Suplementacja diety arsenem indukuje stres oksydacyjny poprzez hamowanie czynnika jądrowego związanego z erytroidem 2-czynnikiem 2 w wątrobie i nerkach kur niosek

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ABSTRAKCYJNY

W badaniu tym zbadano wpływ suplementacji diety arszenikiem na wydajność nieśności, jakość jaj, histopatologię wątroby i nerek oraz stres oksydacyjny w wątrobie inerki kur niosek. Ponadto zbadano szlak białka 1 (Keap1) związanego z czynnikiem jądrowym czynnika erytroidalnego {{0}} związanego z czynnikiem 2 (Nrf2)-Kelch-podobnym ECH, aby ujawnić mechanizm molekularny stresu. Pięćset dwanaście 40-tygodniowych kur niosek Hyline White zostało losowo przydzielonych do 4 grup z 8 kojcami w grupie i 16 kurami w kojcu. Dawki arsenu podawane 4 grupom wynosiły 0,95, 20,78, 40,67 i 60,25 mg/kg. Wyniki wykazały, że suplementacja arsenu w diecie znacząco zmniejszyła produkcję jaj kurzych (P 0.05), średnią masę jaja (P 0,05), jednostki Haugha (P 0,05), wysokość białka (P 0,05) , oraz wytrzymałość skorupki jajka (P, 0,05). Suplementacja diety arszenikiem wywoływała również akumulację arszenikowych i histopatologicznych uszkodzeń w wątrobie inerka. Zgodnie z tym, suplementacja arsenu w diecie znacząco wzmocniła aminotransferazę alaninową w surowicy (P, {{0}}.05), aminotransferazę asparaginianową (P, 0.05) , poziom azotu mocznikowego we krwi (P, {{10}}.05) i kwasu moczowego (P, 0.05). Po ekspozycji na arsen aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) (P < 0,05),="" katalazy="" (p="">< 0,01),="" reduktazy="" glutationowej="" (p="">< 0,05),="" peroksydazy="" glutationowej="" (p="">< 0,05)="" i="" zawartości="" glutationu="" (p="">< 0,05)="" były="" istotnie="" obniżony,="" podczas="" gdy="" poziom="" dialdehydu="" malonowego="" był="" znacząco="" podwyższony="" (p,="" 0,05)="" w="" wątrobie="" i="" nerkach.="" dodatnie="" korelacje="" wystąpiły="" między="" aktywnością="" enzymów="" antyoksydacyjnych="" a="" ekspresją="" genów="" enzymów="" antyoksydacyjnych="" w="" wątrobie="" i="" nerkach,="" z="" wyjątkiem="" ekspresji="" genu="" nerkowej="" dysmutazy="" ponadtlenkowej="" manganu="" i="" aktywności="" sod.="" dodatkowo,="" ekspresja="" mrna="" nrf2="" w="" wątrobie="" i="" nerkach="" była="" dodatnio="" skorelowana="" z="" ekspresją="" genu="" antyoksydacyjnego="" i="" ujemnie="" skorelowana="" z="" ekspresją="" mrna="" keap1.="" podsumowując,="" suplementacja="" diety="" arszenikiem="" indukowała="" stres="" oksydacyjny="" poprzez="" hamowanie="" szlaku="" nrf2-keap1="" w="" wątrobie="" i="" nerkach="" kur="">

Słowa kluczowe:arsen, kura nioska, Nrf2-ścieżka Keap1, stres oksydacyjny, nerki

WPROWADZANIE

W ostatnich latach stwierdzono, że zagrożenia dla środowiska występują w rosnących stężeniach. Arszenik jest silnie metaloidalną substancją toksyczną, nawet w bardzo niskim stężeniu w paszy dla drobiu. Jej fizjologiczna rola u drobiu jest dobrze zdefiniowana, ponieważ jest niezbędna do syntezy metabolitów metioniny, w tym cysteiny. Zalecane stężenia arsenu w paszach dla drobiu wynoszą od {{0}}0,012 do 0,050 mg/kg (Balos et al., 2019). Jednak wcześniejsze badanie wykazało, że stężenia arsenu w paszach dla drobiu są prawdopodobnie poza poziomami tolerancji zwierząt, gdy pasza dla drobiu zawiera wodorosty morskie, węglan miedzi, pentahydrat siarczanu miedzi, triwodorotlenek chlorku miedzi lub węglan żelaza (Adamse et al., 2017). . Kazi i in. (2013) stwierdzili, że istnieje duże prawdopodobieństwo, że arsen zawarty w paszach dla drobiu wpływa na zdrowie kurcząt brojlerów. Nadmierne ilości arsenu w paszach dla drobiu i jego toksykologiczny wpływ na drób nadal stanowią poważny problem. Gdy nadmiar arsenu dostanie się do zwierzęcia, może wywołać szereg niekorzystnych skutków zdrowotnych, takich jak immunotoksyczność, toksyczność oddechowa, toksyczność sercowo-naczyniowa, hepatotoksyczność, hepatotoksyczność, nefrotoksyczność, neurowirulencja, toksyczność reprodukcyjna i genotoksyczność. Toksykologiczny wpływ arsenu na narządy trzewne został udokumentowany przede wszystkim w badaniach na ssakach, co sugeruje, że arsen stanowi ryzyko dla funkcji wątroby i nerek (Waalkes i wsp., 2004; Mazumder, 2005; Zheng i wsp., 2014). Niemniej jednak, skutki toksykologiczne narażenia na arsen w diecie na wątrobę i nerki kur niosek są nadal niejasne. Toksyczność arsenu u zwierząt jest ściśle związana ze stresem oksydacyjnym, który zaburza równowagę pro/antyoksydacyjną (Flora, 2011). Kiedy arszenik dostanie się do komórki, wiąże się z wewnątrzkomórkowym glutationem (GSH) lub utlenia go, prowadząc do powstania wolnych rodników. Jak wiemy, geny cytoochronne mogą być regulowane przez szereg wewnątrzkomórkowych czynników transkrypcyjnych, w tym czynnik jądrowy związany z czynnikiem erytroidalnym 2-powiązanym z czynnikiem 2 (Nrf2), białko aktywujące 1 i czynnik jądrowy kappa-B (Kwak i wsp., 2001 ). Czynnik transkrypcyjny Nrf2 jest istotną cząsteczką regulującą poziom stresu w komórkach. W warunkach spoczynku Nrf2 oddziałuje z białkiem 1 związanym z ECH podobnym do Kelcha (Keap1), które znajduje się głównie w cytoplazmie. Gdy wyzwalany jest stres oksydacyjny, Nrf2 przemieszcza się z cytoplazmy do jądra po oddzieleniu od cząsteczki Keap1, a następnie aktywuje ekspresję genów cytoprotekcyjnych (Motohashi i Yamamoto, 2004). Następnie geny cytoochronne dalej regulują aktywność dalszych enzymów antyoksydacyjnych, w tym dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), reduktazy glutationowej (GR), peroksydazy glutationowej (GSH-Px) i katalazy (CAT). Wcześniejsze badania wykazały, że czynnik transkrypcyjny Nrf2 uczestniczy w stresie wywołanym arsenem u ssaków (Sinha i wsp., 2013). Jednak dokładny wpływ ekspozycji na arsen na skutki stresu oksydacyjnego u kur niosek pozostaje niejasny. W niniejszym badaniu zbadano wpływ suplementacji diety arsenem na wydajność nieśności, jakość jaj, wskaźniki biochemiczne surowicy, zmiany histopatologiczne wątroby i nerek oraz stres oksydacyjny u kur niosek. Ponadto zbadano szlak Nrf2-Keap1 w celu zidentyfikowania mechanizmu molekularnego w wątrobie inerkikur niosek. Badanie to dostarcza pewnych informacji na temat biologicznej teorii nadmiernej toksyczności dietetycznej arsenu w wątrobie inerkakur niosek.

cistanche redditdozłagodzić ból nerek

MATERIAŁY I METODY

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee. Wszystkie procedury doświadczalne przeprowadzone na zwierzętach zostały wdrożone zgodnie z Chińskim Stowarzyszeniem Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.

Zwierzęta, diety i projektowanie eksperymentów

Pięćset dwanaście {{0}}-tygodniowych kur niosek Hyline White o podobnych warunkach ciała zostało losowo wybranych i podzielonych na 4 grupy. Każda grupa zawierała 8 powtórzeń po 16 ptaków. Arsen został dodany do podstawowej diety kukurydzianej w 4 różnych stężeniach (0, 20, 40 i 60 mg/kg; w postaci kwasu arsanilowego) (Suplement Tabela 1). Stężenia arsenu w paszy mierzono metodą atomowej spektrometrii absorpcyjnej z generowaniem wodorków według dotychczasowej metodologii (Dos Passos i in., 2012). Rzeczywiste stężenia arsenu w 4 grupach wynosiły 0,95, 20,78, 40,67 i 60,25 mg/kg. Ptaki trzymano w klatkach (60 ! 50 ! 50 cm3) wyposażonych w 1 karmnik i 2 poidła smoczkowe, a 2 kury trzymano w klatce. Przez cały okres doświadczalny kury miały swobodny dostęp do paszy i napoju. Cały eksperyment trwał 10 tygodni, w tym 1-tygodniowy okres dostosowawczy i 9-tygodniowy formalny okres eksperymentalny.

Wydajność nieśności i jakość jaj

Przez cały okres doświadczalny codziennie odnotowywano wskaźniki wydajności nieśności, w tym spożycie paszy, produkcję jaj kurzych i masę jaj (EW). Oznaczenia spożycia paszy i EW w każdej grupie przeprowadzono przy użyciu wrażliwej skali wagowej (XS2002S, Mettler Toledo, Zurych, Szwajcaria). Współczynnik wykorzystania paszy (FCR) obliczono według następującego wzoru: FCR 5 pobranie paszy w gramach/masa jaja w gramach. W sumie 40 jaj z każdej grupy zostało losowo zebranych w celu zmierzenia parametrów jakości jaj w ciągu 24 godzin od złożenia jaja na koniec eksperymentu. Jaja ważono przy użyciu czułej wagi (XS2002S, Mettler Toledo). Następnie za pomocą cyfrowego testera jaj (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kioto, Japonia) określano jednostkę Haugh, wysokość białka, kolor żółtka i wytrzymałość skorupki jaja. Grubość skorupy jaja z błoną wewnętrzną określano w ostrym, środkowym i tępym obszarze jaja za pomocą mikrometru zegarowego(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japonia), a do analizy statystycznej wykorzystano wartości średnie.

Pobieranie próbek

Po eksperymencie hodowlanym po 32 ptaki z każdej grupy wybrano losowo i uśmiercono przez odcięcie żył szyjnych. Próbki krwi pobrano do sterylnych probówek wirówkowych i natychmiast przewieziono do laboratorium w celu pomiaru wskaźników biochemicznych surowicy. Następnie dokonano sekcji ptaków, a wątrobę inerkizostały usunięte z jamy brzusznej. Wątroba inerkapróbki pocięto na 4 części. Jedna część została natychmiast utrwalona w 4% paraformaldehydzie do badania histopatologicznego. Pozostałe 3 części natychmiast przechowywano w ciekłym azocie w celu dalszego określenia parametrów stresu oksydacyjnego, odkładania arsenu i ekspresji genów.

Test osadzania arsenu

Po pomiarze jakości jaj żółtko oddzielono od białka. Akumulację arsenu w białku i żółtku mierzono metodą spektrometrii absorpcji atomowej z generacją wodorków według dotychczasowej metodologii (Dos Passos et al., 2012). Akumulację arsenu w całym jaju obliczono sumując zawartość arsenu w białku i żółtku. W podobny sposób wykorzystano spektrometrię absorpcji atomowej z generacją wodorków do określenia akumulacji arsenu w wątrobie inerka kur niosek(Dos Passos i in., 2012).

Oznaczanie wskaźników biochemicznych surowicy

Poziomy białka całkowitego, albuminy, globuliny, aminotransferazy alaninowej (ALT) i aminotransferazy asparaginianowej (AST) są ważnymi wskaźnikami oceny funkcji wątroby. Parametry te mierzono przy użyciu odpowiednich zestawów testowych (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta. Poziomy azotu mocznikowego we krwi (BUN), kwasu moczowego (UA) i kreatyniny (CT) są ważnymi wskaźnikami oceny funkcji nerek i zostały określone za pomocą zestawów do wykrywania (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Zmiany histopatologiczne

Tkanki wątroby i nerek utrwalone w 4% paraformaldehydzie zostały odwodnione w 70, 80, 90, 95 i 100% etanolu i ostatecznie zatopione w parafinie. Tkanki pokrojono na skrawki o grubości 6-mm, a następnie wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Następnie obserwacje zmian histopatologicznych w wątrobie inerkatkanki zostały wykonane przez patologa pod mikroskopem optycznym (Olympus, Melville, NY).

Testy na peroksydację lipidów (LPO) i aktywność enzymów przeciwutleniających

Aktywność SOD, CAT, GR i GSH-Px oraz zawartość dialdehydu malonowego (MDA) i GSH w wątrobie i nerkach oznaczono odpowiednimi zestawami analitycznymi (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). W skrócie, zawartość MDA zmierzono metodą spektrofotometryczną opartą na reakcji kwasu tiobarbiturowego z MDA (Janero, 1990). Aktywność GR i zawartość GSH określono przy użyciu 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoesowego kwasu) (Carlberg i Mannervik, 1985; Abegg i wsp., 2012). Aktywność SOD określono na podstawie reakcji hamowania między nitrobłękitną redukcją tetrazoliową a oksydazą ksantynową. Aktywność CAT określono na podstawie tworzenia stabilnego kompleksu nadtlenek wodoru i molibdenianu amonu (Aebi, 1984). Aktywność GSH-Px określono przez ocenę redukcji wodoronadtlenku t-butylu (Wheeler i wsp., 1990).

Całkowita izolacja RNA i ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym

Całkowity RNA wyizolowano z tkanek wątroby i nerek za pomocą zestawu Trizol RNAiso Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Dalian, Chiny). Startery przedni i wsteczny dla manganowej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD), miedziowo-cynkowej dysmutazy ponadtlenkowej (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 i genu porządkowego (b-aktyna) przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 2. Obfitość genów mierzono za pomocą systemu StepOnePlus Real-Time PCR (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA). Warunki cykli to 95°C przez 30 s, a następnie 35 cykli 95°C przez 5 s, 59°C przez 10 s i 72°C przez 30 s. Wielokrotność różnicy w ekspresji mRNA zmierzono stosując metodę względnej ilościowej oceny z wykorzystaniem wydajności PCR w czasie rzeczywistym i znormalizowano do poziomu b-aktyny w celu porównania względnych zmian CT we wszystkich grupach (Livak i Schmittgen, 2001).

Analizy statystyczne

Wszystkie dane wyrażono jako średnią 6 SE. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA przy użyciu SPSS wersja 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Gdy różnice między grupami były znaczące (wskazane przez P 0.05), średnie porównywano z rzeczywiście istotną różnicą Tukeya dla wielokrotnych porównań post hoc. Korelacje Pearsona analizowano za pomocą dwuwymiarowej analizy korelacji (SPSS wersja 20.0, SPSS Inc.). Współczynniki istotności i korelacji są przedstawione odpowiednio jako „p” i „r”.

WYNIKI

Wydajność nieśności i jakość jaj W porównaniu z tymi w grupie {{0}}.95 mg/kg arsenu, produkcja jaj kurzych i EW znacznie spadła w grupie 60.25 mg/ kg grupa arsenu (P, 0.05). Jednak arsen w diecie nie wpływał na spożycie paszy ani FCR (tab. 1). W porównaniu z grupą {{20}}.95 mg/kg arsenu, jednostka Haugha została znacznie zmniejszona w grupie 40.67 mg/kg (P, 0,05) i 60,25 mg /kg (P, 0,05) grup arsenowych. Co więcej, zarówno wysokość białka, jak i zawartość skorupy jaja uległy znacznemu zmniejszeniu w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05), plateau w grupie 40,67 mg/kg arsenu i gwałtownie spadły w grupie 60,25 mg/kg grupy arsenu (P, 0,05). Arsen w diecie nie wpływał na kolor żółtka ani grubość skorupy jajka (tab. 1)

Osadzanie arsenu

Odkładanie arsenu w białku (P, {0}}.05), żółtku (P, 0.05) i całym jaju (P, 0.05) znacznie wzrosło, gdy dawka arsenu w diecie wzrosła z 0,95 do 60,25 mg/kg (Tabela 2). Podobnie, gdy dawka arszeniku w diecie wzrosła z 0,95 do 60,25 mg/kg, odkładanie arsenu w wątrobie (P 0,05) i nerkach (P 0,05) znacznie się zwiększyło (tab. 2)

Analiza korelacji między jakością jaj a osadzaniem się arsenu w jaju

Odkładanie arsenu w białku było ujemnie skorelowane z jednostką Haugha (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), białko wzrost (r 5 20.878, P, 0.01) i wytrzymałość skorupki jajka (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). Tymczasem depozycja arsenu w żółtku była również ujemnie związana z jednostką Haugha (r 5 20,654, P, 0,01), wysokością białka (r 5 20,893, P, 0,01) i wytrzymałość skorupki jajka (r 5 20,902, P, 0,01). Podobnie stwierdzono negatywne zależności między odkładaniem się arsenu w całym jaju a jednostką Haugha (r 5 20.640, P, 0,01), wysokością białka (r 5 20 0,88, P, 0,01) , oraz wytrzymałość skorupki jaja (r 5 20.902, P, 0,01) (Tabela 3)

Wskaźniki biochemiczne surowicy

W porównaniu z tymi w grupie {{0}},95 mg/kg arsenu, poziomy AlAT były znacząco podwyższone w grupie 20,78 mg/kg (P , 0).{ {16}}5), 40,67 mg/kg (P < 0,05)="" i="" 60,25="" mg/kg="" (p="">< 0,05)="" grup="" arsenu.="" tymczasem="" poziomy="" ast="" w="" grupie="" 60,25="" mg/kg="" arsenu="" były="" znacząco="" podwyższone="" w="" porównaniu="" z="" tymi="" w="" grupie="" 0,95="" mg/kg="" arsenu="" (p,="" 0,05).="" arsen="" w="" diecie="" nie="" wpływał="" na="" poziom="" całkowitego="" białka="" ani="" albumin="" w="" surowicy="" (tabela="">

W porównaniu z tymi w grupie {{0}}.95 mg/kg arsenu, zarówno poziomy BUN, jak i UA były znacząco zwiększone w grupie 60,25 mg/kg arsenu (P, 0,05), podczas gdy narażenie na arsen w diecie nie wpływają na poziom CT w surowicy (tab. 4).

Zmiany histopatologiczne

Wygląd tkanki wątroby był prawidłowy i niezmieniony w grupie {{0},95 mg/kg arsenu. Jednak wraz ze wzrostem dawki arszeniku w diecie z 20,78 do 60,25 mg/kg, proliferacja przewodu żółciowego, stłuszczenie hepatocytów i deformacja żyły centralnej nasilały się (ryc. 1A–1D). Wygląd tkanki nerek był prawidłowy i niezmieniony w grupie otrzymującej 0,95 mg/kg arsenu. Jednak w grupie 20,78 mg/kg arsenu wystąpił silny skurcz kłębuszkowy w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu. Wraz ze wzrostem dawki arszeniku w diecie z 40,67 do 60,25 mg/kg, powiększenie kanalików nerkowych, zwłóknienie kanalików i hialinizacja nasilały się (ryc. 1E–1H).

Biomarkery stresu oksydacyjnego

W porównaniu z tymi w grupie {{0}.95 mg/kg arsenu, poziomy MDA w wątrobie były znacząco podwyższone w grupie 60.25 mg/kg arsenu (P, {{12} }.05), a poziomy MDA w nerkach były znacząco podwyższone w przypadku 20,78 mg/kg (p=0,05), 40,67 mg/kg (p=0,05) i 60,25 mg/kg (p=0,05) grupy (Rysunek 2A). Poziomy GSH w wątrobie inerkaznacznie zmniejszyła się w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0.05) , a plateau w grupach arsenu 40,67 i 60,25 mg/kg (Rysunek 2B). Aktywność wątroby SOD była znacząco obniżona w grupach 40.67 mg/kg (P, 0,05) i 60,25 mg/kg (P, 0,05) w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu. Aktywność nerkowa SOD była znacząco obniżona w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i stabilizowana w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu (ryc. 2C). aktywność CAT w wątrobie inerkaznacznie spadła, gdy dawka arsenu w diecie wzrosła z {{0}}.95 do 60.25 mg/kg (P, 0.05, Rysunek 2D). W porównaniu z tą w grupie 0.95 mg/kg arsenu, aktywność GR w wątrobie i nerkach była znacznie zmniejszona w grupie 60.25 mg/kg arsenu (P, 0.05, Rysunek 2E ). Ponadto, w porównaniu z grupą otrzymującą 0,95 mg/kg arsenu, aktywność wątrobowego GSH-Px była znacznie zmniejszona w grupie 60,25 mg/kg arsenu (P, 0,05), a aktywność nerkowego GSH-Px gwałtownie spadła w grupie 20,78 mg/kg arsenu (P, 0,05) i plateau w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu (ryc. 2F).

Ekspresja genów enzymów przeciwutleniających, cząsteczek Nrf2 i Keap1

Ekspresja genu CuZnSOD w wątrobie była znacznie obniżona w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0.{{16} }5) i plateau w grupach arsenu 40,67 i 60,25 mg/kg. Nerka ekspresja genu CuZnSOD była znacznie obniżona w 40.67 mg/kg (P , 0.05) i 60.25 mg/kg (P , 0.05) grup arsenu w porównaniu z grupą 0.95 mg/kg arsenu (Rysunek 3A). W porównaniu z grupą 0.95 mg/kg arsenu, ekspresja wątrobowego genu MnSOD była znacznie obniżona w grupie 20.78 mg/kg arsenu (P, 0.{{73) }}5) i ustabilizowały się w grupach 4{{80}},67 i 60,25 mg/kg arsenu. Ekspresja genu MnSOD w nerkach nie różniła się znacząco między grupami (Figura 3B). Ekspresja genu CAT w wątrobie była znacząco obniżona w grupie 20.78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą {{1{05}}.95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i plateau w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu. Nerkowa ekspresja genu CAT była znacząco obniżona w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i plateau w grupie 40,67 mg/kg arsenu i gwałtownie spadła w grupie 60,25 mg/kg grupa arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05, Ryc. 3C). Ekspresja genu GR w wątrobie i nerkach była znacząco obniżona w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i plateau w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu (ryc. 3D). Ponadto ekspresja wątrobowego genu GSH-Px znacznie spadła, gdy dawka arszeniku w diecie wzrosła z 0,95 do 40,67 mg/kg (P, 0,05), a następnie ustabilizowała się w grupie 60,25 mg/kg arsenu. Nerkowa ekspresja genu GSH-Px znacząco spadła w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i była plateau w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu (ryc. 3E). Ekspresja genu Nrf2 w wątrobie i nerkach była znacząco obniżona w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i plateau w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu (ryc. 4A i 4C ). W przeciwieństwie do tego ekspresja genu Keap1 w wątrobie i nerkach była gwałtownie zwiększona w grupie 20,78 mg/kg arsenu w porównaniu z grupą 0,95 mg/kg arsenu (P, 0,05) i stabilizowana w grupach 40,67 i 60,25 mg/kg arsenu (rysunki 4B i 4D).

Analizy korelacji związane ze ścieżką Nrf2- Keap1

Ekspresja genów CuZnSOD (wątroba, r {{0}}.613, P, 0,01;nerka, o {{0}}.687, P , 0.{{10}}), CAT (wątroba, o 5 0.738, P , 0.01;nerka, r 5 0.903, P, 0.01), GR (wątroba, r 5 0,477, p, 0,05; nerka, r 5 0,485, p, 0,05, i GSH-Px (wątroba, r 5 0,450, p, 0,05; nerka , r 5 0.767, P , 0,01) w wątrobie i nerkach oraz ekspresja genu MnSOD (r 5 0 .707, P , 0,01) były dodatnio skorelowane z aktywnością ich odpowiednich enzymy przeciwutleniające. Ponadto ekspresja genu Nrf2 była dodatnio skorelowana z ekspresją genu CuZnSOD (wątroba, r 5 0,756, P, 0,01;nerka, r {{0}}.736, P , 0.01), CAT (wątroba, r 5 0.893, P , 0,01;nerka, o {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (wątroba, o 5 0 0,837, p 0,01; nerka r 5 0 0,915, p 0,01 i GSH-Px (wątroba r 5 0 0,822, p 0,01; nerka r {{17} } 0,722, P , 0,01) w wątrobie inerkai ekspresja wątrobowego genu MnSOD (r {{0}},720, P, 0,01). Wystąpiła ujemna korelacja między ekspresją mRNA Nrf2 i Keap1 (wątroba, r 5 20,746, P , 0,01;nerka, r {{0}},771, P , 0,01) w wątrobie i nerkach. Ponadto nie stwierdzono korelacji między ekspresją genu MnSOD a aktywnością enzymatyczną SOD lub ekspresją mRNA Nrf2 wnerki kur niosek(Tabela 5).

DYSKUSJA

Arszenik jest wszechobecnym i toksycznym metaloidem z natury. Wywołuje szereg toksyczności u ludzi i zwierząt, w tym hepatotoksyczność, nefrotoksyczność, neurowirulencję, immunotoksyczność, toksyczność sercowo-naczyniową, hepatotoksyczność i toksyczność reprodukcyjną (Mandal i Suzuki, 2002). Arszenik najmocniej atakuje układ rozrodczy zwierząt. Wcześniejsze badania wykazały, że narażenie na roksason w diecie zaburza tempo nieśności i produkcję jaj (Chiou i wsp., 1999; Zhang i wsp., 2017). W tym badaniu suplementacja arsenem w diecie znacznie zmniejszyła wydajność nieśności, w tym produkcję jaj i EW. Wcześniejsze badania wykazały, że suplementacja arsenu w diecie indukuje akumulację arsenu w jajach i obniża jakość jaj (Chiou i wsp., 1998; Zhang i wsp., 2017). W niniejszym badaniu suplementacja arszenikiem w diecie znacznie zmniejszyła jednostkę Haugh, wysokość białka i wytrzymałość skorupki jaja. Poza kolorem żółtka i grubością skorupki stwierdzono ujemne korelacje między depozycją arsenu w jajach a parametrami jakości jaj. Sugeruje to, że osadzanie się arsenu w jaju może mieć wpływ na jednostkę Haugha, wysokość białka i wytrzymałość skorupki jaja. Jak wiadomo, grubość warstwy palisadowej w skorupce jaja jest wyznacznikiem grubości skorupki jaja (Ruiz i Lunam, 2000), natomiast odkładanie się pigmentu decyduje o kolorze żółtka. Spekulowaliśmy zatem, że suplementacja arsenu w diecie może nie wpływać na grubość warstwy palisadowej odkładania się pigmentu w jajach kur niosek. Nowe dowody wskazują, że zaburzenia wątroby i nerek są powszechne u ssaków po ekspozycji na arsen (Liu i Waalkes, 2008; Huang i in., 2009). Wcześniejsze badania wykazały, że ekspozycja na arsen wywołuje zmiany histopatologiczne w wątrobie, w tym dezorientację tkanek, peliozę i wakuolizację z towarzyszącą kariolizą, apoptozą i martwicą hepatocytów w Channa punctatus (Roy i Bhattacharya, 2006). W tym badaniu zaobserwowaliśmy poważne zmiany w proliferacji przewodu żółciowego, stłuszczeniu hepatocytów i deformacji żyły centralnej w wątrobie wraz ze wzrostem dawki arszeniku w diecie z 20,78 do 60,25 mg/kg. Roy i Bhattacharya (2006) również stwierdzili, że ekspozycja na arsen powoduje kurczenie się kłębuszków nerkowych, nieregularności w kanalikach nerkowych i zwiększenie przestrzeni Bowmana. W niniejszym badaniu, jako dawka arsenu w diecie

wzrosła z 20,78 do 60,25 mg/kg, zmiany histopatologiczne nerek były bardzo poważne, w tym powiększenie kanalików nerkowych, kurczenie się kłębuszków nerkowych oraz zwłóknienie i hialinizacja kanalików, co jest zgodne z poprzednim badaniem (Roy i Bhattacharya, 2006). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, wykazano, że poziomy AST i ALT w surowicy są zastępczymi markerami reakcji zapalnej wątroby i zwłóknienia (Wang i in., 2008; Khattab i in., 2015). W tym badaniu wzrost poziomu AST i ALT w surowicy sugerował, że odpowiedź zapalna wątroby nasiliła się po ekspozycji na arsen, co było zgodne z obserwowanymi zmianami histopatologicznymi w wątrobach kur niosek. Patel i Kalia (2013) również odkryli, że hepatotoksyczność wywołana arsenem objawia się wzrostem poziomu ALT i AST w surowicy u szczurów Wistar. Czynność nerek jest rutynowo monitorowana przez poziomy BUN, CT i UA w surowicy. Odkryliśmy, że poziomy BUN i UA w surowicy znacznie wzrosły, a poziom CT w surowicy miał tendencję do wzrostu po suplementacji arsenu w diecie, co sugeruje, żenerkaodszkodowaniewynikało z narażenia kur niosek na arsen, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami (Liu et al., 2000). Powszechnie wiadomo, że uszkodzenie tkanek wywołane ekspozycją na arsen jest ściśle związane ze stresem oksydacyjnym (Jomova et al., 2011). Gdy wyzwalany jest stres oksydacyjny, wewnątrzkomórkowe reaktywne formy tlenu (ROS) indukują LPO, co można monitorować na podstawie wewnątrzkomórkowych poziomów MDA (Storey, 1996). W tym badaniu poziomy MDA w wątrobie i nerkach znacznie wzrosły po suplementacji arsenem w diecie, co sugeruje, że nastąpił wzrost LPO, co mogło wskazywać na uszkodzenie oksydacyjne wątroby inerki kur niosek.GSH odgrywa również istotną rolę w regulacji wewnątrzkomórkowego stresu oksydacyjnego (Finkel i Holbrook, 2000). W porównaniu z tymi w grupie 0,95 mg/kg arsenu, poziomy GSH

były znacznie zmniejszone w grupach leczonych wyższymi stężeniami arsenu, co sugeruje, że arsen może wiązać się z GSH w celu osłabienia zdolności antyoksydacyjnych wątroby inerka.Flora i in. (1997) stwierdzili, że ekspozycja na arsen zmniejsza stężenie GSH i powoduje wyraźne zmiany w wątrobie inerkiszczurów. Ponadto, wewnątrzkomórkowe antyoksydacyjne układy enzymatyczne pełnią role ochronne w ochronie przed stresem oksydacyjnym, w tym SOD, CAT, GR i GSH-Px (Finkel i Holbrook, 2000). W tym badaniu suplementacja arszenikiem w diecie istotnie zmniejszyła aktywność SOD, CAT, GR i GSH-Px w wątrobie i nerkach kur niosek. Gdy układy antyoksydacyjne nie mogą zneutralizować nadmiaru wewnątrzkomórkowych ROS, dochodzi do uszkodzeń oksydacyjnych spowodowanych przez LPO, co z kolei może osłabiać aktywność enzymów antyoksydacyjnych. Poprzednie badanie podobnie wykazało, że arszenik wywołuje stres oksydacyjny w nerkach szczura (Sener i wsp., 2016). Enzymy przeciwutleniające są białkami i mogą być regulowane przez geny na poziomie transkrypcyjnym. W niniejszym badaniu ekspozycja na arsen znacząco obniżyła ekspresję mRNA CuZnSOD, CAT, GR i GSHPx. Co więcej, ekspresja genów CuZnSOD, CAT, GR i GSH-Px była dodatnio skorelowana z aktywnością enzymów antyoksydacyjnych, co sugeruje, że ekspozycja na arsen zmniejszała aktywność enzymów antyoksydacyjnych poprzez hamowanie ekspresji mRNA. Podobnie opisano korelacje między aktywnością enzymów antyoksydacyjnych a ekspresją genów w wątrobach i nerkach kur niosek po ekspozycji na rtęć. Suplementacja diety arsenem nie wpłynęła jednak na ekspresję MnSOD wnerka.Mogło tak być, ponieważ SOD ma kilka izoenzymów, a na jego aktywność nie ma wpływu gen MnSOD. Nrf2 odgrywa istotną rolę w systemie obronnym przed stresem oksydacyjnym. W warunkach podstawowych Nrf2 wiąże się z Keap1 w cytoplazmie. Gdy wewnątrzkomórkowy poziom ROS jest wystarczająco wysoki, aby zmodyfikować reaktywne grupy tiolowe Keap1, Nrf2 znacznie łatwiej przemieszcza się do jądra, gdzie podrażnia

elementu, a następnie aktywuje dalsze geny ochronne (Sinha i wsp., 2013). W tym badaniu stwierdziliśmy, że ekspozycja na arsen znacznie zmniejszyła ekspresję genu Nrf2 i ekspresję dalszych enzymów antyoksydacyjnych. Regulacja w dół genów Nrf2 i dalszych enzymów antyoksydacyjnych po ekspozycji na arsen sugerowała, że ​​arsen hamował ekspresję genów enzymów antyoksydacyjnych poprzez tłumienie ekspresji genu Nrf2 w wątrobie inerka. Ponadto, wzmocnienie ekspresji genu Keap1 było ujemnie skorelowane z ekspresją genu Nrf2 i enzymu antyoksydacyjnego, co sugeruje, że regulacja w górę cytoplazmatycznego Keap1 promuje translokację Nrf2 z cytoplazmy do jądra (Kensler i wsp., 2007). Podobne badanie wykazało, że wewnątrzkomórkowy szlak Nrf2-Keap1 jest dezaktywowany w odpowiedzi na ekspozycję na arsen (Janasik i wsp., 2018). Niemniej jednak wcześniejsze badanie wykazało również, że ekspozycja na arsen wzmacnia szlak Nrf2-Keap1 w celu ochrony przed uszkodzeniem oksydacyjnym (Massrieh i in., 2006). Wyniki te nie są sprzeczne z tym badaniem. We wczesnych stadiach stresu oksydacyjnego ochronne działanie Nrf2-Keap1 może zostać aktywowane, aby zapobiec stresowi oksydacyjnemu. Niemniej jednak, szlak Nrf2-Keap1 może nie opierać się uszkodzeniom oksydacyjnym wywołanym długotrwałym narażeniem na wysoką dawkę arsenu (Kensler i in., 2007). Następnie szlak Nrf2- Keap1 może zostać zahamowany, aw wątrobie i nerkach kur niosek może wystąpić wewnątrzkomórkowe uszkodzenie oksydacyjne lub nawet apoptoza. W świetle obecnych wyników, niniejsze badanie dostarcza nowych dowodów na wątrobową i nerkową obronę antyoksydacyjną pod wpływem arsenu u kur niosek i wyjaśnia centralną rolę szlaku Nrf2-Keap1 w stresie oksydacyjnym wywołanym przez arsen po raz pierwszy . Podsumowując, suplementacja diety arszenikiem obniżyła wydajność nieśności i jakość jaj kur niosek. Uszkodzenia histopatologiczne wystąpiły w wątrobie inerkapo narażeniu na arsen w diecie. Ponadto ekspozycja na arsen w diecie indukowała stres oksydacyjny wątroby i nerek poprzez upośledzenie szlaku Nrf2-Keap1 u kur niosek.