Określenie roli odżywiania w starzeniu się skóry

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

Abstrakcyjny:Ciekawym tematem badawczym stał się wpływ diety na starzenie się skóry. Wcześniejsze badania skupiały się głównie na korzystnym wpływie peptydów kolagenowych pochodzących z organizmów morskich na starzejącą się skórę przy podawaniu doustnym, podczas gdy korzystny wpływ peptydów kolagenowych pochodzących z drobiu na starzejącą się skórę był rzadko opisywany. W tym badaniu peptydy kolagenowe otrzymywano z kości kurczaka metodą hydrolizy enzymatycznej oraz badano wpływ i mechanizm działania peptydów kolagenowych podawanych doustnie na łagodzenie starzenia się skóry indukowane promieniowaniem UV w połączeniu z D-galaktozą. Wyniki wykazały, że kolagen z kości kurczaka miał typowe cechy kolagenu, a peptydy kolagenowe kości kurczaka (CP) były głównie peptydami drobnocząsteczkowymi o masie cząsteczkowej<3000 da.="" in="" vivo="" experiments="" showed="" that="" cps="" had="" a="" significant="" relieving="" effect="" on="" aging="" skin,="" indicated="" by="" the="" changes="" in="" the="" compostion="" and="" structure="" of="" the="" aging="" skin,="" improvement="" of="" skin="" antioxidant="" level,="" and="" inhibition="" of="" inflammation;="" the="" relieving="" effect="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps.="" further="" investigation="" showed="" that="" cps="" first="" reduce="" the="" level="" of="" skin="" oxidation,inhibit="" the="" expression="" of="" the="" key="" transcription="" factor="" ap-1(c-jun="" and="" c-fos),="" then="" activate="" the="" tgf-β/smad="" signaling="" pathway="" to="" promote="" collagen="" synthesis,="" inhibit="" the="" expression="" of="" mmp-1/3="" to="" inhibit="" collagen="" degradation,and="" inhibit="" skin="" inflammation="" to="" alleviate="" skin="" aging="" in="" mice.="" moreover,="" the="" skin="" transcriptome="" found="" that="" lysosomes="" activated="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" may="" be="" an="" important="" pathway="" for="" cps="" in="" anti-skin="" aging,="" and="" is="" worthy="" of="" further="" research.="" these="" results="" suggested="" that="" cps="" might="" be="" used="" as="" a="" functional="" anti-aging="" nutritional="">

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Słowa kluczowe:peptydy kolagenowe; przeciw starzeniu; transkryptom skóry;synteza kolagenu;lizosomy

1. Wstęp

Era zdrowia, dokładne przestrzeganie zdrowej diety, określenie roli żywienia w procesie starzenia się skóry oraz decydowanie o tym, co jeść, aby zachować młodą i zdrową skórę to trudne problemy. Skóra jest największym organem ciała, składającym się z naskórka, skóry właściwej i warstwy podskórnej. Działa jako bariera chroniąca organizm przed czynnikami zewnętrznymi, a także odgrywa rolę w zdrowiu i urodzie[1. Starzenie się skóry to złożony proces, który dzieli się na starzenie chronologiczne i fotostarzenie, na który mają wpływ zarówno czynniki wewnętrzne, jak i zewnętrzne.łodyga cistancheGłówne cechy to nagromadzenie uszkodzeń makromolekularnych w komórce, pogorszenie funkcji komórek macierzystych (wspomaganie odnowy tkanek) oraz stopniowa utrata integralności fizycznej skóry [2]. Główne mechanizmy molekularne powodujące starzenie się skóry to przede wszystkim stres oksydacyjny, skracanie telomerów, uszkodzenia DNA, mutacje genetyczne, regulacja mikroRNA, zaawansowana akumulacja produktów końcowych glikacji i starzenie zapalne 3]. Fotostarzenie to przerost naskórka skóry, wysuszenie i degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej wywołana promieniowaniem ultrafioletowym. Główną przyczyną fotostarzenia są reaktywne formy tlenu (ROS) generowane przez promieniowanie ultrafioletowe, które pośredniczą w ekspresji metaloproteinaz macierzy (MMP) i prokolagenu typu I poprzez szlaki sygnałowe, takie jak sygnalizacja kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK). szlaku prowadzącego do degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w skórze i apoptozy fibroblastów [4]. W ostatnich latach popularne stało się utrzymywanie zdrowia skóry i opóźnianie starzenia, a poszukiwanie naturalnych składników, takich jak bioaktywne peptydy i polifenole o działaniu przeciwutleniającym i przeciwstarzeniowym, stało się gorącym punktem badań [5].

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Kolagen ma jednak dużą masę cząsteczkową i jest trudny do bezpośredniego wchłonięcia i wykorzystania, podczas gdy drobnocząsteczkowe peptydy kolagenowe po hydrolizie kolagenu wykazują silniejszą aktywność biologiczną i wysoki współczynnik wchłaniania [6]. Tymczasem szerokie zastosowanie kolagenu w żywności, medycynie, inżynierii tkankowej, kosmetykach i innych dziedzinach sprawiło, że peptydy kolagenowe o niższej masie cząsteczkowej, wyższej wydajności wchłaniania i silniejszej aktywności biologicznej stały się nowym faworytem w żywności funkcjonalnej i badaniach medycznych [{{1 }}]. Peptydy kolagenowe są niewielkie i zawierają 2-20 reszty aminokwasowe uzyskane po hydrolizie kolagenu. Są stosowane jako suplement diety w leczeniu starzenia się skóry ze względu na ich potencjalne działanie przeciwzapalne i antyoksydacyjne oraz regulację immunologiczną i działanie antyoksydacyjne i proliferacyjne na fibroblasty skóry [10].

Po podaniu doustnym peptydy kolagenowe są wchłaniane w postaci małych peptydów i szybko transportowane do krwi, a ostatecznie do nerki, skóry, stawów i innych tkanek, gdzie mają być przechowywane i wykorzystywane. Po 14 dniach poziomy radioaktywności pozostawały wysokie w skórze myszy, którym podano peptydy kolagenowe znakowane C14-.korzyści i skutki uboczne cistanche tubulosaPeptydy kolagenowe mogą być prawie całkowicie wchłonięte i wykorzystane przez organizm, podczas gdy szybkość wchłaniania i wykorzystania kolagenu wynosi tylko 50-60 procent [6,11-13]. W ostatnich latach powszechnie donoszono, że hydrolizaty kolagenu ze skóry ryb, łuski ryb, kości krów, skóry krowy i skóry świń mają korzystny wpływ na łagodzenie starzenia się skóry i cieszą się dużą uwagą badaczy. Na przykład peptydy kolagenowe wyizolowane ze skóry karpia srebrnego promują syntezę prokolagenu i hamują ekspresję białek AP-1, MMP-1 i MMP-3 poprzez aktywację szlaku TGF-/Smad aby zapobiec degradacji kolagenu i naprawić fotostarzenie się komórek skóry [14]. Doustne podawanie peptydów kolagenu bydlęcego może poprawić rozluźnienie skóry, zwiększyć zawartość kolagenu i aktywność enzymów antyoksydacyjnych, naprawić włókno kolagenowe i normalizować stosunek kolagenu w skórze u starzejących się myszy [15]. Jednak peptydy kolagenowe z różnych źródeł mają różne działanie. Ilość i struktura wysoce aktywnych peptydów we krwi po doustnym podaniu peptydów kolagenowych zależy od źródła kolagenu [10]. Ochronne działanie peptydu kolagenowego wyekstrahowanego ze skóry kur przed uszkodzeniem fibroblastów wywołanym przez UVA było lepsze niż peptydu kolagenowego wyekstrahowanego ze skóry świni, krowy lub tilapii, a jego działanie było równoważne z tripeptydem pochodzącym z kolagenu (Gly-Pro -Hyp)[16].

Przekonania religijne i obawy dotyczące chorób (takich jak choroba szalonych krów) skłoniły ludzi do stopniowej zmiany kierunku rozwoju kolagenu i jego produktów ze ssaków lądowych na drób i organizmy morskie|17I. Jako główny produkt uboczny przetwórstwa drobiu, kurczaki kość jest obiecującym źródłem produktów kolagenowych. Nie tylko ogranicza marnotrawstwo zasobów i zanieczyszczenie środowiska, ale także pozwala na efektywne wykorzystanie produktów ubocznych. Dlatego w tym badaniu wykorzystaliśmy peptydy kolagenowe z kości kurczaka jako surowce, z nagimi myszami traktowanymi D-galaktozą i UV w celu wywołania starzenia się skóry, jako model do oceny wpływu doustnego podawania peptydu kolagenowego na łagodzenie starzenia się skóry w myszy i określić odpowiedni mechanizm.

2. Materiały i metody

2.1.Materiały, chemikalia i zwierzęta

Farmy kurcząt Uniwersytetu Rolniczego w Yunnan (Kunming, Chiny) dostarczyły zużyte kury, które zostały oddzielone, wysuszone i rozdrobnione w celu uzyskania mączki z kości kurczaka. Zestawy dysmutazy nadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT) i peroksydazy glutationowej (GSH-PX) zakupiono z firmy Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Pekin, Chiny). Hydroksyprolina (HYP), interleukina-1 (IL-1x), metaloproteinaza macierzy-1/3 (MMP-1/3), prokolagen typu I, kwas hialuronowy Zestawy (HA) immunoenzymatycznych testów (ELISA) zakupiono z Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Chiny). Zdrowe samice bezwłosych myszy BALB/C (18±2g, sześciotygodniowe) zakupiono od Nanijing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, Chiny) z numerem zezwolenia: SCXK(SU)2016-0010.ekstrakt z kanalików cistanchePepsynę i papainę zakupiono od Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny), a inne chemikalia miały czystość analityczną. Wszystkie myszy były traktowane zgodnie z Regulaminem Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi prowincji Yunnan i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania przy Uniwersytecie Rolniczym w Yunnan (ID zatwierdzenia: YAUACUC01).

2.2. Przygotowanie kolagenu i skład aminokwasów

Ekstrakcja i skład aminokwasowy kolagenu z kości kurczaka przebiegały zgodnie z metodą opisaną przez Liuet al. [18]z niewielkimi modyfikacjami. Proszek z kości kurczaka wymieszano i namoczono w 0.05 M NaOH, 10 procentach n-heksanu i 0.25 M roztworze EDTA (pH 7,5 ) w stosunku 1/1 0 (m/o). Na każdym etapie próbkę poddano obróbce przez 36 godzin, a roztwór do namaczania zmieniano co 6 godzin w celu spęcznienia proszku kostnego, usunięcia białek niekolagenowych, tłuszczu i minerałów z proszku kostnego. Po każdym etapie próbkę przemywano czystą wodą do neutralności. Wstępnie potraktowaną mączkę z kości kurczaka zmieszano z 0,5 M lodowatym kwasem octowym zawierającym 0,1 procent (wag./obj.) pepsyny w stosunku ciała stałego do cieczy 1:10 (wag./obj.) i ciągle mieszano i ekstrahowano w 4 stopniach przez 48 godz. Następnie przesączono i przesącz odwirowano przy 15,000 xg przez 15 min w 4 stopniach. pH supernatantu doprowadzono do 7,5-7,8 roztworem NaOH i dodano NaCl do końcowego stężenia 1,5 M. Po tym, jak mieszaninę pozostawiono w spokoju przez 12 godzin w temperaturze 4°C w celu wysalania, kolagen Osad odwirowano przy 15 000 xg przez 15 min w 4 stopniach, następnie rozpuszczono w 0,5 M kwasie octowym, dializowano w czystej wodzie, liofilizowano, a końcowym produktem był kolagen z kości kurczaka.

Skład aminokwasowy kolagenu z kości kurczaka oznaczono automatycznym analizatorem aminokwasów Sykam S433D (Monachium, Niemcy). Pewną ilość próbki kolagenu do badania pobrano do szczelnie zamkniętej probówki, dodano 10 mL6 M HCl i hydrolizowano w 110°C przez 24 godziny. Hydrolizat zatężono przez przedmuchiwanie azotem i ponownie rozpuszczono w 20 ml buforu kwasu cytrynowego. Po mikrofiltracji przez 0,22 um mikroporowatą membranę, pobrano 20 µl hydrolizatu do analizy widma aminokwasów. Zawartość aminokwasów w próbce wyrażono w procentach.

2.3. Przygotowanie i rozkład masy cząsteczkowej peptydów kolagenowych (CP)

Zgodnie z wynikami naszego poprzedniego procesu optymalizacji, CP zostały przygotowane przy użyciu papainy w stosunku enzym-substrat wynoszącym 1:40 (stosunek masowy). Po dostosowaniu pH do 7 i hydrolizie enzymatycznej w 63 stopniach przez 5 h, enzym inaktywowano we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min. Hydrolizat enzymu odsolono i liofilizowano, ponownie rozpuszczono w 0,1% roztworze kwasu mrówkowego i odwirowano w celu uzyskania supernatantu. AQ Exactive HF Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometer-QE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), wyposażony w jonizację elektrorozpylania (ESI, został użyty do analizy hydrolizatu kolagenu w trybie pełnego skanowania 350-1800 m /z, a wyniki pobrano i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania Proteome Discoverer 2.1.

2.4.Test na zwierzętach

Samice bezwłosych myszy BALB/C (n{{0}}) trzymano w pomieszczeniu w kontrolowanych warunkach temperatury (24±1 stopień), wilgotności (60 ±5 procent) i 12-godzinny cykl dzień-noc przez tydzień. Otrzymywali ad libitum dostęp do pożywienia i wody. Po tygodniu adaptacji myszy losowo podzielono na następujące pięć grup (n=11 na grupę):(i). Grupa normalna (N): nienaświetlona promieniowaniem UV; doustne podawanie 0,4 ml soli fizjologicznej na dobę. (ii). Grupa modelowa (M): ekspozycja na promieniowanie UV plus D-galaktoza (0,2 ml); doustne podawanie 0,4 ml soli fizjologicznej dziennie.

(i). Grupa peptydów kolagenowych o niskiej dawce (LCP): eksponowana na UV plus D-galaktoza (0,2 ml); doustny

podawanie 0,4 ml CPs (dawka: 200 mg:kg-1 masy ciała) dziennie.

(iv). Grupa peptydów kolagenowych o średniej dawce (MCP): ekspozycja na promieniowanie UV plus D-galaktoza; doustnie

podawanie 0,4 ml CP (dawka: 500 mg·kg-1 masy ciała) na dobę.

(v). Grupa wysokodawkowych peptydów kolagenowych (HCP): eksponowana na promieniowanie UV plus D-galaktoza; administracja ustna-

dawka 0,4 ml CP (dawka: 1000 mg kg-1 masy ciała) dziennie.

Leczenie D-galaktozą przeprowadzono przez podskórne wstrzyknięcie 0,2 ml 10 procentowego roztworu D-galaktozy w kark myszy (dawka:1.0g/ kg-1masy ciała) dziennie. Napromienianie UV przeprowadzono za pomocą 40 W UVA -340 LAMIP (O-panel, Cleveland, USA, szczytowa długość fali: 340 nm), odległość między lampą a grzbietem myszy wynosiła 30 cm (230 m J/cm -), a naświetlanie trwało 30 minut codziennie przez siedem tygodni (49 dni). Intensywność promieniowania mierzono za pomocą radiometru UVA365- (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Chiny). Godzinę po traktowaniu D-galaktozą i UV myszom podawano doustnie codziennie 0,4 ml CPs. Po ostatnim napromieniowaniu myszy znieczulono, zważono i pobrano próbki tkanek do dalszej analizy.

2.5. Nawilżenie skóry, wskaźnik trzewny i przyrost masy ciała

Wilgotność skóry określono zgodnie z ISO 1442, a wskaźnik trzewny obliczono stosując następujące równanie: wskaźnik trzewny (g/kg)= masa trzewna/masa ciała.

2.6. Stres oksydacyjny, zawartość HA i HYP w skórze

Próbki skóry homogenizowano dziewięciokrotnie większą ilością soli fizjologicznej (wagowo) w łaźni lodowej z homogenizatorem tkanek (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, Chiny), a następnie odwirowano w 2000 ×g i 4 stopnie przez 10 min. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT) i peroksydazy glutationowej (GSH-PX) oraz zawartość kwasu hialuronowego (HA) i hydroksyproliny (HYP) w zebranym supernatancie oznaczono metodą opisaną w instrukcje odpowiadające odpowiednim zestawom.

2.7.Histologiczne skóry

Próbki skóry myszy utrwalano w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny, odwadniano, zatapiano w parafinie i krojono na plasterki. Skrawki skóry wybarwiono hematoksyliną i eozyną (HE) i obserwowano za pomocą przedniego mikroskopu fluorescencyjnego ECLIPSE CI-E (Nikon, Japonia). Grubość naskórka i skóry właściwej oceniano za pomocą oprogramowania Halcon 13.0.1.1 (MVTec, Monachium, Niemcy).

2.8. Sekwencjonowanie transkryptomu skóry

2.8.1. Ekstrakcja RNA, konstrukcja biblioteki i sekwencjonowanie transkryptomu

Całkowity RNA wyekstrahowano ze skóry myszy przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Tiangen Bio-chemical Technology Co., Ltd., Pekin, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta. Czystość i stężenie RNA sprawdzano przy użyciu spektrofotometru kaiaoK5500 (Kaiao, Pekin, Chiny); Integralność RNA oceniano przy użyciu zestawu RNA Nano 6000 Assay Kit i systemu Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Analiza sekwencjonowania transkrypcji każdej próbki została przeprowadzona przez Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Chiny). W skrócie, grupowanie próbek z kodowaniem indeksowym przeprowadzono w systemie generowania klastrów cBot przy użyciu zestawu HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(llu-mina) zgodnie z instrukcjami producenta. Po wygenerowaniu klastrów biblioteki zsekwencjonowano na platformie Ilumina i wygenerowano odczyty o długości 150 bp sparowanych końców.

2.8.2. Bioinformatyczne analizy danych sekwencjonowania RNA

Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes (KEGG) Analiza wzbogacania genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) została przeprowadzona przy użyciu pakietu analizatora klastrów języka R. Gdy wartość p była mniejsza niż 00,05, pozycje i ścieżki wzbogacone przez GO i KEGG uznano za istotne.

2.8.3. Reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy-polimerazy (qRT-PCR)

QRT-PCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [19].

2.9. Zachodnia plama

Zgodnie z metodą opisaną przez Park et al. [20], przeprowadzono analizę Western blot (WB) w celu ilościowej oceny ekspresji białek związanych ze starzeniem się skóry u myszy. Stężenie lizatu skórnego w każdej grupie określono ilościowo za pomocą zestawu BCA, oddzielonego przez SDS-PAGE (10-procentowy żel akryloamidowy), przeniesionego na membranę PVDF, zablokowanego 5% odtłuszczonym mlekiem i inkubowanego z odpowiednią ilością pierwotnego przeciwciała (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 i -aktyna) w 4 stopniach przez noc. Po przemyciu TBST próbki zmieszano z przeciwciałami drugorzędowymi i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.opinie o cistanche tubulosaDo wykrywania określonych białek użyto urządzenia ChemiDoc XRS plus do obrazowania żelu chemiluminescencyjnego (BioRAD, Hercules, CA, USA). Image] do ilościowej oceny ekspresji białka docelowego w każdej leczonej grupie, a wyniki reprezentowane były przez wartości gęstości znormalizowane do białka -aktyny.

2.10.ELISA

Poziomy ekspresji MMP-1, MMP-3, prokolagenu typu I i IL-1& w płynie lizującym skórę określono za pomocą immunoenzymatycznego testu immunologicznego. Test przeprowadzono zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem.

2.11.Analizy statystyczne

Wszystkie wyniki zostały przeanalizowane przy użyciu oprogramowania SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, USA) za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) i testu wielozakresowego Duncana, przy poziomie istotności ustawionym na p<0.05. originpro="" 2017(originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" deviation="">

3. Wyniki i dyskusja

3.1. Skład aminokwasowy kolagenu

Skład aminokwasowy kolagenu z kości kurczaka przedstawiono w tabeli 1. Gly był głównym aminokwasem w próbkach, co stanowiło prawie jedną trzecią (27,86 procent) wszystkich aminokwasów, a Hyp był specjalny aminokwas w kolagenie, stanowiący 9,83 procent. Głównymi cechami cząsteczek kolagenu były powtarzające się sekwencje Gly-XY i unikalna struktura potrójnej helisy złożona z trzech łańcuchów. Gly stanowił około jednej trzeciej wszystkich aminokwasów, X i Y często były proliną i hydroksyproliną lub mogły być dowolną resztą [21]. Skład aminokwasowy próbki był podobny do opisanego we wcześniejszych badaniach kolagenu z kości kurczaka i miał typowe cechy kolagenu [22].

3.2. Rozkład masy cząsteczkowej CP

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da (Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da, 65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 procent). Jednak niemiecka firma Gelita wykazała w kilku badaniach klinicznych, że wpływ peptydów kolagenowych jest determinowany głównie przez ich stopień dopasowania do właściwości peptydów kolagenowych po degradacji ludzkiego kolagenu, a nie od masy cząsteczkowej peptydów kolagenowych. Odkryli, że produkt VERISOL③ o średniej masie cząsteczkowej 2000 Da ma najbardziej stymulujący wpływ na fibroblasty skóry, podczas gdy produkt FortigelTM o średniej masie cząsteczkowej 3000 Da ma szczególny wpływ na naprawę chrząstki [25-27].

3.3. Wpływ CP doustnych na łagodzenie starzenia się skóry

3.3.1. Masa ciała i indeks narządów

Wskaźnik masy ciała i wskaźnik narządu są ważne i odzwierciedlają stan zdrowia myszy. Masa myszy w każdej grupie wzrastała normalnie podczas okresu testowego (Tabela 2). Średni przyrost masy ciała w grupie M był niższy niż w grupie N, a w grupach leczonych CP był wyższy niż w grupie M, co sugeruje, że CP nie miały skutków ubocznych u myszy. W poprzednich doniesieniach dawka u myszy leczonych peptydem kolagenowym wynosiła głównie między 100-1000 mg/kg.bw.d, a bezpieczna dawka peptydów kolagenowych tilapia osiągnęła 4,07 g/kg.bw.d [{{6} }]. Podobnie wzrost myszy w wieku skórnym po zgłębniku peptydami kolagenowymi z łuski tilapii (dawki: 500 i 1000 mg/kg mc. d.) był również podobny do naszych wyników [29]. Śledziona odgrywa ważną rolę w odporności humoralnej i komórkowej, dlatego indeks śledziony jest często używany do oceny funkcji układu odpornościowego.cistanche w Wielkiej BrytaniiThe liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups (p >0.05). Wyniki były podobne do poprzednich badań [30], wskazując, że CP są bezpieczne i mogą nieznacznie poprawić odporność myszy.

3.3.2. Skład skóry

Terapia UV i D-galaktozą (grupa M) znacząco zmniejszyła zawartość wilgoci, HA i Hyp w skórze w porównaniu z grupą N, odpowiednio o 13,36 procent, 24,08 procent i 15,83 procent (p<0.05)(table 2).="" the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Zmiany zawartości wilgoci w skórze powodują zmarszczki i zwiotczenie skóry, na które mają wpływ składniki macierzy, takie jak kolagen skóry i HA [31]. Hydroksyprolina jest stabilnym, bogatym i specjalnym aminokwasem w kolagenie, a jej zawartość może pośrednio odzwierciedlać zawartość kolagenu w skórze, a także starzenie się skóry. Dodatkowo ważną rolę odgrywa HA, który jest silnie wyrażany w ECM skóry w kontrolowaniu bilansu wodnego skóry, ciśnienia osmotycznego, retencji wilgoci i elastyczności jako systemu magazynowania wody i składnika strukturalnego skóry [32]. W tym badaniu zawartość wilgoci, HYP i HA w skórze znacznie wzrosła po spożyciu CP, co może być związane z promocją syntezy kolagenu i HA przez CP. Ponadto wzrost HYP i HA zwiększał zawartość wilgoci.

3.3.3. Zmiany histologiczne skóry

Zmiany histologiczne skóry grzbietu myszy po siedmiu tygodniach ciągłego leczenia przedstawiono na rycinie 2. Starzejąca się skóra grupy M wykazywała cechy szorstkiej powierzchni, pogrubionego naskórka, ścieńczonej skóry właściwej i rzadkich komórek, w porównaniu ze skórą grupa N. Jednak stan starzejącej się skóry u myszy poprawił się po doustnym podaniu CP, zachowując gładką, uporządkowaną i kompletną strukturę podobną do tej u myszy z grupy N. Tym samym skóra właściwa była istotnie cieńsza, a naskórek istotnie grubszy w grupie M niż w grupie N (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously="" [4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" in="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Poziomy przeciwutleniaczy i stanów zapalnych skóry

Oznaczanie aktywności enzymów antyoksydacyjnych jest najczęściej stosowaną metodą oceny poziomu antyoksydantów w organizmie [28]. Jak pokazano na rycinie 3, aktywności CAT, SOD, GSH-Px i zawartości MDA w grupie M były znacznie niższe niż w grupie N (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-pxactivities,and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,="" and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activate="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrixcollagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Dodatkowo komórkowa odpowiedź zapalna wywołana przez ROS również przyczynia się do starzenia się skóry. Po leczeniu UV i D-galaktozą (grupa M) zawartość IL-lo w skórze myszy znacznie wzrosła w porównaniu z grupą N (ryc. 3D ), wskazując, że skóra wykazała znaczną odpowiedź zapalną (p<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05),indicating that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the'o,="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Mechanizm działania dietetycznych CP w łagodzeniu starzenia się skóry

3.4.1.Analiza i walidacja danych RNA-Seq

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GOenrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A) and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B). The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group (Figure 4A,B). Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs,4303 genes were significantly expressed in the mice skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" sixgenes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes="" (including="" fos,="" jun,="" cxcll,and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated="" (figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

Analiza GOenrichment i analiza wzbogacenia bazy danych KEGG zapewniły wsparcie dla dalszych badań biologicznych funkcji DEG. Analiza GO wykazała, że ​​DEG były znacznie wzbogacone w procesy biologiczne, takie jak replikacja DNA, regulacja hemopoezy, regulacja aktywności hydrolazy i produkcja cytokin; w składnikach komórkowych, które obejmowały wakuolę lityczną i lizosom, znacznie wzbogacono geny zawierające kolagen i inne pokrewne; pod względem funkcji molekularnej, aktywność receptor-ligand, aktywność cytokin i inne pokrewne geny zostały znacznie wzbogacone (rysunek 5). Analiza wzbogacenia KEGG pierwszych 20 szlaków sygnałowych istotnie zmienionych przez DEG jest pokazana na Ryc.<05) were="" closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" or-ganelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" diferentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors[40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging[14].="" gene="" functional="" enrichment="" anal-ysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41].="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Weryfikacja mechanizmu działania CP w łagodzeniu starzenia się skóry

Aby zweryfikować rolę szlaku sygnalizacyjnego TGF i interakcji cytokina-receptor w łagodzeniu starzenia się skóry przez doustne CP, przeprowadzono analizę WB w celu zweryfikowania TGF- i czynnika transkrypcyjnego Smad2/3 w ścieżce sygnalizacyjnej TGF-, a także kluczowego czynnik transkrypcyjny AP-1 (c-Fos i c-Jun), który reguluje cytokiny. Zawartość MMP-1, MMP-3, prokolagenu typu I i IL-1 oznaczono metodą ELISA. Wyniki analizy WB wykazały, że ekspresja TGF- , Smad2 i Smad3 w grupie M była istotnie niższa niż w grupie N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner(figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" mgroup="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp="" group=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

Białko AP-1 jest dimerycznym kompleksem białek z rodziny Jun i Fos i jest ważnym regulatorem zapalenia skóry i ekspresji cytokin. Ogólnie kompleks złożony z c-Jun i c-Fos wykazuje największą aktywność transkrypcyjną w skórze [41,A42]. ROS produkowane w starzejących się komórkach skóry najpierw aktywują białko AP-1, a następnie regulują dalsze cytokiny (takie jak IL-1), MMP i szlak sygnałowy TGF poprzez transkrypcję i translację, ułatwiając w ten sposób starzenie się skóry[43 ,44]. Reakcja sygnalizacyjna TGF-/Smad jest klasycznym szlakiem syntezy kolagenu, a czynnik transkrypcyjny Smad jest rdzeniem tego szlaku przekazywania sygnału. TGF- wyzwala fosforylację i aktywację dalszych Smad2 i Smad3 poprzez wiązanie się z receptorem, zwiększając w ten sposób syntezę COLI [14].

Ponadto wyniki testu ELISA wykazały, że zawartość MP-1,MMP-3 i IL-1a w skórze w grupie M była znacznie wyższa niż w grupie N, a zawartość prokolagenu Typel była istotnie niższa (p<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,mmp-3,and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1o="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Oprócz powyższych ścieżek, w tym badaniu, geny regulowane w górę po leczeniu CP zostały znacząco wzbogacone w szlak lizosomowy, co wskazuje, że leczenie CP aktywowało lizosom w skórze (Figura 5). Wcześniejsze badania wskazują, że aktywowane lizosomy oczyszczają agregaty i podnoszą aktywację starzejących się nerwowych komórek macierzystych podczas starzenia [45]. Oprócz tego zwiększona funkcja lizosomu może zmniejszyć stężenie wewnątrzkomórkowych ROS, aby zapobiec uśpieniu komórek. Podobnie, każde zmniejszenie funkcji lizosomów może zwiększyć wewnątrzkomórkowe stężenie ROS, które ostatecznie promuje uśpienie komórek. CP, aby złagodzić starzenie się skóry, a my będziemy nadal dążyć do ich weryfikacji.

Dlatego to badanie wykazało, że dietetyczne CP mogą złagodzić starzenie się skóry wywołane przez UV i D-galaktozę w sposób zależny od dawki. CP łagodzą starzenie się skóry poprzez obniżenie poziomu utleniania skóry, hamując ekspresję kluczowych czynników transkrypcyjnych AP-1(c-Jun i c-Fos), aktywując szlak sygnałowy TGF-/Smad w celu promowania syntezy kolagenu, hamując ekspresję MMP-1 i MMP-3 (które hamują degradację kolagenu) oraz hamują stany zapalne skóry w celu złagodzenia starzenia się skóry (ryc. 8). Ponadto nasze odkrycia w bieżącym badaniu sugerują również, że aktywowany lizosom może być ważny szlak dla CP w regulacji starzenia się skóry, który zasługuje na szczególną uwagę.

4. Wnioski

Podsumowując, badanie to potwierdziło, że suplementacja peptydów kolagenowych z kości kurczaka może znacząco złagodzić starzenie się skóry wywołane promieniowaniem ultrafioletowym i D-galaktozą poprzez wiele ścieżek, które obejmują promowanie syntezy prokolagenu, hamowanie degradacji kolagenu, poprawę poziomu antyoksydantów w skórze, i hamowanie stanu zapalnego; złagodzenie było zależne od dawki w przypadku CP. Szczegółowe badania wykazały, że CP najpierw obniżają poziom utleniania skóry, hamują ekspresję kluczowego czynnika transkrypcyjnego AP-1(c-Jun i c-Fos), a następnie aktywują szlak sygnałowy TGF-/Smad, aby promować syntezę kolagenu, hamują ekspresję MMP-1 i MMP-3, aby hamować degradację kolagenu i hamować stany zapalne skóry, aby złagodzić starzenie się skóry u myszy. Ponadto aktywacja lizosomów może być również główną ścieżką dla CP w celu złagodzenia starzenia się skóry, co jest warte dalszych badań i weryfikacji. Wyniki te dostarczają teoretycznej podstawy do zastosowania peptydów kolagenowych w łagodzeniu starzenia się skóry i poszerzają zakres wszechstronnego wykorzystania produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego w żywności funkcjonalnej.

Ten artykuł pochodzi z Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients