Dietetyczne flawanole kakaowe poprawiają funkcję mitochondriów w mięśniach szkieletowych i modyfikują metabolizm całego organizmu u zdrowych myszy

po więcej informacji skontaktuj się:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakcyjny: Dysfunkcja mitochondriów jest szeroko opisywana w różnych chorobach i przyczynia się do ich patogenezy. Oceniliśmy efektflawanole kakaowesuplementacja na funkcję mitochondriów i cały metabolizm, a następnie zbadaliśmy, czy w grę wchodzi sirtuina deacetylazy mitochondrialnej-3 (Sirt3). Zbadaliśmy wpływ 15 dni suplementacji CF u typu dzikiego i Sirt3-/myszy. Metabolizm całego ciała oceniano za pomocą kalorymetrii pośredniej, a doustny test tolerancji glukozy przeprowadzono w celu ocenymetabolizm glukozy. Mitochondrialną funkcję oddechową oceniano w permeabilizowanych włóknach i określano ilościowo zawartość nukleotydów pirydynowych (NAD plus i NADH). W typie dzikim suplementacja mukowiscydozy znacząco zmodyfikowała metabolizm całego organizmu poprzez promowanie wykorzystania węglowodanów i poprawę tolerancji glukozy. Suplementacja CF wywołała znaczny wzrost masy mitochondrialnej, podczas gdy nastąpiła znacząca adaptacja jakościowa w celu utrzymania produkcji H2O2 i komórkowego stresu oksydacyjnego. Suplementacja CF wywołała znaczny wzrost zawartości NAD plus i NADH. Wszystkie wyżej wymienione efekty zostały stępione u myszy Sirt3-7. Podsumowując, suplementacja CF wzmocniła metabolizm NAD, który stymuluje metabolizm sirtuin i poprawił funkcję mitochondriów, co prawdopodobnie przyczyniło się do zaobserwowanej adaptacji metabolizmu całego organizmu, z większą zdolnością do wykorzystania węglowodanów, przynajmniej częściowo poprzez Sirt3.

Słowa kluczowe: flawanole kakaowe; metabolizm NAD; masa mitochondrialna; metabolizm glukozy; mięśnie szkieletowe

kliknij, aby uzyskać więcej informacji

1. Wstęp

Mitochondria to subkomórkowe organelle, które biorą udział w wielu funkcjach komórkowych, takich jak transdukcja energii poprzez mitochondrialną fosforylację oksydacyjną oraz w mitochondrialną produkcję nadtlenku wodoru lub aktywację śmierci komórkowej za pośrednictwem mitochondriów [1-3]. Pojawiające się dowody sugerują, że dysfunkcja mitochondriów jest zaangażowana w wiele patologii i odgrywa kluczową rolę w ich patogenezie [4]. Nasza grupa zgłaszała zaburzenia mitochondrialne u pacjentów z cukrzycą typu 1 na długo przed powikłaniami klinicznymi [5]. Co więcej, wraz z wiekiem dochodzi do spadku zdolności oksydacyjnych mitochondriów nawet u osób zdrowych [6]. Dlatego też identyfikacja strategii łagodzenia tych dysfunkcji lub zwiększania masy mitochondrialnej jest szansą na zapobieganie lub przynajmniej zmniejszenie występowania wielu zaburzeń lub zwiększenie wydolności tlenowej zdrowych osobników.

W tym kontekście interesująca jest identyfikacja bezpiecznych i naturalnych związków, które poprawiają funkcję mitochondriów i metabolizm całego organizmu z ograniczonymi skutkami ubocznymi lub bez nich. Wśród naturalnych związków,flawanole kakaowe(CF) są uważane za obiecujące cząsteczki, ponieważ wykazano, że ich spożywanie pozytywnie wpływa na zdrowie układu krążenia, insulinooporność lub funkcje odpornościowe [7]. Rzeczywiście, wykazano, że mukowiscydoza poprawia metabolizm glukozy, a po krótkotrwałym podawaniu mukowiscydozy następuje wzrost wrażliwości na insulinę, nawet u pacjentów z nadciśnieniem z nietolerancją glukozy [8, 9].

Wśród flawanoli, (-)-epikatechina (EPI) jest najczęściej spotykanym monomerem w mukowiscydozie, a EPI jest uważany za główną biodostępną i bioaktywną cząsteczkę mukowiscydozy [10]. Spójny materiał dowodowy wskazuje, że suplementacja EPI poprawia funkcję i/lub zawartość mitochondriów w mięśniach szkieletowych [11]. Suplementacja EPI stymuluje wiele szlaków zbiegających się w aktywowanym przez proliferatory peroksysomach koaktywatorze gamma 1-alfa (PGCl) receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów i głównych jądrowych kompleksach transkrypcyjnych. EPI bezpośrednio wzmaga wytwarzanie tlenku azotu, co stymuluje biogenezę mitochondriów [11]. Jednocześnie sirtuiny 1 i 3 są również stymulowane przez suplementację EPI [11]. Zastosowanie proantocyjanidyn, oligomerycznychflawonoidyktóre zawierają EPI, wykazano, że zwiększają wewnątrzkomórkowe poziomy dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD plus) poprzez wzrost kilku prekursorów biosyntezy NAD i podwyższenie poziomu mRNA sirtuiny -1 w wątrobie szczura [12]. Rodzina sirtuin (Sirt), deacetylaza zależna od NAD, składa się z siedmiu członków różniących się rozmieszczeniem w obrębie komórek, specyficznością substratową i funkcjami komórkowymi [13]. Sirt1, szeroko badany członek tej rodziny, stymuluje biogenezę mitochondriów poprzez promowanie deacetylacji PGCl, zwiększając w ten sposób jego aktywność transkrypcyjną [14]. Sirte, kluczowy czujnik metaboliczny, był stymulowany po podaniu EPI [12,15-17]. Jednak wpływ EPI na inne sirtuiny nie został zbadany. Ocena efektu EPI będzie szczególnie interesująca w przypadku sirtuin zlokalizowanych w obrębie mitochondriów (Sirt3, Sirt 4 i Sirt5), o których wiadomo, że modulują aktywność enzymów cyklu Krebsa i łańcucha oddechowego [18]. Sirt3, który jest wysoce eksprymowany w tkankach o wysokim obrocie metabolicznym i zawartości mitochondriów, jest szczególnie interesujący ze względu na jego kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania mitochondriów poprzez odwracalną deacetylację lizyny białka [19-21]Ponadto, Sirt3 odgrywa ważną rolę w regulacja metabolizmu całego organizmu [20. Wykazano, że Sirt3 jest zmieniony w mięśniach szkieletowych w modelach cukrzycy typu 1 i typu 2 oraz chorób sercowo-naczyniowych [22, 23]. Ponadto zasugerowano, że aktywacja Sirt3 może stanowić obiecującą strategię terapeutyczną poprawy funkcji i metabolizmu mitochondriów [23,24]. Dlatego interesujące jest ustalenie, czy Sirt3 leży u podstaw korzystnego wpływu suplementacji CF na metabolizm całego organizmu i funkcje mitochondriów.

W tym badaniu zastosowaliśmy podejście integracyjne do zbadania na myszach wpływu 15-dniowej suplementacji CF. Postawiliśmy hipotezę, że suplementacja mukowiscydozy:(i) zmodyfikuje metabolizm całego organizmu imetabolizm glukozy, (ii) zwiększyć funkcję mitochondriów w mięśniach oksydacyjnych i glikolitycznych w przepuszczalnych włóknach oraz (ii) zwiększyć metabolizm NAD. Zbadaliśmy również domniemany udział Sirt3 w indukowanej przez CF biogenezie mitochondriów i metabolizmie całego ciała. Nasze hipotezy były takie, że wpływ mukowiscydozy na metabolizm całego ciała i masę mitochondrialną będzie osłabiony u myszy Sirt3-7.

2. Metody

2.1. Zwierzęta i dieta

Do tego badania, 129S1/SvlmJ 10-tygodniowe samce myszy zakupiono z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Aby ustalić, czy sirtuiny są zaangażowane w indukowaną przez CF adaptację masy mitochondrialnej i funkcji, użyliśmy również 10-tygodniowych samców myszy Sirt3 z nokautem całego ciała na tym samym szczepie co typu dzikiego [25]. Sirt3/myszy wykorzystano do zbadania udziału Sirt3 w indukowanej przez CF biogenezie mitochondriów i adaptacji metabolizmu całego ciała. Myszy trzymano w pomieszczeniu o regulowanej temperaturze 23-25 stopnia i kontrolowanym oświetleniu (12-h cykli światła i ciemności). Zwierzęta miały swobodny dostęp do karmy dla gryzoni i wody z kranu.

Po co najmniej tygodniu przyzwyczajania się w obiekcie dla zwierząt, zwierzęta doświadczalne otrzymywały suplementację CF przez doustny zgłębnik naturalnego ekstraktu (302,1 mg/kg masy ciała dwa razy dziennie przez 15 dni) zawieszonego w karboksymetylocelulozie (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, USA). Skład proszku kakaowego opisano w tabeli 1 i otrzymano z firmy Naturex (Quart de Poblet, Hiszpania). Skład został ustalony metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, a 100 mg ekstraktu odpowiada średnio 475 mg suchych nasion kakao. Myszy kontrolne otrzymały przez zgłębnik doustny nośnik złożony z podobnej zawartości teobrominy i kofeiny rozpuszczonych w karboksymetylocelulozie. Dzienna dawka została określona zgodnie z wytycznymi przemysłu, które przeliczają dawkę dla człowieka na dawki równoważne zwierzętom w oparciu o powierzchnię ciała, a my pomnożyliśmy dawkę dla człowieka przez 12,3 [26]. Zgłębnik ustny został wykonany przez doświadczonego technika.

2.2. Kolekcja tkanek1

Dwadzieścia cztery godziny po ostatnim doustnym zgłębniku, nie głodzone zwierzęta znieczulono ketaminą i ksylazyną (odpowiednio: 100 i 10 mg/kg). Pobranie tkanek przeprowadzono natychmiast po uzyskaniu znieczulenia. Wycięto mięsień płaszczkowaty i białą część mięśnia brzuchatego łydki. Próbki albo natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80 stopniu do dalszej analizy, albo użyto do przygotowania pozbawionych skóry włókien mięśniowych.

2.3. Ocena aktywności metabolicznej i fizycznej

Kalorymetrię pośrednią i spontaniczną aktywność fizyczną mierzono za pomocą kompleksowego laboratoryjnego systemu monitorowania zwierząt (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Myszy trzymano pojedynczo w komorach w temperaturze 28 stopni, ze światłem od 07 godz.00 do 19 godz.00 i dostępem ad libitum do karmy dla gryzoni i wody z kranu. Myszy aklimatyzowano do klatek metabolicznych przez trzy dni przed pierwszym dniem zbierania danych. Zbieranie danych przeprowadzono w piętnastym dniu suplementacji. Zużycie tlenu (VO2), wytwarzanie dwutlenku węgla (VCO2) i współczynnik wymiany oddechowej (RER) mierzono przy przepływie powietrza 00,5 l/min i próbce powietrza 0,4 l/ min. Procentową względną skumulowaną częstość (PCRF) RER określono w okresie 24-h, jak wcześniej opisali Riachi i in. (2 {{17}04). W skrócie, PCRF określono przez dodanie częstotliwości każdego punktu danych do poprzedniej sekwencji przyrostu (od 0,65 do 1,20 z przyrostem 0,01)[27]. Elastyczność metaboliczną określono na podstawie nachylenia Hilla (wartość H) i 50 percentyla (EC50) krzywej PRCF oraz poprzez pomiar amplitudy RER w ciągu 24 godzin (Riachi et al.2004). Ogólną aktywność fizyczną monitorowano za pomocą systemu czujników na podczerwień, który wykrywał aktywność osi x i z. Oceniono zarówno liczenia całkowite (za każdym razem, gdy wiązka jest łamana), jak i liczenia ambulatoryjne (za każdym razem, gdy łamie się nowa wiązka). Zliczanie X-total (X-TOT) jest rejestrowane, gdy zwierzę porusza się poziomo o więcej niż 0,5 cala i jest reprezentatywne dla powtarzalnych czynności na małą skalę, takich jak drapanie i czesanie. X-ambulatory count (X-AMB) mierzy rzeczywistą lokomocję, rejestrując liczbę tylko wtedy, gdy zwierzę złamie nową belkę. Liczenie Z-total (Z-TOT) jest rejestrowane, gdy występuje 1,5 cala ruchu pionowego, tj. wychów (Abreu-Vieira 2016). Do szacowania węglowodanów i tłuszczuutlenianiez VO2 i VCO2 wykorzystaliśmy niebiałkową tabelę ilorazu oddechowego z Péronnet i Massicotte stosowaną wcześniej u myszy [28,29].

2.4. Całkowita masa ciała i tkanki tłuszczowej

Całkowitą masę tłuszczu i całkowitą masę beztłuszczową określono u nieuśpionych myszy za pomocą ilościowej analizy interferencji rezonansu przy użyciu analizatora rezonansu magnetycznego całego ciała EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, USA). Całkowita masa tłuszczu stanowiła sumę całego tłuszczu w ciele. Całkowita masa beztłuszczowa obejmowała głównie mięśnie i narządy wewnętrzne. Wiadomo, że masa mięśni szkieletowych stanowi największą część całkowitej masy beztłuszczowej.

2.5. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT)

Glikemię mierzono za pomocą kropli krwi pobranej z ogona za pomocą glukometru (Accu-Chek Performa, Roche, Argentyna). OGTT przeprowadzono na myszach, które były na czczo przez 5 do 6 godzin. Pomiar wykonano w ostatnim dniu suplementacji CF. Po pomiarze podstawowej glikemii (czas O), myszom wstrzykiwano doustnie roztwór 20% glukozy w sterylnej wodzie w dawce 1,5 g glukozy na kg masy ciała -1. Glikemia mierzono po 15, 30, 60, 90 i 120 minutach po wstrzyknięciu roztworu glukozy. Przyrostowy obszar krzywej glukozy obliczono następnie jako miarę tolerancji glukozy.

2.6. Analiza qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA zsyntetyzowano z całkowitego RNA ~2 µL） przy użyciu supermiksu do odwrotnej transkrypcji iScript dla RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Całkowite produkty RT analizowano metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG zgodnie ze specyfikacją producenta (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Cykle osiągnięto w cyklerze CFX96 (Biorad, Hercules, Kalifornia; warunki: 95 stopni C przez 10 minut i 40 cykli 95 stopni przez 30 s, 55 stopni przez 45 s i 72 stopni przez 45 s). Na koniec każdego przebiegu, za pomocą krzywej topnienia potwierdzono brak tworzenia się startera-dimeru i obecność unikalnego amplikonu. Wartości cyklu progowego (Ct) zastosowano zgodnie z metodą 2-A△Ct do analizy danych qPCR, z ß-aktyną lub HPRT1 jako genem porządkowym【30】. Ilościowe wartości RT-PCR były powiązane z tymi z grupy kontrolnej, które zostały ustawione na 1.

2.7. Działania enzymatyczne

Pomiar aktywności właściwej kompleksów łańcucha transportu elektronów i syntazy cytrynianowej przeprowadzono spektrofotometrycznie, jak opisano wcześniej [31]. Sproszkowane zamrożone białe mięśnie brzuchate łydki (~30 mg) homogenizowano za pomocą wibrującego homogenizatora mikrokulek w 500 µl buforu homogenizacyjnego (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 5 mg·mL-Iof BSA , pH 7,4), a następnie dodano 500 µl pożywki hipotonicznej （25 mM fosforan potasu i 5 mM MgCl, pH 7,2). Próbki poddano następnie trzem rundom cykli zamrażania-rozmrażania w ciekłym azocie. Próbki wirowano przez 10 min przy 600 xgw 4 stopniach, a supernatant trzymano na lodzie do czasu analizy. Zawartość białka określono w supernatancie w trzech powtórzeniach przy użyciu zestawu Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Aktywność syntazy cytrynianowej (CS) określono spektrofotometrycznie przy 412 nm po redukcji 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-kwasu nitrobenzoesowego) w obecności 0,1 mM acetylu -CoA i 12 mM kwasu szczawiooctowego w 200 mM buforze Tris (pH 7,4). Test oksydoreduktazy NADH-decylubichinonu wrażliwej na rotenon (kompleks I) przeprowadzono przy 340 nm przy użyciu akceptora 2,3-dimetoksy-5-metylo-6-n-decylo-14-benzochinonu （ 80 μM） i NADH jako donor elektronów 200 μM） w 10 mM buforze Tris pH 8,0）. Dodatek 4 μM rotenonu zastosowano do ilościowego określenia aktywności wrażliwej na rotenon. Aktywność oksydazy cytochromowej „kompleks IV” przeprowadzono przy długości fali 550 nm przy użyciu 10 μM zredukowanego cytochromu c jako donora i 2,5 mM n-dodecylo-β-maltozydu w celu permeabilizacji obu błon mitochondrialnych w 100 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,0).

Wszystkie testy enzymatyczne zostały określone w trzech powtórzeniach, a wyniki porównano z wynikami grupy kontrolnej, które ustalono na 100.

2.8. Ocena mitochondrialna

Oddychanie mitochondrialne i produkcję mitochondrialnego H2O2 badano in situ we włóknach permeabilizowanych saponinami przy użyciu białego mięśnia brzuchatego łydki i mięśni płaszczkowatych|1]. W skrócie, włókna rozdzielono pod mikroskopem dwuokularowym w roztworze A w 4 stopniach (w mM:2,77 CaK2 EGTA,7,23 K, EGTA,6,56 MgCl2, 20tauryny,00,5 DTT,5{ {50}} K-metanosulfoniany, 20 imidazoli, 5,7 Na2 ATP i 15 fosforan kreatyny, pH 7,1) i permeabilizowane w roztworze A z 50 μg·ml-Iof saponiny przez 30 min w 4 stopniach. Mitochondrialną funkcję oddechową określano w oksymetrze wyposażonym w elektrodę typu Clarka (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Komorę napełniono 1 ml Roztworu B (w mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 tauryny, 0,5 DTT, 50 K-metanosulfonianów i 20 imidazoli, pH 7,1) i po rejestracji Wyjściowa zawartość tlenu w komorze, jeden pakiet 1-2 mg suchej masy permeabilizowanych włókien mięśniowych umieszczono w komorze, którą następnie szczelnie zamknięto. Po odczytach podstawowych dodano kolejno: palmitoilokarnitynę i jabłczan 160 μM∶5 mM）, glutaminian （10 mM）, bursztynian （25 mM）, rotenon （0,5 μm）, CCCP rozprzęgający 1 μM）, antymycyna -A ~8 uM' oraz dichlorowodorek i askorbinian N,N',N'-tetrametylo-p-fenylenodiaminy (0,9:9 mM). Oddychanie mierzono w 23 stopniach przy ciągłym mieszaniu. Na koniec każdego testu włókna ostrożnie usuwano z celi ksylograficznej, osuszano i suszono przez co najmniej 24 godziny w ~80°C w celu określenia masy włókien. Szybkości zużycia O2 (JO2) wyrażono w nmol O2 min-1.(mg suchej masy)-I. Wszystkie pomiary wykonano co najmniej w dwóch powtórzeniach.

Uwalnianie netto H2O2 przez oddychające mitochondria mierzono w permeabilizowanych wiązkach włókien za pomocą sondy fluorescencyjnej Amplex Red（20 μM∶emisja wzbudzenia∶563-587nm）, jak opisano wcześniej [32]. Po przygotowaniu przepuszczalnych włókien próbki

przeznaczone do pomiarów H2O2 płukano trzykrotnie w buforze Z(w mM:110K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O i 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH 7,3 przy 4 stopniach). Wiązki włókien ({{20}}.3-1,0 mg suchej masy) inkubowano w temperaturze 37 stopni w mikrokuwecie kwarcowej z ciągłym mieszaniem magnetycznym w 600 µl buforu Z (pH 7,3 w 37C) z dodatkiem 1,2 U·mL-I peroksydazy chrzanowej. Wyjściowe odczyty fluorescencji wykonano przy braku jakichkolwiek egzogennych substratów oddechowych. Następnie wprowadzono kolejno następujące dodatki: glutaminian (5 mM), bursztynian (5 mM), rotenon (0,5 mM), ADP (10 mM) i antymycyna-A (8 μM). ostrożnie wyjęte z kuwety, osuszone i wysuszone w celu określenia masy włókna. Szybkości wytwarzania H2O2 wyrażono w AU·min-1.(mg suchej masy)-I i pojemności na oxphos, co odpowiadało maksymalnemu oddychaniu mitochondrialnemu w stanie fosforylacji. Wszystkie pomiary wykonano co najmniej w dwóch powtórzeniach.

Mitochondrialną zdolność retencji wapnia (CRC) oceniano w białych włóknach widma mięśnia brzuchatego łydki, jak opisano wcześniej [33]. W skrócie, włókna inkubowano w mikrokuwecie kwarcowej z ciągłym mieszaniem w 600 μl buforu CRC （w mM∶250 sacharozy, 10 MOPS, 0,005 EGTA i 10P;-Tris, pH 7,3). Włókna poddano następnie działaniu pojedynczego impulsu 20 nM Ca2 plus. Zmiany pozamitochondrialnego stężenia wapnia monitorowano fluorometrycznie przy użyciu zieleni wapniowej 5N(1 mM: wzbudzenie-emisja: 505-535 nm). Podatność na przenikanie porów przejściowych (PTP) oceniano mierząc czas wymagany do otwarcia PTP, a CRC przyjęto jako całkowitą ilość Ca' nagromadzonego przez mitochondria przed jego uwolnieniem. Na koniec każdego testu włókna ostrożnie usuwano z kuwety, osuszano i suszono w celu określenia masy włókien. Wartości CRC wyrażono w nM Ca2 plus na mg suchej masy.

2.9. Analiza Western Blot

Białka z białego mięśnia brzuchatego łydki i płaszczkowatego rozcieńczono w buforze Laemmli i rozdzielono na 10procentowym prefabrykowanym żelu poliakrylamidowym Mini-PROTEAN TGX Stain-Free (Biorad); na każdy żel załadowano wzorzec wewnętrzny. Rozdział elektroforetyczny przeprowadzono przy 200 V przez 35 min w buforze migracyjnym (25 mM TrisBase, 0,2 M glicyna i 1% SDS (p/v)). Technologia Stain-Free (SF) zawiera zastrzeżony związek tri-halo, który reaguje z białkami, dzięki czemu są wykrywalne przez ekspozycję na promieniowanie UV. Obrazowanie SF przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ChemiDoc MP Imager i Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, Kalifornia, USA) z 5-min czasem aktywacji barwienia, a zatem uwidoczniono wzory całkowitego białka. Białka przeniesiono następnie na arkusz nitrocelulozowy 0,2 µm przy użyciu systemu Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Jakość transferu kontrolowano poprzez obrazowanie membran przy użyciu technologii SF. Po etapie przenoszenia białka karbonylowe derywatyzowano dinitrofenylohydrazyną rozcieńczoną 2N HCl i na koniec intensywnie przemywano metanolem. Membrany zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku w buforze Tris zawierającym Tween-20 (TBST:15 mM Tris/HCl, pH 7,6,140 mM NaCl i 0,05% Tween-20) dla 1 godz. w temperaturze pokojowej. Błony następnie inkubowano w temperaturze 4 stopni przez noc lub 2 godziny w temperaturze pokojowej z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: pierwszorzędowe przeciwciało karbonylowe białka (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) i SOD2 (#Ab13533, Abcam). Po trzech 10-minutowych płukaniach w TBST, membrany sondowano przeciwciałami drugorzędowymi pod kątem karbonylku białka (koniugat HRP;#STA-308, Cell Biolabs) i SOD2 (anty-królicze połączone IgG-HRP;#7074, Cell Signalling) w roztworze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i na koniec obficie przemyto TBST. Rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zoptymalizowano dla każdego przeciwciała. Detekcję chemiluminescencji prowadzono za pomocą ECL Clarity (Biorad), a przechwytywanie obrazów za pomocą ChemiDocMP. Wszystkie obrazy analizowano przy użyciu oprogramowania Image Lab 4.0.1. Normalizację intensywności sygnału białkowego przeprowadzono po oznaczeniu ilościowym odpowiednich poziomów białka całkowitego na obrazach SF, kontroli próbki i wzorcach wewnętrznych.

2.10. Pomiar NAD

Całkowite poziomy NAD i NADH mierzono w homogenizowanym białym mięśniu brzuchatym łydki przy użyciu komercyjnego zestawu (#K337-100, Biovision, USA) i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, wyekstrahowano całkowitą pulę NAD (NADt= NADt i NADH). Dla każdej z wyekstrahowanych próbek połowę próbki ogrzewano do 60 stopni przez 30 minut w celu rozłożenia NADt przy jednoczesnym zachowaniu NADH w stanie nienaruszonym. Obie próbki NADt i NADH zmieszano z cyklicznym enzymem NAD i zmierzono absorbancję przy 450 nm. NADt i NADH oznaczono ilościowo przez porównanie z krzywą standardową NADH i normalizację do mg białka. Na koniec obliczono stosunek NAD plus (NADt-NADH) do NADH. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

2.11. Statystyka

Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Normalność danych oceniano za pomocą testu normalności D'Agostino-Pearsona. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu testu t-Studenta i dwukierunkowej ANOVA (grupa i czas) dla powtarzanych pomiarów, a następnie testu post hoc Bonferroniego z użyciem Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Zastosowano dwustronny poziom 5 procent dla błędu typu I.

3. Wyniki

3.1. Skład ciała i metabolizm całego ciała

Piętnaście dni suplementacji CF u myszy typu dzikiego (WT) nie zmieniło masy ciała (p=0.091), masy beztłuszczowej (p=0.{{24} }73) i masa tkanki tłuszczowej oceniona za pomocą EchoMRI (p=0,89; Ryc. 1A). Wskaźniki zużycia O2 wyrażone na beztłuszczową masę ciała były znacznie wyższe w cyklu ciemnym (8±8 procent, p=0.042), podczas gdy pozostały podobne w cyklu jasnym (p =0 0,392; Rysunek 1B.). Nie było żadnych zmian w aktywności lokomotorycznej (dane nie pokazane). Myszy CF wykazywały znaczny wzrost wydatku energetycznego całego ciała o 15±15 procent (p =0.042; Ryc. 1C) i spożycie pokarmu (0,08±0,01 vs.0,11±0,01 g na beztłuszczową masę ciała, odpowiednio dla grupy CF i WT, p=00,013, Rysunek 1D).

Suplementacja mukowiscydozy znacząco zmodyfikowała metabolizm całego ciała: główny efekt wyższego RER w grupie CF zaobserwowano w ciągu 24 godzin (p=0.023, Ryc. 2A), a średni RER w ciągu 12 godzin był wyższy w grupie CF w cyklach światła i ciemności (odpowiednio plus 5±3 procent, p=0.035 i plus 9±4 procent , p=00,026). Co więcej, suplementacja CF promowała wykorzystanie węglowodanów (CHO) (51 ± 13 procent zużycia energii zależało od utleniania CHO w grupie CF w porównaniu do 37 ± 12 procent w grupie kontrolnej podczas cyklu lekkiego, p=0,108 i 71±21 procent w grupie CF w porównaniu do 47±24 procent w grupie kontrolnej podczas cyklu ciemnego, p=0.004; Ryc. 2B.). Jednakże, gdy wyrażono je w kJ, nie było różnicy w utlenianiu CHO ani utlenianiu kwasów tłuszczowych (oksydacja CHO: 3,7±1,4 kcal·d-1 w kontroli vs. 4,4±1,7 kcal. beztłuszczowa masa ciała-1). d-1 w CF,p=0.33 i utlenianiu kwasów tłuszczowych: 2,3±1,0 kcal·d-Iw kontroli vs.2,6±0,87 kcal.beztłuszczowa masa ciała-1.d{{ 50}}w CF,p=0.608). Analiza PRCF RER wykazała wzrost wartości EC50 w grupie CF (p=0,009; Ryc. 2D), co oznacza, że ​​CF wywołuje przesunięcie w kierunku większego wykorzystania węglowodanów. Spadek nachylenia wzgórza zaobserwowano w grupie CF (wartości H: 25,16±4,44 w grupie kontrolnej vs.12,79±3,96 w grupie CF, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Bioenergetyka mitochondrialna

Przetestowaliśmy wpływ suplementacji CF na energetykę mitochondriów w białym mięśniu brzuchatym łydki i płaszczkowatym u myszy WT. Zaobserwowano wyższe oddychanie mitochondrialne przy użyciu złożonych substratów IV w mięśniu brzuchatym łydki i płaszczkowatym (odpowiednio p=0.004 i p=00,028; Ryc. 3A, B). Nie zaobserwowano żadnych modyfikacji współczynników oddychania CII/CI i CIV/CI (p =0,899 i p =0,701 dla białego brzuchatego łydki oraz p=0,693 i p{{ 11}}.912 odpowiednio dla mięśni płaszczkowatych, dane nie pokazane). Co więcej, aktywność syntazy kompleksu, I, IV i cytrynianu była znacząco zwiększona w mięśniu brzuchatym łydki białego (odpowiednio: plus 31 ± 27 procent p=00,004; plus 28 ± 38 procent p{19}} 0,027; plus 35±38 procent p= 00,009; plus 14±13 procent p{=00,040; ryc. 3C). Zdolność mitochondriów do utleniania palmitoilo-karnityny wzrasta biały mięsień brzuchaty łydki (plus 24±12 procent ,p =00,096; ryc. 3D), podczas gdy nie zaobserwowano żadnej różnicy w płaszczkowatym (p =0.363). Względne szybkości oddychania stymulowanego palmitoilo-karnityną nie zmieniły się, gdy wyrażono je w funkcji oddychania kompleksu I (62±11 w grupie kontrolnej vs.64±20 w grupie CF z białym brzuchem łydkim i 70±18 vs.72±16). w płaszczkowatym). Następnie zbadaliśmy wrażliwość na otwarcie PTP indukowane Ca plus w białym mięśniu brzuchatym łydki. Jak pokazano na Rysunku 3E, ani czas do otwarcia PTP, ani zdolność retencji Ca² nie uległy zmianie po suplementacji CF (odpowiednio p=0.608 i p=0.943).

Ocena mRNA genów biorących udział w biogenezie mitochondriów wykazała 70-procentową regulację w górę mRNA NRF1, podczas gdy nie odnotowano różnicy dla PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa i Cox2 (Tabela 3). Na kilku próbkach zbadaliśmy wpływ suplementacji CF na superkompleksy mitochondrialne (Rysunek S1, Materiały uzupełniające). Analiza densytometryczna sugeruje, że suplementacja CF zwiększyła ogólną zawartość superkompleksów bez jakościowej adaptacji lub rearanżacji. Rzeczywiście, gęstość oddechowa została poprawiona o 58 procent przy użyciu sond Complex I i ComplexⅡ oraz o 93 procent przy użyciu sondy Complex I. Podobnie zawartość kompleksu I i kompleksu III zawarta w superkompleksach była wyższa w grupie CF.

Suplementacja CF obniża mitochondrialną emisję ROS. Podczas gdy emisja H2O2 pozostała niezmieniona zarówno w białym mięśniu brzuchatym łydki, jak i płaszczkowatym w przeliczeniu na suchą masę (odpowiednio Figura 4A, B), szybkości były zmniejszone w przypadku wyrażenia na zawartość mitochondriów (Figura 4C). Główny pozytywny efekt suplementacji CF zaobserwowano w różnych warunkach w mięśniu brzuchatym łydki białego (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Markery stresu oksydacyjnego w mięśniach szkieletowych

Suplementacja CF nie miała wpływu na poziom stresu oksydacyjnego białka komórkowego u myszy WT, ponieważ zawartość SOD2 w komórkach była podobna w grupie doświadczalnej i kontrolnej w białym mięśniu brzuchatym łydki i płaszczkowatym (Figura 4E). Co więcej, nie zaobserwowano różnicy w karbonylacji białka w białym mięśniu brzuchatym łydki i płaszczkowatym (Figura 4F). Dodatkowo, nie zaobserwowano różnicy w ekspresji katalazy i mRNA MnSod po suplementacji CF (Tabela 3).

3.4. Metabolizm NAD

Całkowita pula nukleotydów pirydynowych wzrosła po suplementacji CF o 36±33 procent (p=0.012). W szczególności zawartość NAD i NADH wzrosła w białym brzuchu łydki (odpowiednio o 69±60 procent, p{{6 }}0,026 i 29±42 procent,p=00,017;Rycina 5A,B)oraz stosunek NAD plus /NADH wykazywał tendencję do wzrostu w grupie CF (p =00,084). istotny wpływ zaobserwowano dla mRNA Sirt3 (p=00,096), mRNA NMNAT (p=00,094) i mRNA Sirt1 (p =0.869; Tabela 3 ).

3.5. Odpowiedź metabolizmu całego ciała i komórki po suplementacji CF u myszy Sirt3-/

Zbadaliśmy wpływ suplementacji CF u myszy Sirt{{0}}. Skład ciała jako waga, masa beztłuszczowa i masa tłuszczowa nie różniły się między grupami z mukowiscydozą i grupą kontrolną (odpowiednio p= 0.52,p=0.66,p=0.45;; Rycina 6A). Podobnie na dzienny wydatek energetyczny nie miała wpływu suplementacja CF ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal. masa-1.dzień-1 w grupie kontrolnej vs. 0.39 ± 0.01 Kcal·beztłuszczowa masa ciała-1.dzień-1 w CF, p=0.502; Rysunek 6B). RER był podobny między obiema grupami w cyklach światła i ciemności (p=0.301; Rysunek 6C), a suplementacja CF nie miała wpływu na utlenianie substratu (44 ± 17% zużycia energii zależało od utleniania CHO w grupa kontrolna vs. 50 ± 11% w grupie CF podczas fazy światła p=0,209 i 65 ± 19% w grupie kontrolnej vs. 77 ± 21% w grupie CF podczas fazy ciemnej, p=0.395; Rysunek 6D). Elastyczność metaboliczna oceniana na podstawie amplitudy RER w ciągu 24 godzin pozostała podobna w obu grupach (0,19±0,05 w grupie kontrolnej vs.0,20±0,03 w CF,p=00,604), podczas gdy nachylenie PRCF było zmniejszone w grupie CF (Wartości H:17,77±4,38 w grupie kontrolnej vs.12,79±3,93 w CF,p=00,039).

Następnie porównaliśmy wpływ suplementacji CF na aktywność enzymów mitochondrialnych. Suplementacja CF nie zwiększyła aktywności enzymatycznej kompleksu I, I, IV i CS u Sirt3-/myszy, jak zaobserwowano wcześniej w WT (odpowiednio: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 i p=0.791, Ryc. 6E). Większą aktywność enzymatyczną kompleksu i IV zaobserwowano u myszy WT w porównaniu z myszami Sirt3-7 po suplementacji CF ( odpowiednio: p=00,027 i P=00,045

4. Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy integracyjną analizę wpływu spożycia mukowiscydozy. Zaobserwowaliśmy, że przewlekłe przyjmowanie mukowiscydozy poprawiło oddychanie mitochondrialne i zmniejszyło produkcję H2O2, ocenianą w środowisku ich włókien mięśniowych, podczas gdy podatność na otwarcie PTP pozostała niezmieniona. Spożycie CF wzmocniło metabolizm NAD, wspierając udział szlaków sirtuinowych w obserwowanych adaptacjach mitochondrialnych. Zaobserwowaliśmy również modyfikacje metabolizmu całego ciała w kierunku większej zdolności do wykorzystywania węglowodanów jako głównego substratu, co sugeruje, że adaptacje mitochondrialne prawdopodobnie przyczyniły się do obserwowanej adaptacji metabolizmu całego ciała.

4.1.Metabolizm

Podawanie dietetyczne flawanoli kakaowych zostało zidentyfikowane jako skuteczna strategia łagodzenia nietolerancji glukozy, umożliwiająca złagodzenie chorób metabolicznych [34]. Nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi badaniami, które wykazały zwiększoną tolerancję glukozy po spożyciu flawanoli [35,36]. Zaproponowane mechanizmy tego efektu obejmują zwiększenie translokacji GLUT4 w kierunku błony komórkowej, zwiększenie fosforylacji AMPK oraz zwiększenie ekspresji genu UCP-2 w mięśniu szkieletowym [8,37] . Ponadto spożycie mukowiscydozy wiązało się z poprawą wrażliwości na insulinę u ludzi[8]. Po 15 dniach spożywania gorzkiej czekolady u osób zdrowych zaobserwowano spadek homeostazy modelowej oceny wskaźnika insulinooporności przy jednoczesnym wzroście wskaźnika ilościowej kontroli insulinowrażliwości i wskaźnika insulinowrażliwości [8]. Zaobserwowaliśmy również równoczesny wzrost tolerancji glukozy i elastyczności metabolicznej u myszy WT, co odnosi się do zdolności organizmu do przystosowania utleniania paliwa do jego dostępności [38]. Co ciekawe, podczas gdy upośledzona zdolność oksydacyjna mitochondriów i związane z nią utlenianie substratów były związane z opornością na insulinę 39, trening wytrzymałościowy zwiększył zawartość mitochondriów, wrażliwość na insulinę i elastyczność metaboliczną [38]. Dlatego też, obecne wyniki są specyficzne dla suplementacji CF i nie mają na nie wpływu spontaniczna aktywność.

Pozytywny wpływ mukowiscydozy na elastyczność metaboliczną, a także wzrost aktywności kompleksów mitochondrialnych został osłabiony u myszy Sirt3-7, co wskazuje, że pozytywne skutki mukowiscydozy występują przynajmniej częściowo przez Sirt3. Wyniki te potwierdzają wcześniejsze odkrycia i kluczową rolę Sirt3 w regulacji elastyczności metabolicznej [24]. Nasze wyniki sugerują, że zwiększenie funkcji mitochondriów może zwiększyć elastyczność metaboliczną. Jednak oprócz funkcji mitochondriów, jako determinanty elastyczności metabolicznej zidentyfikowano również podstawowy współczynnik oddechowy, szybkość usuwania glukozy, pojemność tkanki tłuszczowej do magazynowania lipidów oraz stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu i należy je rozważyć [40]. Przyszłe badania powinny głębiej ocenić komórkowe determinanty elastyczności metabolicznej, aby pogłębić nasze zrozumienie przyczyn leżących u podstaw zwiększenia elastyczności metabolicznej po suplementacji CF.

Ocena metabolizmu całego ciała wykazała wzrost względnego utleniania CHO po suplementacji CF. Wynik ten kontrastuje z poprzednim badaniem, w którym odnotowano wzrost lipolizy po ostrym spożyciu flawanoli lub dwutygodniowej suplementacji flawan-3-olami u myszy [36]. Poza różnicami w składzie ekstraktu, te sprzeczne ustalenia mogą wynikać z plejotropowego działania NO. Powszechnie przyjmuje się, że przyjmowanie mukowiscydozy stymuluje produkcję lub biodostępność metabolizmu NO [7]. Z jednej strony NO stymuluje transport i wychwyt glukozy w mięśniach szkieletowych. Stymulacja produkcji NO w miotubulach pochodzących z linii komórkowej przez insulinę lub nadtlenek wodoru spowodowała wzrost translokacji GLUT4, który był redukowany przez hamowanie nNOS [41]. Ponadto NO może zwiększać transport glukozy w szlaku niezależnym od insuliny, prowadząc do wzrostu poziomów cyklicznego GMP i AMPK [42], co sprzyja utlenianiu glukozy w mięśniach szkieletowych szczura niezależnie od dostępności i utleniania kwasów tłuszczowych [43]. Z drugiej strony NO promuje utlenianie kwasów tłuszczowych poprzez zmniejszenie poziomu malonylo-CoA poprzez hamowanie karboksylazy acetylo-CoA i aktywację dekarboksylazy malonylo-CoA w mięśniach szkieletowych [44]. Chociaż zaobserwowaliśmy przesunięcie w kierunku niższej względnej proporcji do stosowania kwasu tłuszczowego jako substratu z CF, nie było różnicy w odniesieniu do wartości bezwzględnych wyrażonych w kJ. Sugeruje to, że wzrost wydatku energetycznego obserwowany przy suplementacji CF opiera się na zwiększeniu utleniania glukozy. Dlatego wyniki te potwierdzają pogląd, że spożywanie mukowiscydozy zwiększa wrażliwość na insulinę i promuje utlenianie glukozy bez jednoczesnego wpływu na zdolność utleniania kwasów tłuszczowych. Wyniki te nasuwają pytanie o zasadność stosowania flawanoli kakaowych w kontekście diety wysokotłuszczowej. Przyszłe badania powinny ocenić możliwy szkodliwy wpływ połączenia suplementacji CF z dietą wysokotłuszczową.

4.2.Funkcja mitochondrialna

Wykazano, że podawanie z dietą flawanoli kakaowych poprawia funkcje mitochondriów, w tym (i) oddychanie mitochondrialne i aktywność enzymów łańcucha transportu elektronów; (i) mitochondrialne uwalnianie H2O2, które odzwierciedla wytwarzanie reaktywnych form tlenu w mitochondriach (ROS); oraz (i)mitochondrialna zdolność retencji wapnia, która odzwierciedla podatność na otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondrialnej (mPTP) (przegląd patrz [11]. Nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi badaniami, niemniej jednak nasze badanie było pierwszym, w którym oceniano wpływ Suplementacja CF na funkcję mitochondriów ocenianą in situ w permeabilizowanym włóknie i w różnych typach mięśni.W przeciwieństwie do wcześniejszych badań nad izolowanymi mitochondriami, ocena funkcji mitochondriów w permeabilizowanym włóknie zachowuje morfologię mitochondriów, funkcjonalne interakcje z innymi składnikami wewnątrzkomórkowymi [1] i pozwala uniknąć struktury mitochondriów zakłócenia podczas procesu izolacji mitochondriów [32] Dlatego ważne jest badanie funkcji mitochondriów w preparatach tkankowych, w których struktura mitochondrialna jest zachowana i reprezentowana jest cała pula mitochondriów, aby lepiej ocenić odpowiedź na leczenie.

Wcześniejsze badania przeprowadzone w hodowli komórkowej lub in vivo na myszach wykazały, że suplementacja EPI, która jest uważana za główną bioaktywną cząsteczkę w mukowiscydozie, zwiększa maksymalne oddychanie stymulowane przez ADP (np. oddychanie w stanie 3), gdy mitochondria są zasilane kombinacją energii substraty zasilające różne miejsca w łańcuchu oddechowym [45-49]. Zgodnie z tymi wynikami zaobserwowaliśmy główny wpływ suplementacji CF na oddychanie mitochondrialne w mięśniach oksydacyjnych i glikolitycznych. Aby ustalić, czy ten wzrost jest związany ze wzrostem masy mitochondrialnej, czy z przebudową mitochondrialnych kompleksów oddechowych, zbadaliśmy superkompleksy mitochondrialne z mięśnia czworogłowego. Uważa się, że te supramolekularne struktury zmniejszają produkcję ROS, stabilizują lub pomagają w montażu poszczególnych kompleksów, regulują aktywność łańcucha oddechowego i zapobiegają agregacji białek w bogatej w białka wewnętrznej błonie mitochondrialnej [50-52]. Pomimo ograniczonej liczby pomiarów, wizualna analiza wyników (materiały uzupełniające) sugeruje, że suplementacja CF indukuje wzrost masy mitochondrialnej, co odzwierciedla wzrost wszystkich rodzajów superkompleksów, a nie specyficzne reorganizacje kompleksów łańcucha oddechowego. Podsumowując, wyniki te sugerują, że CF sprzyja wzrostowi masy mitochondrialnej bez jakościowej adaptacji układów złożonych łańcuchów oddechowych.

Podczas oddychania mitochondrialnego powstają zmienne ilości ponadtlenku, które mogą być metabolizowane do innych typów ROS [53]. Chociaż nadmierna produkcja ROS przez mitochondria jest zaangażowana w szerokie spektrum patologii, niskie fizjologiczne stężenia ROS mogą mieć korzystne działanie, takie jak ochrona przed czynnikami zakaźnymi i udział w sygnalizacji komórkowej [2,54]. Wcześniejsze badania przeprowadzone in vivo na gryzoniach i ludziach oraz na modelach kultur komórkowych wykazały korzystny wpływ suplementacji CF na produkcję ROS i różne systemy antyoksydacyjne [11]. Na przykład zgłębnik doustny z EPI przez 15 dni zwiększa aktywność SOD2 i katalazy w mięśniu czworogłowym myszy [17]. Chociaż produkcja ROS w mitochondriach nie została szeroko oceniona, zaobserwowaliśmy, że poziomy produkcji ROS były podobne, gdy wartości były wyrażane na masę mięśnia, podczas gdy produkcja była obniżona w przypadku ekspresji na masę mitochondrialną, co sugeruje, że występują adaptacje jakościowe w celu utrzymania fizjologicznego stężenia ROS. Co więcej, nie zaobserwowaliśmy żadnego wpływu CF na SOD2 ani uszkodzeń wywołanych przez ROS ocenianych przez karbonylację białka. Podczas gdy CF wzmacnia pule białek przeciwutleniających, w tym szeroko opisywane poziomy SOD2 i katalazy [16,17,55], ta adaptacja nie zawsze była związana ze zmniejszeniem uszkodzeń wywołanych przez ROS [56-59]. Dane te potwierdzają teorię, że niski poziom produkcji ROS jest wymagany do prawidłowej homeostazy komórkowej [2]. Podsumowując, wyniki te sugerują, że wraz ze wzrostem masy mitochondrialnej mukowiscydoza promuje jakościowe adaptacje mitochondrialne w celu zwiększenia jego zdolności antyoksydacyjnych i utrzymania niskiego poziomu produkcji ROS.

4.3. Biogeneza mitochondrialna

Masa mitochondrialna jest wynikiem wzajemnego oddziaływania biogenezy mitochondrialnej i mitofagii. Nasze badanie koncentrowało się na biogenezie mitochondriów aktywowanej spożyciem polifenoli [60]. Biogeneza mitochondrialna to proces komórkowy, który poprawia masę mitochondrialną. Ten złożony i wysoce regulowany proces obejmuje kilka czynników transkrypcyjnych, jądrowe receptory hormonów i koaktywatory transkrypcji, które działają wspólnie, koordynując zmiany w ekspresji genów kodowanych w jądrowym i mitochondrialnym DNA [61]. Wcześniejsze badania próbowały określić, które szlaki mogą leżeć u podstaw biogenezy mitochondriów wywołanej suplementacją CF. Stymulacja zależnej od NO sygnalizacji stała się głównym szlakiem zaangażowanym w biogenezę mitochondriów. Suplementacja CF wzmaga wytwarzanie NO poprzez hamowanie enzymu degradującego argininę, arginazy, co zwiększa dostępność L-argininy do biosyntezy NO [62,63]. Ponadto, stosując inhibitor eNOS, częściowo osłabiono stymulujący wpływ epikatechiny na biogenezę mitochondriów [17]. Wyniki te sugerują udział innych szlaków sygnałowych w stymulowaniu biogenezy mitochondriów.

Ostatnio Aragones i in. (2016) stwierdzili, że proantocyjanidyny dietetyczne, członkowie rodziny polifenoli, zwiększają metabolizm NAD plus w wątrobie, wzmacniając de now o szlak biosyntezy NAD plus i aktywność Sirte w sposób zależny od dawki u szczurów [12]. Ponadto wątroba eksportuje prekursory NADt do innych narządów, takich jak mięśnie szkieletowe, które mają mniejszą zdolność do syntezy NAD, co zwiększa możliwość rozszerzenia efektów obserwowanych w wątrobie na cały organizm [64]. Podczas gdy niektóre badania wykazały wpływ suplementacji CF na zawartość białka Sirt1, aktywność lub mRNA [12,15-17,65,66], udział metabolizmu NAD w biogenezie mitochondriów po suplementacji CF z wykorzystaniem utraty lub przyrostu funkcja nigdy nie była testowana. Podczas gdy nokaut specyficzny dla mięśni byłby lepszy niż u myszy Sirt3 KO na całe ciało użytych w naszym badaniu, nasze wyniki sugerują, że CF poprawia metabolizm NAD, a Sirt3 jest zaangażowany w tę indukowaną suplementacją poprawę aktywności mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów. Pozytywne efekty obserwowane na aktywność kompleksów mitochondrialnych po suplementacji CF nie były obserwowane przy użyciu myszy Sirt3-7, a większą aktywność kompleksów I i IV zaobserwowano po suplementacji CF tylko w WT. Obserwacje te stanowią rozszerzenie wcześniejszych prac pokazujących, że Sirt3 odgrywa kluczową rolę w funkcji mitochondriów ]67. Podsumowując, odkrycia te sugerują, że sirtuiny, poprzez modulację metabolizmu NAD, biorą udział w poprawie masy mitochondrialnej obserwowanej po suplementacji CF. 4.4.Limity

Ziarna kakaowe składają się z mieszaniny monomerycznych, oligomerycznych i polimerycznych flawanoli. Wśród flawanoli EPI wydaje się być najbardziej rozpowszechnionym monomerem polifenolowym występującym w produktach kakaowych, stanowiąc do 35% zawartości polifenoli [68]. EPI została uznana za główną bioaktywną cząsteczkę leżącą u podstaw korzyści związanych z suplementacją kakao i czekolady [47,69]. Jednak metabolity EPI (EPIm) mogą brać udział w wywołanych przez EPI efektach biologicznych obserwowanych w badaniach in vivo. EPIm może osiągnąć wyższe stężenia w osoczu niż EPI[70]. Ponadto zaobserwowano duże różnice w EPIm między gatunkami. Rzeczywiście, 80 procent EPIm obecnych u ludzi nie zostało wykrytych u szczurów, podczas gdy podobieństwo między myszami a ludźmi okazało się nieco bardziej korzystne, ponieważ wykryto dwa główne ludzkie metabolity [70]. Użyliśmy wzbogaconego ekstraktu CF zawierającego do pięciu razy więcej EPI niż niesfermentowane ziarna kakaowe[71]. Ponadto zawartość EPI została zmniejszona o 10-20 procent w wyniku fermentacji i zmniejszyła się w sposób zależny od temperatury podczas prażenia [71,72]. Podsumowując, dane te sugerują, że podczas oceny korzyści suplementacji EPI dla zdrowia ludzkiego należy zwracać uwagę jedynie na zawartość EPI, a obecne wyniki należy traktować z ostrożnością przed ekstrapolacją obserwowanych mechanizmów leżących u podstaw ludzi.

5. Wnioski

Codzienna suplementacja CF przez 15 dni prowadzi do poprawy funkcji mitochondriów w mięśniach oksydacyjnych i glikolitycznych. Obecne wyniki sugerują, że wzmożone oddychanie mitochondrialne powoduje wzrost masy mitochondriów przy utrzymaniu komórkowego poziomu produkcji ROS, co sugeruje jakościowe adaptacje w mitochondriach. Równolegle z opisanym wcześniej wpływem komórkowym na metabolizm NO [73], CF moduluje metabolizm NAD, co stymuluje aktywność sirtuin. Sirt3 odgrywa kluczową rolę w adaptacji mitochondriów i elastyczności metabolicznej po suplementacji CF. Ponieważ sirtuiny są ostatnimi celami w patogenezie różnych chorób, takich jak cukrzyca czy astma [74,75l, dalsze badania będą dotyczyć potencjalnego zainteresowania wykorzystaniem mukowiscydozy jako naturalnego aktywatora sirtuin.

Bibliografia

1. Kuzniecow, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analiza funkcji mitochondriów in situ w permeabilizowanych włóknach mięśniowych, tkankach i komórkach. Nat. Prot. 2008, 3, 965-976. [Odn.]

2. Sena, LA; Chandel, NS Fizjologiczne role mitochondrialnych reaktywnych gatunków tlenu. Mol. Cela 2012, 48, 158-167. [Odn.]

3. Wacquier, B.; Combette, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Wzajemne oddziaływanie między wewnątrzkomórkowym Ca2 plus oscylacjami a Ca2 plus stymulowanym metabolizmem mitochondrialnym. Nauka. Rep. 2016, 6, srep19316. [Odn.]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Choroby mitochondrialne: Wkład reakcji stresowych organelli na patologię. Nat. Ks. Mol. Biol. 2018, 19, 77-92. [Odn.]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; V. Wieczorka; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; i in. Dostarczanie i wykorzystanie tlenu w mięśniach w cukrzycy typu 1, od powietrza atmosferycznego do mitochondrialnego łańcucha oddechowego: czy jest krok ograniczający? Opieka diabetologiczna 2020, 43, 209–218. [Odn.]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Od mitochondriów do sarkopenii: Rola zapalenia i implikacja osi RAGE-ligand. Do potęgi. Gerontol. 2021, 146, 111247. [Odsyłacz] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao i czekolada w zdrowiu i chorobie człowieka. Przeciwutleniacz. Sygnał redoks. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Krótkotrwałe podawanie gorzkiej czekolady powoduje znaczny wzrost wrażliwości na insulinę i spadek ciśnienia krwi u osób zdrowych. Jestem. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [Odsyłacz] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberga, JB; Ferri, C. Ciśnienie krwi jest obniżone, a wrażliwość na insulinę zwiększona u osób z nietolerancją glukozy i nadciśnieniem po 15 dniach spożywania gorzkiej czekolady o wysokiej zawartości polifenoli. J. Nutr. 2008, 138, 1671-1676. [Odn.]

10. Ottaviani, JI; Mamo, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Konfiguracja stereochemiczna flawanoli wpływa na poziom i metabolizm flawanoli u ludzi oraz ich aktywność biologiczną in vivo. Wolna Rada. Biol. Med. 2011, 50, 237-244. [Odsyłacz] [PubMed]