Ide przez freeTesa może być terapeutycznie skuteczny in vivo.

D-Tesa zwiększa fagocytozę -amyloidu

CD36 jest receptorem zmiatającym mikroglej, który ułatwia fagocytozę i degradację amyloidu.73 Jego obniżenie w AD skutkuje zmniejszonym usuwaniem amyloidu, ale jego poziom jest zwiększany przez aktywację PPAR.

Zarówno D-Tesa, jak i wolna Tesa znacząco zwiększyły poziomy ekspresji CD36 w porównaniu z komórkami eksponowanymi wyłącznie na LPS (p < 0.0001 vs. p < 0,005 dla D-Tesa i wolnej Tesa ), ale D-Tesa była znacznie skuteczniejsza niż wolna Tesa (6-krotny wzrost w porównaniu z 2,8-krotnym wzrostem odpowiednio dla D-Tesa i wolnej Tesa, p < 0,0005) (ryc. 6C ).

Nasze wyniki są spójne z wcześniejszymi badaniami z pioglitazonem (innym agonistą PPAR), które wykazały, że zwiększona fagocytoza mikrogleju amyloidu zachodzi poprzez mechanizm zależny od PPAR i CD36-.73

Aby zbadać, czy zwiększenie poziomu CD36 w wyniku leczenia D-Tesatmentem koreluje ze zwiększoną zdolnością fagocytarną tych komórek, przeprowadziliśmy funkcjonalny test fagocytozy amyloidu. 73

W skrócie, po potraktowaniu komórek tak, jak to zrobiliśmy w poprzednich testach in vitro, nałożyliśmy na komórki znakowany fluorescencyjnie -amyloid 1-42 na dwie godziny, przemyliśmy komórki, a następnie przeprowadziliśmy cytometrię przepływową w celu zbadania zakresu wychwytu -amyloidu przez komórki. D-Tesa zwiększyła zarówno odsetek komórek, które fagocytowały β-amyloid, jak i średnią ilość β-amyloidu internalizowanego na komórkę (ryc. 7A i B).

Dla kontrastu, wolna Tesa nie powodowała poprawy w fagocytozie -amyloidu. Lepsze działanie D-Tesa w porównaniu z Tesą można prawdopodobnie przypisać ulepszonej internalizacji komórkowej możliwej dzięki koniugacji dendrymeru.

Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami, które wykazały, że ponad 95% komórek BV2 traktowanych znakowanym fluorescencyjnie G4-PAMAM-OH internalizowało dendrymer w ciągu trzydziestu minut i kontynuowało internalizację dendrymeru przez co najmniej 24 godziny.76

Podobnie koniugacja małocząsteczkowej minocykliny ze znakowanym fluorescencyjnie G4-PAMAM-OH wykazała, że ​​99% komórek BV2 internalizowało znakowany fluorescencyjnie koniugat dendrymer-lek w ciągu 3 godzin.26 Wykazano również, że koniugat znacznie zmniejszał poziom tlenku azotu do wolnego leku po potraktowaniu komórek BV2 LPS, co jest zgodne z naszymi wynikami.

Komórki traktowane D-tesafagocytozą wytwarzały 1,9-krotnie więcej -amyloidu niż komórki kontrolne traktowane LPS (p < 0.001), co jest porównywalne z 2.5-krotnym wzrostem Fagocytoza -amyloidu przez pierwotne komórki mikrogleju szczura leczone pioglitazonem opisana przez Yamanaka i wsp.73 Nieco większy stopień fagocytozy -amyloidu w poprzednim badaniu mógł wynikać albo z tego, że zwierzęta nie traktowały swoich komórek LPS tak jak my, albo z tego, że pierwotny mikroglej wyrażał PPAR w wyższy poziom niż komórki BV2 użyte w tym badaniu.77

W związku z tym dawka D-Tesa niższa niż oszacowana na podstawie eksperymentów in vitro w naszym badaniu może prawdopodobnie być skuteczna w badaniach in vivo i na ludziach, ponieważ wiadomo, że komórki BV2 wyrażają PPAR na niższym poziomie niż pierwotna mikroglej.77

Mikroglej powiązano z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, a BBB zapobiegł osiągnięciu w mózgu poziomów terapeutycznych wielu lekom modyfikującym fenotyp mikrogleju z prozapalnego, neurotoksycznego fenotypu M1 na przeciwzapalny, neuroprotekcyjny fenotyp M2.5,6, 14,15

Na przykład dwóch agonistów PPAR, pioglitazon i rozyglitazon, badano w badaniach klinicznych III fazy dotyczących choroby Alzheimera ze względu na ich zdolność do zmiany fenotypu mikrogleju, ale nie udało się to, prawdopodobnie ze względu na słaby transport przez BBB.13,14 Zatem istnieje zainteresowanie kliniczne zmianą Fenotyp mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Takie podejście wymaga dostarczenia leku do mikrogleju na poziomie wystarczającym do wywołania odpowiedzi. W tym celu wykazano, że dendrymery G4-OH-PAMAM dostarczają leki do mikrogleju w wielu modelach zwierzęcych po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym, w związku z czym są obecnie oceniane w badaniach klinicznych pod kątem leczenia ccTLD (NCT03500627) i ciężkiego przebiegu COVID -19 powiązane zapalenie (NCT04458298).18–28

Aby połączyć korzystne skutki zmiany fenotypu mikrogleju ze zdolnością do dostarczania leków do mikrogleju, skoniugowaliśmy tesaglitazar (PPAR / podwójny agonista) z dendrymerem G4-OH-PAMAM (ryc. 1–3). Wykazaliśmy, że D-Tesa jest zdolna do zmiany fenotypu mikrogleju M1 w stronę fenotypu M2 (ryc. 4 i 5), co skutkuje zmniejszeniem wydzielania szkodliwych reaktywnych form tlenu.

Ponadto wykazaliśmy, że mikroglej traktowany D-Tesą zwiększa ekspresję enzymów degradujących patologiczne białka, takie jak -synukleina i -amyloid, jak również zwiększa fagocytozę -amyloidu w teście funkcjonalnym (ryc. 6 i 7).

Chociaż nie przedstawiamy danych wykazujących zdolność D-Tesa do omijania BBB i akumulacji w mikrogleju, wykazaliśmy wcześniej, że koniugaty leku G4-OH-PAMAM o podobnym obciążeniu lekiem, rozmiarze i potencjale zeta są zdolne do przejścia przez upośledzenie BBB i gromadzenie się mikrogleju po podaniu dożylnym.26,36,52

Wyniki te wspierają dalszy rozwój D-Tesa w leczeniu wielu chorób neurologicznych. Chociaż w tym artykule skupiamy się na chorobach Alzheimera i Parkinsona, D-Tesa ma potencjał w zastosowaniu klinicznym w wielu zaburzeniach neurologicznych. Ze względu na podobną rolę mikrogleju w patologii wielu chorób neurodegeneracyjnych, badano również agonistę PPAR, pioglitazon, lub obecnie badany w badaniach klinicznych II fazy dotyczących choroby Parkinsona78, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS),79 adrenomieloneuropatii (NCT03864523), stwardnienia rozsianego (NCT03109288) i krwiaka rozdzielczość w krwotoku śródmózgowym (NCT00827892).

Jeżeli te badania kliniczne również zawiodą z powodu słabego dostarczania pioglitazonu przez barierę krew-mózg, D-Tesa będzie w stanie pokonać tę przeszkodę w dostarczaniu i leczyć pacjentów cierpiących na te choroby.

Inne grupy wykorzystały nanocząstki w celu usprawnienia dostarczania agonistów PPAR do makrofagów, ale nie próbowały dostarczać tych agonistów do mikrogleju. Osinski i wsp. wykazali, że liposomy obciążone Tesą były w większości wychwytywane przez makrofagi w trzewnym białym tłuszczu w modelu otyłości u mężczyzn z niedoborem leptyny.80

Dodatkowo wykazali, że liposomy obciążone Tesą nie zmieniają ekspresji markera M1 Mcp-1, ale zwiększają ekspresję markera M2 Arg1, podczas gdy leczenie wolną Tesą zmniejsza całkowitą liczbę makrofagów M1 i ekspresję Mcp{{6 }} i nie zwiększyło ekspresji Arg1.

Nakashiro i in. wykorzystano nanocząsteczki poli(kwasu mlekowego i glikolowego) (PLGA) do dostarczania pioglitazonu (agonisty PPAR) do makrofagów w kontekście miażdżycy.81

In vivo wykazali, że PLGA-pioglitazon zmniejsza poziom komórek odpornościowych we krwi. Pierwotne makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddane działaniu LPS i interferonu- wykazały, że PLGA-pioglitazon zwiększał IL-4 i IL-10 (markery M2) i nie zmniejszał poziomów IL-6 ani TNF.

Ich ustalenia są podobne do naszych; Markery M2 wzrosły w wyniku leczenia agonistą nanocząstek-PPAR, podczas gdy poziomy IL-6 i TNF nie spadły. Di Mascolo i in. wykorzystano nanocząsteczki PLGA-alkoholu poliwinylowego do dostarczenia rozyglitazonu (innego agonisty PPAR).82

In vitro wykazali, że ich kompleksy nanocząstki i leku zmniejszają ekspresję iNOS, TNF- i IL-1 w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego. Wstępnie traktowali swoje komórki lekiem nanocząsteczkowym przed stymulacją LPS, podczas gdy my traktowaliśmy komórki LPS przed leczeniem D-Tesą, co mogło być powodem, dla którego nie zaobserwowaliśmy spadku poziomu TNF i IL-1 , chociaż zaobserwowaliśmy również zmniejszenie ekspresji iNOS.

Wniosek

Obecnie nie istnieje terapia zmieniająca patologię wielu chorób neurodegeneracyjnych, a w miarę starzenia się populacji częstość występowania i koszty leczenia tych chorób będą nadal rosły, co uwydatnia pilną potrzebę opracowania rozwiązania. Ostatnio prozapalny mikroglej M1 ma kluczowe znaczenie w patologii wielu chorób neurodegeneracyjnych.

Następnie możliwość dostarczenia leku przez barierę krew-mózg, który może wywołać zmianę fenotypu „M1 na M2” w mikrogleju, ma potencjał terapeutyczny w przypadku wielu chorób, zwłaszcza choroby Alzheimera i Parkinsona.

D-Tesa została zaprojektowana w celu dostarczania leku indukującego „M1 do M2” do mikrogleju po podaniu ogólnoustrojowym w celu zmniejszenia wydzielania substancji neurotoksycznych przez mikroglej, jednocześnie wywołując stan przeciwzapalny, który zwiększa degradację i fagocytozę białek chorobotwórczych w mózgu. Udało nam się zsyntetyzować D-Tesę, stosując wysoce wydajną metodę chemii kliknięć.

Lek jest przyłączony do dendrymeru poprzez wiązanie estrowe, które można rozszczepić wewnątrzkomórkowo w warunkach lizosomalnych, przy czym około 60% Tesa jest uwalniane w ciągu pierwszych 48 godzin w warunkach lizosomalnych.

Wykazano, że D-Tesa jest lepszy od Tesa in vitro w indukowaniu przesunięcia fenotypu M1 do M2a/M2b/M2c, co skutkuje zmniejszonym wydzielaniem tlenku azotu, zwiększoną ekspresją -synukleiny i enzymów rozkładających -amyloid oraz zwiększoną fagocytozą -amyloidu.

Zatem D-Tesa łączy korzystne właściwości dostarczania dendrymeru z właściwościami przełączania M1 do M2 Tesa. Ze względu na wspólną rolę mikrogleju i wspólną korzyść terapeutyczną polegającą na wywoływaniu zmiany fenotypu z M1 na M2, D-Tesa może leczyć wiele zaburzeń neurologicznych, jeśli zostanie podana na właściwym etapie postępu choroby.

Wkład autora

LD, AS, KL, RS, SK i RMK opracowały koncepcję eksperymentów. LD, AS i RS przeprowadziły syntezę i charakterystykę koniugatu dendrymer-lek. LD, KL i JJ przeprowadzili eksperymenty na komórkach. LD i K. L. przeprowadził statystykę. LD i AS napisali manuskrypt, a wszyscy autorzy zredagowali manuskrypt.

Konflikty interesów

RMK i SK są współwynalazcami wykorzystania dendrymeru zakończonego grupą hydroksylową do ukierunkowanego dostarczania do mikrogleju w chorobach neurologicznych, a także patentów związanych z technologią dendrymerów opisaną w tym artykule.

Są współzałożycielami Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. i RiniSight Inc., firm wiodących w rozwoju klinicznym platformy. SK i RMK są członkami zarządu AshvatthaTherapeutics Inc. RS jest obecnie zatrudniony przez AshvatthaTherapeutics i posiada udziały w tej spółce; praca R. S. wystąpił dla tej gazety, zanim dołączył do Ashvattha. Konfliktem interesów zarządza Uniwersytet JohnsHopkins.

Podziękowanie

Chcielibyśmy podziękować Elizabeth Smith Khoury za pomocne dyskusje na temat eksperymentów in vitro. Projekt ten został sfinansowany przez Patz Distinguished Professorship Endowment od JohnsHopkins i NICHD (numer grantu HD076901) (RMK). Dziękujemy firmie Wilmer Core Grant na badania wzroku, mikroskop i moduł podstawowy (numer grantu EY001865) za dostęp do cytometru przepływowego firmy Sony.

Dziękujemy firmie Servier Medical Arts za wykorzystanie ich kolekcji obrazów (http://smart.servier.com/), która jest objęta licencją Creative Common Attribution 3.0 Generic Licence, która została zmodyfikowana w celu utworzenia streszczenia graficznego.

Referencje

1 CL Gooch, E. Pracht i AR Borenstein, Obciążenie chorobą neurologiczną w Stanach Zjednoczonych: raport podsumowujący i wezwanie do działania, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf i K. Zhong, Plan opracowywania leków na chorobę Alzheimera: niewielu kandydatów, częste niepowodzenia, Alzheimer's Res. Tam., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng i J.-S. Kang, Historia i postęp hipotez oraz badań klinicznych dotyczących choroby Alzheimera, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto i S. Pritzkow, Nieprawidłowe fałdowanie białek, agregacja i szczepy konformacyjne w chorobach neurodegeneracyjnych, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry i C. Holmes, Gruntowanie mikrogleju w chorobie neurodegeneracyjnej, Nat. Ks. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang i W. Le, Differential Roles of M1 and M2Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol.,2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter i B. Stevens, Microglia okazują się głównymi graczami w chorobach mózgu, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann i wsp., The TREM2-APOE Pathway Drives theTransscriptional Phenotype of Dysfunction Microglia inNeurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao i wsp., Przeciwdepresyjne działanie pioglitazonu w mysim modelu przewlekłego łagodnego stresu jest powiązane z zmianą fenotypów aktywacji mikrogleju za pośrednictwem PPAR, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen i wsp., Polarization of Microgley to the M2Phenotype in a Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorGamma-Dependent Manner Atenuates Axonal InjuryInduced by Traumatic Brain Injury in Mice, J. Neurotrauma, 2018, 35, 2330–2340.

11 W. Cai i wsp., Receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów (PPAR): Główny strażnik w uszkodzeniach i naprawie OUN, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal i wsp., Stosowanie glitazonu wiąże się ze zmniejszonym ryzykiem choroby Parkinsona, Mov. Nieporządek., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com